CN114594248B 一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统（上海交通大学）

(19)国家知识产权局(12)发明专利(72)发明人余辉杨玉婷曾强moleculesensingbyactivelytunibindingkineticsforultrasebiomarkerdetectione2120379119.审查员李若琳(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所31283ss本发明公开了一种基于外力调控的单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述目标21.一种单分子动态检测方法，其特征在于，其使用外力调控模块来调节目标分子与“检测探针、捕获探针和纳米颗粒”之间的结合与解离，并采用单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述目标分子的动态；其中，所述捕获探针的末端与目标分子的头部互补，所述目标分子的末端与检测探针互补；所述捕获探针或检测探针与所述纳米颗粒形成纳米颗粒复合物；当所述纳米颗粒复合物与目标分子结合后，在所述外力调控模块驱动下被牵引到检测探针或捕获探针附近，与所述捕获探针或检测探针特异性结合，再在所述外力调控模块驱动下被提拉离开所述检测探针或捕获探针；其中，所述外力调控模块包括电场调控、磁力调控和非接触力发生装2.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述电场调控使用双电极或力调控使用电磁铁或永磁体；所述非接触力发生装置包括光镊、声镊、热泳和原子力显微镜所述外力调控模块施加的外力范围在0.01-1000pN。3.如权利要求2所述的单分子动态检测方法，其特征在于，电场调控使用电化学工作4.如权利要求2所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述磁力调控使用镍铬磁铁或磁镊。5.如权利要求2所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述外力调控模块施加的外力范围在20-60pN。6.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述目标分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕获探针和检测探针包括与所述目标分子结合的任意化学物质。7.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述捕获探针和检测探针包括与所述目标分子结合的任意代谢产物。8.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述捕获探针和检测探针包括天然或工程化的抗体、核酸和适配体。9.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述单分子成像系统包括10.如权利要求9所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述SPRi的结构包括物镜耦合型SPRi和棱镜耦合型SPRi;和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光11.如权利要求10所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述物镜耦合型SPRi为物12.如权利要求11所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述物镜耦合型SPRi为全13.如权利要求10所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述SPRi的结构为棱镜耦合型SPRi;和/或，所述纳米颗粒的粒径为50nm~300nm。14.如权利要求13所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为315.如权利要求10所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述棱镜耦合型SPRi为Kretschmann棱镜耦合结构。16.如权利要求1~15任一项所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述捕获探针或检测探针吸附于检测芯片。17.如权利要求16所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述目标分子为核酸时：所述捕获探针末端的12~25个核苷酸与目标分子一端的核苷酸互补，目标分子另一端的核苷酸与检测探针互补；或，所述捕获探针和检测探针其中之一为锁核酸，另一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA,所述纳米颗粒为链霉亲和素包被的纳米颗粒；当所述目标分子为蛋白或小分子时：所述检测探针为与目标分子结合的抗体，所述捕获探针为与所述目标分子牢固结合的抗体。18.如权利要求17所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述目标分子为蛋白或小分子时，所述检测探针为Fc端修饰了生物素的抗目标分子的抗体，所述捕获探针为Fc端生物素功能化的抗体。19.如权利要求18所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述目标分子为蛋白或小分子时，所述捕获探针与目标分子的结合常数k。≥10¹⁰M¹s⁻¹,解离常数kof≤0.0002s¹,解离平衡常数KD≤0.2fM;检测探针与目标分子的结合常数k。n≤5×108M¹s¹,解离常数kof≥0.05s⁻¹;解离平衡常数KD≥1.56pM。20.如权利要求16所述的单分子动态检测方法，其特征在于，(1)所述检测芯片的制备包括以下步骤：在镀有2-3nm铬和47nm金的玻片上，先除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，再将检测腔室或硅基细胞培养板固定在金片表面并制成工作电极；其后，用还原溶液还原巯基修饰的检测探针或捕获探针、脱盐并除去还原溶液，加入钝化剂钝化金片表面，清洗后加入还原后的检测探针或捕获探针并孵育；最后清洗并加入溶液减少非特异性吸附并清洗，即得(2)所述纳米颗粒复合物的制备包括以下步骤：用盐老化法制备核酸包被的纳米金颗粒，即，将纳米金颗粒与巯基还原后的捕获探针用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒，即，将链霉亲和素包被的金纳米颗粒用生物素-亲和素系统制备抗体包被的纳米颗粒，即，将链霉亲和素包被的纳米颗粒与所述(1)和(2)无先后次序。