CN120209112A 一种可溶的原核重组prl的制备方法

(10)申请公布号CN120209112A(21)申请号202510713536.6(22)申请日2025.05.30(71)申请人南京松天盛科生物科技有限公司地址211104江苏省南京市江宁区吉印大道3118号2号楼8层(72)发明人沈怡侯杰王大松(74)专利代理机构南京权盟知识产权代理事务所(普通合伙)32722专利代理师王晓东C12R1/19(2006.01)(54)发明名称一种可溶的原核重组PRL的制备方法(57)摘要本发明提供一种可溶的原核重组PRL的制备方法，其中，可溶的原核重组PRL是将天然PRL氨基酸序列的第80~88位氨基酸删除获得的，可溶的原核重组PRL的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。该可溶的原核重组PRL的溶解性显著高于天然PRL,且具有更高的抗原效价；该可溶的原核重组PRL的制备方法采用基因工程手段，将可溶的原核重组PRL的编码基因克隆到表达载体，转化宿主细胞进行原核表达，可获得大量可溶的原核重组PRL,21.一种可溶的原核重组PRL,其特征在于，所述可溶的原核重组PRL是将天然PRL氨基酸序列的第80~88位氨基酸删除获得的，所述可溶的原核重组PRL的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种如权利要求1所述的可溶的原核重组PRL的编码基因，其特征在于，所述可溶的原核重组PRL的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种原核重组载体，其特征在于，所述原核重组载体含有如权利要求2所述的可溶的4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的原核重组载体。5.一种可溶的原核重组PRL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.构建可溶的原核重组PRL基因工程菌株，所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株含有如权利要求2所述的原核重组PRL的编码基因；S2.将所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株接种于种子培养基中，进行种子培养；S3.将种子培养后的所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养；S4.加入诱导剂进行诱导得到所述可溶的原核重组PRL。6.根据权利要求5所述的可溶的原核重组PRL的制备方法，其特征在于，所述S1包括以S101.合成所述的可溶的原核重组PRL的编码基因；S102.将所述可溶的原核重组PRL的编码基因克隆至表达载体，得到重组载体；S103.将所述重组载体转入感受态细胞，筛选阳性转化子，得到所述可溶的原核重组7.根据权利要求5所述的可溶的原核重组PRL的制备方法，其特征在于，所述S2具体为：取所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株接种到LB培养基，于25-40℃、80-220rpm的条件下培养8-18h。8.根据权利要求5所述的可溶的原核重组PRL的制备方法，其特征在于，所述S3包括以下步骤：将步骤S2中种子培养得到的菌液以0.1%-8%的接种量转入LB培养基中，于25-40℃、80-9.根据权利要求5所述的可溶的原核重组PRL的制备方法，其特征在于，所述S4包括以下步骤：S401.向S3所得菌液中加入终浓度为0.5-5mM的IPTG;S402.将S401所得菌液于20-30℃、80-220rpm的条件下培养2~10h得到发酵液；S403.离心处理S402所述的发酵液，除去上清液，缓冲液清洗2次，加入平衡液悬浮细S404.对破碎后的细胞进行离心分离，上清用滤膜过滤后，用亲和层析的方法进行纯3一种可溶的原核重组PRL的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种可溶的原核重组PRL的制备方法。背景技术[0002]泌乳素(Prolactin,简称PRL,又叫促乳素或催乳激素)是一种由垂体前叶腺嗜酸细胞分泌的蛋白质激素。主要作用为促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳，还有刺激卵泡LH受体生成等作用。PRL的分泌呈脉冲式波动，有明显的昼夜节律变化。PRL分泌的调节主要是受下丘脑分泌的催乳素释放抑制激素的控制，是唯一在正常生理条件下处于抑制状态的腺垂体激素。促甲状腺激素释放激素、雌激素以及应激、睡眠等因素均可通过不同途径促进素的分泌。婴儿的不断吸吮，刺激垂体前叶分泌催乳素，从而使泌乳可维持数月至数年。目科学界对人体泌乳素的研究越来越多，对其异常引发的疾病的认识也更加深入。