21.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述检测腔室为PDMS腔22.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，在所述盐老化法制备核酸包被的纳米颗粒的步骤中，所述共孵育在梯度氯化钠溶液中进行。23.如权利要求22所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述梯度氯化钠溶液的424.如权利要求23所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述梯度氯化钠溶液每25.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒为金纳米颗粒。26.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，在所述用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒的步骤中，所述生物素功能化检测分子为一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA。27.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，在所述用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒的步骤中，所述共孵育在梯度氯化钠溶液中进行。28.如权利要求27所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述梯度氯化钠溶液的29.如权利要求28所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述梯度氯化钠溶液每30.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述用生物素-亲和素系统制备抗体包被的纳米颗粒为金纳米颗粒和磁纳米颗粒。31.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：(a)将检测芯片置于所述单分子成像系统的观测位置，往检测腔室中加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子；(b)使用所述外力调控模块施加外力，以15-60FPS的帧率采集单分子的成像数据并分析所述目标分子的动态：首先，对纳米颗粒复合物施加吸引力加速目标分子和纳米颗粒复合物的扩散；其后，对纳米颗粒复合物施加斥力；调整目标分子与检测探针或捕获探针之间(c)采集记录SPRi数据，对数据进行差分处理，得到去除背景噪声的单分子成像信息；统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，获得每个分子的结合时间；最后，筛选出特异性结合占主导的结合时间内的事件，进行浓度响应拟合，得到特异性更高的浓度响应曲线。32.如权利要求31所述的单分子动态检测方法，其特征在于，在加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子前，先加入PBS缓冲液或SSC缓冲液或含300mMNaCl的Tris-HCL缓冲液。33.如权利要求32所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述SSC缓冲液为1×或234.如权利要求31所述的单分子动态检测方法，其特征在于，采集单分子的成像数据并分析所述目标分子的动态的帧率为16.7或30FPS。35.如权利要求31所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述结合时间为25-25036.如权利要求31所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-ExpGo1模型拟合而37.如权利要求31所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，施加-0.6v-+1.0v;5当所述外力调控模块施加的外力为磁场力时，使用12vDC、占空比25%、20s的电源驱动磁镊，先对纳米颗粒施加吸引力15min;后对纳米颗粒施加斥力15min。38.如权利要求37所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，施加0.4V-+0.8V的电压。39.如权利要求37所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，先使用正电场，对纳米颗粒施加吸引力5min-20min;后使用负电场，对纳米颗粒施加斥力10-45min。40.如权利要求39所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述正电场为0-0.8V;所述负电场为-0.4-0V。41.如权利要求40所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述正电场为+0.4V,负电场为-0.2V。42.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，(1)所述检测芯片的制备具有以下特征中的一种或多种：所述玻片为BK-4或BK-7玻片；使用洗液与氢焰除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，所述洗液为食人鱼洗液，或酒精和纯水的组合；所述还原溶液为TCEP或DTT;所述钝化剂为巯基聚乙二醇、巯基乙醇，或巯基聚乙二醇甲氧基和巯基聚乙二醇生物素的组合；所述清洗使用PBS;所述减少非特异性吸附使用巯基乙醇或BSA;捕获探针或检测探针与钝化分子的比例为1:100-1:1000;和/或，所述捕获探针或检测探针的浓度为50nM;和/或，所述捕获探针为锁核酸单链。43.如权利要求42所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述还原溶液为5μM的44.如权利要求42所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述钝化剂为1μM巯基聚乙二醇。45.如权利要求42所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述减少非特异性吸附46.如权利要求42所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述锁核酸单链中，锁核酸分子占单链的10~50%。47.如权利要求46所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述锁核酸单链中，锁核酸分子占单链的20%。48.一种检测单分子动态的系统，其特征在于，所述系统包括：(i)如权利要求1~47任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的纳米颗粒复合物；(ii)如权利要求1~47任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的检测探针或捕获探针。49.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述系统还包括如权利要求16~47任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的检测芯片；和/或，如权利要求1~47任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的单分子成像系统和/或所定义的外力调控模块。50.如权利要求48或49所述的系统在检测单分子动态中的应用。6一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统技术领域[0001]本发明属于生物医学检测、处理与分析领域，涉及一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统，用于低丰度蛋白、核酸和生物小分子的检测。背景技术[0002]体外诊断技术(Invitrodiagnosis,IVD)在许多疾病和癌症的早期诊断、预后检测和治疗评估中发挥着重要作用。目前临床中80%以上的疾病诊断都依靠体外诊断技术。传统IVD技术，如酶联免疫吸附(ELISA)的检测限(limitofdetection,LoD)在pM水平(10小分子无法被传统IVD技术检出(J.Am.Chem.Soc.2019,141,1162-1170)。因此开发具有单分子水平(<pM)的超灵敏生物传感器具有重大意义。单分子阵列SiMoA和单分子计数SMC是目前商业化最成功的单分子检测技术，前者是在ELISA原理的基础上，通过纳米孔阵列技术构建超低的反应体系，实现单分子酶促反应荧光信号的数字化检测，其基本原理与数字PCR技术类似(NatureBiotechnology.2010,28,595-599);而后者则是通过将激光聚焦于艾里斑，提高荧光分子的光子产量来实现单分子的计数测量，相当于一台超灵敏的流式分子检子检测技术都存在一定的局限性，导致目前单分子检测技术主要服务于实验室，无法推广到临床IVD中。SiMoA技术的操作流程SMC的检测通量不足，对光学系统和环境稳定性要求严苛，且两项技术的检测时间普遍过久；这是因为目前的单分子检测技术仍然无法突破传统检测的理论极限。在传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)中，检测限依赖于抗体的亲和力以及非特异吸附的抑制处理，同时在终点读出检测(Endpointreadoutassay),这带来了浓度限制(concentrationlimit)和热动力学限制(thermodynamicslimit)两个关键问题，导致其检测灵敏度在pg/mL水平。[0003]动态分析作为一种新型的检测策略，有望突破单分子检测的热动力学限制，实现更灵敏的检测，其原理在于在分子结合的热力学平衡状态下，分子的结合和解离事件仍在持续发生，对过程的持续记录能实现检测信号的放大，最终实现fM水平的检测，优于ELISA技术1000倍。[0004]遗憾的是动态分析尚不具有普适性，这是因为动态分析在免疫检测中需要抗体与抗原能快速结合和解离，利用不断反复的结合解离事件的累计实现信号放大，因此在免疫检测中需要繁琐的流程筛选合适的抗体(弱亲和力，快速结合快速解离),而商用的抗体试剂往往对目标蛋白的亲和力很高，分子虽能快速结合但解离事件发生缓慢，进而导致动态分析免疫检测的耗时过长。基于泊松平衡的单分子识别技术SiMREPS作为一种动态检测技术，在检测亲和力易于调控的核酸检测中实现了15-30分钟的单分子检测，检测限达到了fM水平(NatureBiotechnology,2015,33,7,730-732),但该技术在蛋白检测的应用中受限于复杂的抗体筛选的流程以及不合适抗体导致的较长耗时(>2h)。[0005]随着医疗水平的提升，社会对临床诊断有了更高的要求，如对群众的病毒携带检7测需尽可能的快，传统PCR难以满足快速检测的需求，目前国内外所售卖的诊断试剂盒也基本依赖于对病毒的蛋白识别，检测总时间在15-30分钟以内。当前的单分子检测技术总的检4小时以上，动态检测更是存在固有的检测耗时问题。因此开发一种快速超灵敏的单分子检测技术具有极大的研究意义和实践价值。技术依赖于检测芯片和聚焦成艾里斑的激光光源，其成本较高，不利于临床IVD的运用。其适的亲和力抗体来提升，但复杂的抗体筛选过程导致了该方法不具备普适性。最后，目前所有单分子检测技术都存在检测通量过低的问题，限制了其在临床实践中的推广。发明内容[0007]如背景所述，单分子检测中目前存在两个关键的科学问题急需解决，分别是浓度限制和热动力学限制。浓度限制是由于单分子检测中待检测分子的浓度都低于pM水平，而待检测分子抵达传感器表面在低浓度下耗时更久(远大于60min,ELISA中为最可能低的检测限一般过夜孵育)。此外就是热动力学限制带来的检测极限，对于终点检测来说，其检测结果为读出某一时刻(经孵育后达到热力学平衡态)结合的目标分子。其检测极限可以定义为临界浓度：在该浓度下无论平衡多久都无法检测到一个待检测分子。浓度限制可以通过微流控芯片技术加速目标分子扩散到传感器表面，如SiMoA,但高精度的芯片加工带来的是检测芯片的成本高昂；热动力学的限制SiMREPS技术已经解决了一部分，其动态(过程)的检测能真正的突破热动力学检测的理论极限，灵敏度比ELISA提高1000倍以上，但是受限于抗体筛选不具有普适性，且SiMREPS并未解决浓度限制带来的孵育时间过久的问题。[0008]本发明所要解决的问题是：突破浓度限制和抗体筛选的瓶颈，开发出快速、超灵敏且高通量的一种基于外力调控的单分子动态检测方法。[0009]本发明的第一方面提供了一种单分子动态检测方法，其使用外力调控模块来调节目标分子与检测探针、捕获探针、纳米颗粒之间的结合与解离，并采用单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述待检测分子的动态；[0010]其中，所述捕获探针的末端与目标分子的头部互补，所述目标分子的末端与检测探针互补；所述捕获探针或检测探针与所述纳米颗粒形成纳米颗粒复合物；当所述纳米颗粒复合物与目标分子结合后，在所述外力调控模块驱动下被牵引到检测探针或捕获探针附近，与所述捕获探针或检测探针特异性结合，再在所述外力调控模块驱动下被提拉离开所述检测探针或捕获探针。[0011]本发明中，捕获探针、纳米颗粒、检测探针和目标分子构成了夹心体系。其中检测探针和捕获探针的位置可以互换，不会对检测结果产生本质影响。