[0003]乳腺癌肿瘤细胞中存在广泛的PRL受体表达，并且与肿瘤大小、级别和组织学亚型显著相关。检测癌症患者外周血循环肿瘤细胞对乳腺癌症的诊断、预后评估、治疗方案的选择、转移和复发的预测具有重要作用。PRL等标志物在乳腺癌术后的转移诊断和评估中具映生长发育水平，同时也是提示内分泌疾病、免疫性疾病(如红斑狼疮)、神经系统疾病的重要参数。精确定量检测PRL对临床诊断具有非常重要的意义。高PRL血症的异常表现提示多种疾病发生的可能。PRL的临床检测需要高纯度可溶性PRL免疫动物制备的抗体，或者得到B细胞进行杂交瘤表达PRL单克隆抗体。不管哪种途径，都离不开体外表达制备的可溶性PRL。目前现有技术公开重组原核表达的PRL蛋白多为不溶蛋白，表达完成后需进行包涵体的清发明内容[0004]本发明旨在提供一种可溶的原核重组PRL的制备方法，该可溶的原核重组PRL比天然PRL具有更好的溶解性，且抗原效价更高；该可溶的原核重组PRL的制备方法采用基因工主细胞进行原核表达，可获得大量可溶的原核重组PRL,为临床诊断试剂的开发提供大量原[0005]为了解决上述问题，本发明的一方面提供一种可溶的原核重组PRL,所述可溶的原核重组PRL是删除天然PRL氨基酸序列的第80~88位氨基酸获得的，所述可溶的原核重组PRL的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明对氨基酸序列为SEQIDNO:3所示的天然PRL的氨基酸序列的第80~88位氨基酸进行删除，获得的可溶的原核重组PRL与天然PRL相比具有CN120209112A说明书2/7页4[0008]本发明的另一方面提供一种可溶的原核重组PRL的编码组PRL的编码基因编码上述的可溶的原核重组PRL。核重组PRL的编码基因。所述原核重组载体可以为质粒、λ噬菌体的衍生物或动植物病毒，优选地，所述原核重组载体为质粒。质粒优选为pET28a。[0012]本发明的再一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的原核重组载体。所述宿主细胞可以是大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞中的一种。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。[0013]本发明的再一方面提供一种可溶的原核重组PRL的制备方法，包括以下步骤：株含有上述的原核重组PRL的编码基因；S2.将所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株接种于种子培养基中，进S3.将种子培养后的所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行培养至特定浓度。[0015]本发明利用基因工程方法，先构建出含有可溶的原核重组PRL基因的基因工程菌株，然后对基因工程菌株进行培养并发酵，以实现可溶的原核重组PRL的原核表达，经分离、纯化可获得大量可溶的原核重组PRL,该可溶的原核重组PRL的具有比天然PRL具有更好的溶解性，且其具有更高的抗原效价，可通过该方法大量生产，为临床诊断试剂的开发提供大5量原料，降低生产成本。[0016]优选地，S1包括以下步骤：S103.将所述重组载体转入感受态细胞，筛选阳性转化子，得到所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。[0017]进一步优选地，S1包括以下步骤：所述SEQIDNO:4的序列如下：[0018]所述SEQIDNO:5的序列如下：[0019]S102.将扩增产物与表达载体分别进行EcoRI和XhoI双酶切后，用连接酶进行连接，使所述可溶的原核重组PRL的编码基因克隆至表达载体；的条件下培养8-18h。[0021]进一步优选地，S2具体为：取所述可溶的原核重组PRL基因工程菌株接种到LB培养基，于37℃、200rpm的搅拌条件下培养10h。[0022]优选地，S3包括以下步骤：220rpm的条件下，培养至0D600为0.6-0.8。[0023]进一步优选地，步骤S3包括以下步骤：将S2中种子培养得到的菌液以1%的接种量转入1L的LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下，培养至0D600为0.6-0.8。[0024]优选地，S4包括以下步骤：S401.向S3所得菌液中加入终浓度S402.将S401所得菌液于20-30℃、80-220rpm的条件下培养2~10h得到发酵液；S403.离心处理所述发酵液，除去上清液，缓冲液清洗2次，加入平衡液悬浮细胞，并对细胞进行破碎处理；S404.对破碎后的细胞进行离心分离，上清用滤膜过滤后，用亲和层析的方法进行纯化，得到所述可溶的原核重组PRL。CN120209112A说明书4/7页6[0025]进一步优选地，S4包括以下步骤：S401.