例如，当捕获探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物时，检测探针结合至检测芯片上；当检测探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物时，捕获探针结合至检测芯片上。[0012]在一些优选的实施例中，所述外力调控模块包括电场调控、磁力调控和非接触力发生装置。[0013]较佳地，所述电场调控使用双电极、三电极电场发生装置例如电化学工作站，工作8电极可选用的材料选自玻碳电极、铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、铅(Pb)、导电玻璃(ITO)和汞(Hg),所述磁力调控使用电磁铁或永磁体例如镍铬磁铁或磁镊，所述非接触力发生装置包[0014]所述外力调控模块施加的外力范围在0.01-1000pN例如20-60pN。[0015]此外，本发明中，捕获探针又称捕获分子；检测探针又称检测分子；目标分子又称待检测分子。这些术语分别可以无差别地使用。[0016]在一些优选的实施例中，所述目标分子包括蛋白和核酸；和/或，所述捕获探针和检测探针包括天然或工程化的抗体、核酸和适配体，或与目标分子结合的任意化学物质或代谢产物。[0017]在一些优选的实施例中，所述单分子成像系统包括SPRi、TIRFM、暗场成像和iSCAT;和/或，所述纳米颗粒的粒径为30nm-5μm,材质选自包括但不限于纳米硅、纳米金、纳米银、聚苯乙烯和包被超顺磁颗粒的二氧化硅磁珠。[0018]较佳地，所述SPRi的结构包括物镜耦合型SPRi和棱镜耦合型SPRi,物镜耦合型SPRi优选物镜式SPRM,例如全内反射显微镜改建的物镜式SPRM,棱镜耦合型SPRi例如Kretschmann棱镜耦合结构；和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光光源；和/或，所述纳米颗粒包括纳米金或磁纳米颗粒。本发明的物镜耦合型SPRi的放大倍数通常为60～100倍。[0019]更佳地，所述SPRi的结构为棱镜耦合型SPRi;和/或，所述纳米颗粒的粒径为50nm~300nm,例如50nm、150nm或300nm。本发明的棱镜耦合型SPRi的放大倍数通常为2～60倍，[0020]在一些优选的实施例中，所述捕获探针或检测探针吸附于检测芯片上。[0021]较佳地，当所述目标分子为核酸时：所述捕获探针末端的12～25个核苷酸与目标分子一端的核苷酸互补，目标分子另一端的核苷酸与检测探针互补；或，所述捕获探针和检测探针其中之一为锁核酸，另一为生物素功能化的目标分子例如一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA,所述纳米颗粒为链霉亲和素包被的纳米颗粒。本发明中，所述核酸可以为单链核酸，例如单链的DNA,RNA包括mRN酶或加热等方法打开双链，使其成为可检测的单链DNA片段。[0022]当所述目标分子为蛋白或多肽或小分子时：所述检测探针为与目标分子结合的抗体，所述捕获探针为与所述目标分子牢固结合的抗体；优选所述检测探针为Fc端修饰了生物素的抗目标分子的抗体，所述捕获探针为Fc端生物素功能化的抗体。其中捕获探针与目标分子的结合常数k₀≥10¹⁰m¹s⁻¹,解离常数k。f≤0.0002s⁻¹,解离平衡常数KD≤0.2fM。检测探针与目标分子的结合常数k。≤5×108M¹s⁻¹,解离常数k。f≥0.05s¹;解离平衡常数KD≥1.56pM;标准情况下的分子结合自由能(standardfreeenergy)≥-12kcal/mol。[0023]生物小分子的化学探针的原理与对miRNA等核酸类目标分子并无本质区别，如对别构转录因子(allosterictranscriptionfactor,aTF)的检测，aTF上存在DNA结合结构域和小分子识别结构域，小分子的结合能够使aTF从特定的DNA序列上解离，通过竞争抑制的相互作用实现对生物小分子的检测。[0024]在一些优选的实施例中，(1)所述检测芯片的制备包括以下步骤：[0025]在镀有2-3nm铬、47nm金的玻片上，先除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，再将9检测腔室例如PDMS腔室或硅基细胞培养板固定在金片表面并制成工作电极；其后，用还原溶液还原巯基修饰的检测探针或捕获探针、脱盐并除去还原溶液，加入钝化剂钝化金片表面，清洗后加入还原后的检测探针或捕获探针并孵育；最后清洗并加入溶液减少非特异性[0026]上述步骤中，检测芯片只吸附检测探针和捕获探针的其中之一。即，当检测芯片吸附有检测探针时，捕获探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物；当检测芯片吸附有捕获探针时，检测探针与纳米颗粒形成纳米颗粒复合物。[0027](2)所述纳米颗粒复合物的制备包括以下步骤：[0028]用盐老化法制备核酸包被的纳米金颗粒，即，将纳米金颗粒与巯基还原后的捕获探针或检测探针共孵育，离心、重悬即得；优选地，所述共孵育在梯度氯化钠溶液例如50~维持盐浓度不变孵育24h;或，[0029]用生物素-亲和素系统制备核酸包被的纳米颗粒例如纳米金颗粒，即，将链霉亲和素包被的金纳米颗粒与生物素功能化检测分子共孵育，离心、重悬即得；所述生物素功能化检测分子例如一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA;优选地，所述共孵育在梯度浓度的氯化钠溶液例如50～500mM中进行；更优选地，每隔4h提高50mM浓度，直至氯化钠浓度达到500mM[0030]用生物素-亲和素系统制备抗体包被的纳米颗粒例如金纳米颗粒和或磁纳米颗粒，即，将链霉亲和素包被的金纳米颗粒与Fc端生物素功能化检测抗体共孵育，离心、重悬即得。[0031]所述(1)和(2)无先后次序。[0032]在一些更优选的实施例中，所述单分子动态检测方法包括以下步骤：[0033](a)将制备好的检测芯片置于所述单分子成像系统的观测位置，往检测腔室中加入所述纳米颗粒复合物和所述目标分子；优选地，在加入所述纳米颗粒复合物和所述目标例如为1×或2×SSC缓冲液。[0034](b)使用所述外力调控模块施加外力，以15-60FPS例如16.7或30FPS的帧率采集单分子的成像数据并分析所述目标分子的动态：首先，对纳米颗粒复合物施加吸引力加速目标分子和纳米颗粒复合物的扩散；其后，对纳米颗粒复合物施加斥力；调整目标分子与检测探针或捕获探针之间的结合时间，所述结合时间为5-500s优选25-250s。[0035]同样地，调整所述结合时间时，只需调整目标分子与检测探针，或目标分子与捕获探针之间的结合时间。调整的目标取决于纳米颗粒复合物上结合的时检测探针还是捕获探[0036](c)采集记录SPRi数据，对数据进行差分处理，得到去除背景噪声的单分子成像信息；统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，获得每个分子的结合时间；最后，筛选出特异性结合占主导的结合时间内的事件，进行浓度响应拟合，得到特异性更高的浓度响应曲线；优选地，所述结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-ExpGo1模型拟合而来，迭代算法为正交距离回归。[0037]在一些更优选的实施例中，当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，施加-0.6v-+1.0v例如-0.4V-+0.8V的电压；较佳地，先使用正电场例如0-0.8V(不含0)优选+0.4V,对纳米颗粒施加吸引力5min-20min;后使用负电场例如-0.4-0V(不含0)优选-0.2V,对纳米颗粒施加斥力10-45min。[0038]本发明中，经研究发现，在金表面施加过大的电压时会发生电化学反应，导致预期之外的实验结果。如在小于-0.6v的电压下，捕获探针与金表面的Au-s键将被还原会巯基-SH。磁场力由电磁铁或永磁体贡献，磁场强度恒定，磁场力大小主要受磁铁与粒子的距离(1-3cm,本发明优选1.5cm)决定。[0039]当所述外力调控模块施加的外力为磁场力时，使用12vDC、占空比25%、20s的电源驱动磁镊，先对纳米颗粒施加吸引力15min;后对纳米颗粒施加斥力15min。[0040]在一些具体的实施例中，(1)所述检测芯片的制备具有以下特征中的一种或多种：所述玻片为BK-4或BK-7玻片；使用洗液与氢焰除去表面颗粒杂质并提升金膜平整度，所述洗液为食人鱼洗液，或酒精和纯水；所述还原溶液为TCEP或DTT例如5μM的TCEP或0.1MDTT;所述钝化剂为巯基聚乙二醇、巯基乙醇，或巯基聚乙二醇甲氧基和巯基聚乙二醇生物素，例如1μM巯基聚乙二醇；所述清洗使用PBS;所述减少非特异性吸附使用巯基乙醇或BSA,例如1μM巯基聚乙二醇；捕获探针或检测探针与钝化分子的比例为1:100-1:1000;和/或，[0041]所述捕获探针或检测探针的浓度例如为50nM;和/或，[0042]所述捕获探针为锁核酸单链，例如锁核酸分子占单链的10～50%优选20%。[0043]本发明的洗液为具有强氧化性，可清洁玻片表面的有机物。其可以为无水乙醇和纯水，也可以为食人鱼洗液。食人鱼洗液制备方法如下：用量筒量取70mL浓硫酸倒进烧杯中，再用量筒量取30mL双氧水，缓慢倒进装有浓硫酸的烧杯中，边倒边用玻棒搅拌。食人鱼洗液能有效清洁玻片表面，有利于后续的探针修饰。[0044]本发明的检测腔为具有抗氧化、抗水性和良好的热稳定性的带孔模具，能较牢固的固定在镀金芯片表面，必要时可以用环氧树脂粘牢。所述检测腔例如PDMS腔室的制备方法是用道康宁SYLGARDDC184,其中A、B胶以10:1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置[0045]由于ssDNA-SH和mEPG-SH等物质的巯基能相互反应变成双硫键-S-S-,本发明的还原溶液目的是还原巯基-SH。考虑到还原溶液对修饰效果的影响，优选为三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐TCEP和二硫苏糖醇DTT,其中后者在运用中需要葡聚糖凝胶柱(比如NAP-25)进行[0047]本发明的第二方面提供一种检测单分子动态的系统，其中所述系统包括：[0048](i)如本发明的第一方面中所定义的纳米颗粒复合物；[0049](ii)如本发明的第一方面中所定义的检测探针或捕获探针。[0050]较佳地，所述系统还包括如本发明的第一方面中所定义的检测芯片；和/或，如本发明的第一方面所定义的单分子成像系统和/或如本发明的第一方面所定义的外力调控模块。[0051]本发明的第三方面提供一种如本发明第二方面所述的系统在检测单分子动态中的应用。[0052]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实[0056]2.通过外力调控解决了动态检测方案中目标分子例如抗体分子不具有普适性的附图说明[0059]图1为基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi平台改建的[0060]图2为基于蒙特卡洛仿真得到的不同外力介导下的结合时间的概率分布：a.有外力下的势垒0.048×K₃T;b.无外力下的势垒0.193×KT。[0064]图6显示了本发明的工作流程和miRNA的浓度响应曲线：a.基于电场力调控下[0066]现有单分子动态分析技术受限于抗体的筛选不能成为一种通用的检测技术去取代终点检测，同时经过复杂设计和筛选的抗体的弱亲和力进一步加剧了浓度限制的问题，案的核心原理在于运用外力去调控与纳米颗粒结合的目标分子与芯片表面的受体结合解能量为0.8×10²¹J,1KgT=4.1操纵分子(manipulatingagent)[0079]a)下方是修饰在芯片表面的捕获探针，是能与目标分子特异性牢固结合的受体探针。芯片表面除了捕获探针外还有钝化分子用来抑制非特异性吸附，两者的比例在1:100-1:1000之间；[0080]b)中间是目标分子(即待检测分子),如低丰度蛋白、核酸和生物小分子。捕获探针和检测探针分别结合于目标分子的不同位点，如捕获探针和检测探针分别结合在多肽的N端(N-terminus)和C端(C-terminus),若目标分子是核酸，则分别结合在5'和3'端。[0081]c)上方采用能与目标分子反复结合解离的探针作为检测探针，检测探针锚定在作为报告分子和操纵分子的纳米颗粒上，通过报告分子实现对信号的放大，并借助外力调控以实现对目标分子的快速超灵敏检测；[0082]d)在构建的夹心体系中，检测探针和捕获探针的位置可以互换，不会对系统产生本质影响。[0083]3)本发明提出的表面等离子共振成像(Surfaceplasmonresonanceimaging,SPRi)技术可分为基于Kretschmann棱镜耦合结构搭建的SPRi,以及油镜耦合结构的物镜式SPRM,其中棱镜型SPRi具有大视野，能高通量的记录目标分子特异性结合解离带来的信号放大，更加适合临床实践中对检测技术的通量需求。为了实现大视野、高通量的单分子动态检测，本发明对光路和检测系统进行了以下优化：[0084]a)选用超辐射发光二极管SLED作为光源，相较于相干性极高的激光光源，SLED光源有着更少的相干条纹，为成像带来了更纯净的背景。[0085]b)选用棱镜耦合实现表面等离子共振SPR,有着比物镜式耦合更大的视野，但其缺点是分辨率不足，因此棱镜型SPRi往往更常用于对大量样品(bulksolutionsample)的检测。本发明通过光源改进和差分的图像处理，极大的提高了图像的信噪比SNR,最终使棱镜型SPRi能实时检测到金纳米颗粒(粒径≥30nm)和磁纳米颗粒(超顺磁颗粒内核，外壳二氧[0086]c)生物分子的相互作用(如核酸杂交和抗原抗体结合)需要在盐溶液中进行，而金纳米颗粒在高盐溶液中极其不稳定。这是由于高盐溶液下，金颗粒的德拜双电层会被压缩，颗粒间的稳定性由此打破，这对本发明所提出的基于外力的动态检测造成了极大干扰。为此，本发明优选了合适的盐浓度用于50nm和150nm的金纳米颗粒的单分子动态检测，在该浓度下，生物分子间的相互作用依然能进行，同时金纳米颗粒也能稳定存在。