向S3所得菌液中加入终浓度为1mM的IPTG;S402.将S401所得菌液于27℃、200rpm的条件下培养5h得到发酵液；S403.8000rpm离心10min处理所述发酵液，除去上清液，加入50mlPBS重悬并清洗沉淀，8000rpm离心10min,弃去上清，重复清洗操作。弃上清后加入50ml平衡液(20mMTris-HC1,300mMNaCl)悬浮细胞，超声破碎(300W,工作3s,休息3s)处理细胞；S404.对破碎后的细胞10000rpm离心20min,取上清用0.45μm滤膜过滤后，用亲和层析的方法进行纯化，得到所述可溶的原核重组PRL。1.天然PRL的第80~88位氨基酸为高疏水区，该区域因缺乏极性基团，易通过疏水相互作用驱动蛋白质分子间聚集，形成不溶性聚集体，本发明对天然PRL的第80~88位氨基酸进行删除，消除了PRL蛋白质的疏水暴露区域，减少了分子间因疏水作用导致的异常聚集倾向，获得的可溶的原核重组PRL比天然PRL有更好的溶解性，且其抗原效价高于天然PRL。[0027]2.本发明利用基因工程方法，先构建出具有可溶的原核重组PRL的编码基因的基因工程菌株，然后对基因工程菌株进行培养并发酵，以实现可溶的原核重组PRL的原核表达，经分离、纯化可获得大量可溶的原核重组PRL,该可溶的原核重组PRL比天然PRL有更好的溶解性，且其抗原效价高于天然PRL,可通过该方法大量生产，为临床诊断试剂的开发提附图说明[0028]图1为本发明实施例2中纯化可溶的原核重组PRL电泳图。具体实施方式[0029]下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。设计可溶的原核重组PRL的编码基因的核苷酸序列，包括以下步骤：以本发明的可溶的原核重组PRL的氨基酸序列为基础，对该序列按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，得到可溶的原核重组PRL的编码基因，可溶的原核重组PRL的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，优化后的可溶的原核重组PRL的编码基因的核苷酸序列如SEQ[0031]所述SEQIDNO.1的序列如下：7GTTGTTCTGTCCCACTATATCCATAACCTGTCCAGCGA[0033]实施例2构建可溶的原核重组PRL基因工程菌株，包括以下步骤：S101.根据如SEQIDNO:2的序列合成可溶的原核重组PRL的编码基因，并通过上游引物、下游引物以所述可溶的原核重组PRL的编码基因为模板扩增所述可溶的原核重组所述SEQIDNO:4的序列如下：5'-GGATCCGAATTCATGCTGCC5'-GTGGTGCTCGAGGCAGTTGTTG[0035]S102.将扩增产物与表达载体分别进行EcoRI和XhoI双酶切后，用连接酶进行连接，将可溶的原核重组PRL的编码基因克隆至表达载体pET28a上，得到重组质粒，记为pET28a-PRL;冰浴30min,将质粒与感受态细胞混合物置于42℃水浴锅中水浴热激90s,再置于冰浴2min,板上，37℃过夜培养得到可溶的原核重组PRL基因工程菌株。S2.可溶的原核重组PRL基因工程菌株种子培养：挑取实施例2中筛选得到的可溶的原核重组PRL基因工程菌株单克隆接种到10ml[0037]S3.可溶的原核重组PRL基因工程菌株转接发酵培养基：将步骤S2中种子培养得到的菌液以1%的接种量转入1L的LB液体培养基中，于37[0038]S4.可溶的原核重组PRL基因工程菌株发酵培养：S401.向步骤S3所得菌液中加入终浓度为1mM的IPTG;S402.将步骤S401所得菌液于27℃、200rpm的条件下培养5h得到发酵液；S403.8000rpm离心10min处理所述发酵液，除去上清液，加入50mlPBS重悬并清洗沉淀，8000rpm离心10min,弃去上清，重复清洗操作。弃上清后加入50ml平衡液(20mMTris-HC1,300mMNaCl)悬浮细胞，超声破碎(300W,工作3s,休息3s)处理细胞；S404.对破碎后的细胞10000rpm离心20min,取上清用0.45μm滤膜过滤后，用亲和8层析的方法进行纯化，得到所述可溶的原核重组PRL,亲和层析的方法具体为：先用平衡液(20mMTris-HC1,300mMNaCl)冲洗平衡镍柱，以5ml/min流速上样；上样完成后用平衡液(20mMTris-HC1,300mMNaCl)冲洗10个柱体积洗去杂蛋白；依次在平衡液中加入终浓度为脱液，7为标准蛋白质分子量。洗脱下的PRL过G25凝胶柱脱盐即得到纯的可溶的原核重组PRL,于-20℃保存。对SEQIDNO:3所示天然PRL的氨基酸序列按照实施例1~3的方法，进行设计表达9.0)清洗三次，纯水清洗两次，10000rpm离心20min取沉淀，加入溶解液(50mMTris、100mM次透析至复性液1(200mMTris、500mMNaCl、5%甘油