[0087]d)在开源软件imageJ上对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息，通过手动统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，可以获得每个分子的结合时间，进一步筛选更符合特异性结合的结合寿命的事件进行浓度响应的拟合[0088]4)本发明提出的外力调控的力场发生装置，为了满足高通量的调控和低成本的要外力调控，原本高亲和力的受体-目标分子的结合时间会减少，有别于非特异结合的结合时间(<5s或>300s),能在一定时间内观察到反复的结合解离事件，实现了普适的动态检测(图[0089]5)为了验证仿真结合及外力调控理论，先基于易于设计亲和力的核酸链探针构建了外力调控的单分子动态检测，对25个碱基配对长度的核酸目标分子和检测探针施加-0.4V-+0.8V的电压，通过分子对结合和解离的总事件以及分子结合时间的两者的变化证明外力调控确实能起到调控分子运动及动力学行为的作用(图4的a和b)。[0090]6)本发明基于外力调控的单分子动态检测，涉及到对分子动力学参数的调节，而研究分子相互作用的经典研究工具表面等离子共振SPR,从SPR发展而来的单分子成像系统表面等离子共振成像SPRi不单能离散的观察到单个颗粒的信号，同时还能极好的反映单个分子的结合解离事件，因此基于SPRi构建本发明实例。[0091]7)本发明中为了更好的识别外力调控的分子动力学变化，以及减少非特异性吸附带来的干扰，设置了结合时间窗口来筛选合适的分子结合时间，对特异性结合时间范围的颗粒绘制的浓度响应曲线图证明，5-500s(优选25-250s)范围内的结合时间更倾向于是外力调控下的分子特异性结合所产生。随着时间范围的缩小，特异性会进一步增高，但会损失一部分检测事件，在优选的时间范围25-250s内，线性拟合的拟合优度可以达到0.98(图5的[0092]8)本发明不同于SiMoA和SMC的一大特点是低成本和快速高通量地实现超灵敏检测，SiMoA的检测芯片售价为2000美元，而本技术所用检测芯片总成本在50元人民币内；此外能将检测时间控制在15-30分钟，通过对两种miRNA(hsa-miR-155,hsa-miR-21)的超灵敏检测，证明本技术能在15分钟内实现亚fM水平的检测(图6的a和b)。[0093]9)本发明与SiMREPS不同在于，SiMREPS的目标分析物和探针都是亲和力易于调节通过筛选抗体Fab和FcR来满足动态分析的需求。本发明的外力调控方法能兼容现有的商业试剂，抗体试剂盒所用的检测抗体，与目标分子的结合常数k。≥10¹⁰m¹s⁻¹,解离常数k。f≤0.0002s⁻¹;解离平衡常数KD≤0.2fM;标准情况下的分子结合自由能(standardfreeenergy)≤-25kcal/mol的各种抗体的结合解离进行微调。[0094]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0096]使用表面等离子共振显微镜SPRM进行动态分析检测，联用电化学工作站，利用电化学工作站为检测体系提供电场力。目标核酸与检测探针的碱基互补链长为25basepair的目标核酸的外力调控动态分析核酸检测方法如下：[0097](1)使用基于商业全内反射显微镜(0lympusIX-81)作为检测仪器，选用放大倍数60倍，数值孔径N.A=1.49的物镜，光源为超宽带光源SLED,光源控制电流的强度在140mA,观察视野为512×512pixels(fullfieldofview:33.28×33.28μm²)。采用micromanager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRM的成像信号。Cellsens软件用以控制光路的入射角度。电化学工作站为上海辰华的CHI660e,采用三电极法。[0098](2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片上，依次用用无水乙醇着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后用环氧树脂胶水将自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康宁SYLGARDDC184,A、B胶以10:1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置2h以上，用直径1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金片表面并用导电银胶将导线固定在金表面构成工作电极。其后，用0.1M的二硫苏糖醇DTT溶液(购于上海生工，产品编号A100281)还原捕获探针(巯基修饰的单链核酸)内二硫键1h,之后葡聚糖凝胶柱(比如NAP-25)进行脱盐处理，去除DTT,紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获探针(与目标核酸的互补长度为25bp)的溶液，孵育2h。孵育完成后移去PBS清洗后得到检测芯片。巯基功能化检测探针(与目标核酸的另一端的25bp特异性结合)在50mM的氯化钠NaCl溶液在室温摇床孵育24h,最后离心重悬收集包被检测核酸分子的金纳米颗粒。巯基修饰的检测探针在使用前用DTT溶液还原1h,随后脱盐并除去还原溶液。粒表面已通过盐老化法连接上巯基功能化的25bp检测探针和含有目标核酸的样品溶液1μ[0101](5)完成实验的准备工作后，进行检测，先对颗粒施加向下的吸引力5min,加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力10min,调整分子的结合时间，以16.7FPS的帧率采集记录SPRM数据。之后在开源软件imageJ上对数据进行差分处理(后一帧减前一帧),即可得到去除背景噪声的单分子成像信息，通过手动统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，可以获得每个分子的结合时间，进一步筛选更符合特异性结合的结合寿命的事件进行浓度响应的拟合，可得到拟合优度R²更好的曲线。[0103]实施例1中使用高分辨率的表面等离子共振显微镜SPRM作为单分子成像平台进行基于外力调控的单分子动态检测，对颗粒粒径有着极高的灵敏度，可以看到并区分粒径30-160nm的纳米颗粒，但本发明基于夹心结构进行的单分子动态检测中，没有必要用粒径非常统，使用具有大视野的表面等离子共振成像平台SPRi进行动态分析检测，联用电化学工作站，利用电化学工作站为检测体系提供电场力。目标分子(本实施例中目标分子为核酸，因此又称目标核酸)与检测探针的碱基互补链长为25basepair(以下简称bp,互补链长可以为12～50bp或更长)的目标核酸的外力调控动态分析核酸检测方法如下：[0104](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数2-12倍(优选地用于观测50nm~5μm的金颗粒),数值孔径N.A=0.06-0.40的可变透镜组，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics),光源控制电流的强度在140mA,功率为2mW,观察相机(PhotometricsPrime)记录SPRi的成像信号。电化学工作站为上海辰华的CHI660e,采用三电极法。[0105](2)在镀有3院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，优选地，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30%过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液(制备方法：用量筒倒边用玻棒搅拌。食人鱼洗液能有效清洁玻片表面，有利于后续的探着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后用环氧树脂胶水将自制的聚二甲基硅氧烷PDMS腔室(道康宁SYLGARDDC184,A、B胶以10:1体积比混合，抽真空后在37度烘箱中静置2h以上，用直径1mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金溶液还原捕获探针内二硫键1h,紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获探针(与目标核酸的互补长度为25bp的锁核酸单链，其中锁核酸占整体链段的10-50%,优选醇孵育30min减少非特异吸附；最后1×PBS清洗后得到检测芯片。[0106](3)制备核酸探针包被的金纳米颗粒，优选地，使用生物素-链霉亲和素系统取代经典盐老化法中的金硫键Au-S,使修饰流程更加简便和稳定。将10¹²NPs/mL的链霉亲和素包被金纳米颗粒(Nanopartz,C11-150-TS-PBS-50-1,粒径150nm)与1μM的巯基功能化检测探针(上海生工合成，一端被生物素修饰的单链核酸ssDNA,能与目标核酸互补配对结合，配对钠浓度达到500mM后，维持盐浓度不变在室温摇床孵育24h,最后离心重悬收集包被检测探针的金纳米颗粒。经本发明研究发现，由于核酸链的包被，会使原本不耐盐的金纳米颗粒在[0107](4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,折射率n=1.518),改变入射光角度至69-72度(优选71度),即可产生SPR效应。随着SPR效应进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为150mM的NaCl的柠檬酸钠缓冲液，即1×SSC缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为化学工作站施加电场力。[0108](5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力15min(正电场，优选+0.4V),加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力45min(负电场，优选-0.2V),调节目标分子与探针的结合时间，以16.7FPS的帧率采集记录SPRi数据。[0109](6)对所采集的图像进行处理，包括通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧),得到去除背景噪声的单分子成像信息；通过手动统计同一位置上颗粒结合和解离的信息，可以获得每个分子的结合时间，进一步筛选更符合特异性结合的结合寿命的事件，根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。[0110](7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果，结合解离事件的总数和结合时间(该结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-ExpGo1模型拟合而来，迭代算法为正交距离回归)随外加电压的变化的结果证明外力调控的效果(图4a和b)。[0111]实施例3:[0112]微小核酸miRNA作为肿瘤早筛的一项生物标志物具有广阔的应用前景，本实例选用hsa-miR-29a(miR-29a)作为目标核酸，其与检测探针的碱基互补链长为12bp,其外力调控动态分析核酸快速检测方法如下：[0113](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数60倍，数值孔径N.A=1.49的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics),光源控制电流的强度在140mA,功率为2mW,观察视野为2048×2048pixels(fieldofview:221.2×221.2μm²)。采用micromanager控制CCD相机(Photome学工作站为上海辰华的CHI660e,采用三电极法。[0114](2)在镀有3nm铬，47nm金的BK-7玻片(BK-7玻片购于赛默飞院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30%过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后用环氧树脂胶水将自制的聚二甲基硅径0.2mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金片表面并用导电银胶将导线固定在金表面构成工作电极。其后，用1μM-50μM选的浓度为5μM),紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为10-500nM(优选50nM)的捕获探针(与目标miRNA的互补长度为12bp的锁核酸单链，插入整体链段的10-50%的锁核酸分子，锁核酸比例优选20%)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶液，用1×PBS溶液清洗三遍，再用1μM巯基聚乙二醇孵育30min减少非特异吸附；最后1×PBS清洗后得到检测芯片。[0115](3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidinsystem,BAS)制备核酸包被的金纳米颗粒。将10¹²NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒径50nm)与1μM的生物素功能化检测分子(单链核酸ssDNA)在TE缓冲液中共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测探针的金纳米颗粒。[0116](4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为10¹⁰NPs/mL,流速为5μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品中，形成回路，用于电化学工作站施加电场[0117](5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力5min(正电场，+0.4V),加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-0.2V),调节目标分子与探针的结合时间，以16.7FPS的帧率采集记录SPRi数据。[0118](6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧),得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。[0119](7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果。miR-29a的结合时间分布图可以分特异性吸附和非特异性吸附，通过进一步优化参数可以得到，在25-250s的时间窗口内浓度标准曲线有着较好的线性拟合优度R²=0.98(图5的a),图5的b中虚线代表空白组时检测到的颗粒事件，通过虚线和浓度响应曲线的交点获得样品的检测[0120]实施例4:[0121]为了证明本发明具有快速超灵敏检测核酸的能力，本实例选取两种癌症相关miRNA,hsa-miR-21(miR-21)和hsa-miR-155(miR-155)作为目标核酸，与检测探针的碱基互[0122](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数40倍，数值孔径N.A=0.65的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics),光源控制电流的强度在140mA,功率为2mW,观察视野为2048×2048pixels(fieldofview:1106×1106μ工作站为上海辰华的CHI660e,采用三电极法。院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30%过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板(SARSTEDT,flexiPERM)固定lμM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，优选的浓度为5μM),紧接着在硅基培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为10-500nM(优选50nM)的捕获探针(与目标miRNA的互补长度为12bp的锁核酸单链，插入整体链段的10-50%的锁核酸分子，锁核酸比例优选20%)的溶液，孵育6h。孵育完成后移去溶清洗后得到检测芯片。[0124](3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidinsystem,BAS)制备核酸包被的金纳米颗粒。将10¹²NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒径50nm)与1μM的生物素功能化检测分子(单链核酸ssDNA)在TE缓冲液中共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测探针的金纳米颗粒。[0125](4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的柠后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为10¹⁰NPs/mL,流速为5μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品中，形成回路，用于电化学工作站施加电场[0126](5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力5min(正电场，+0.4V),加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-0.2V),调节目标分子与探针的结合时间，以30FPS的帧率采集记录SPRi数据。[0127](6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧),得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。[0128](7)统计特异性结合时间内的结合解离事件，可以得到两种miRNA的结合解离事件随浓度变化曲线，拟合出标准曲线(standardcurve),并根据空白对照组(blank)的结合解Detection,LoD)。miR-21和miR-155的检测限分别为0.26和0.17fM(图6的a和b),其中，miR-21的R2为0.96,miR-155的R2为0.83。[0130]使用表面等离子共振成像系统SPRi进行基于外力调控的高通量动态分析检测，联用电化学工作站，利用电化学工作站为检测体系提供电场力。对阿兹海默症的生物标志物A[0131](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数10倍，数值孔径N.A=0.25的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics),光源控制电流的强度在140mA,功率为2mW,观察视野为2048×2048pixels(fieldofview:1.33×电化学工作站为上海辰华的CHI660e,采用三电极法。院纳米所通过磁控溅射工艺完成镀膜)上，先用浓硫酸(国药-沪试，53100368)和30%过氧化氢(国药-沪试，80070961)以7:3体积比混合出的食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板lμM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(本发明中，TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，本实施例优选的浓度为5μM),紧接着在硅基培养板与金片构成的检测腔室内加入浓度比例为50:1～500:1(优选100:1)的巯基聚乙二醇甲氧基(HS-mPEG,Mw=500Da)和巯基聚乙二醇生物素(HS-PEG5K-biotin,Mw=3400-15000Da,优选5000、7000Da)孵育4h修饰金表面。之后加入浓度为1mg/mL链霉亲和素孵育1h,接着加入Fc端修饰了生物素的捕获抗体(多克隆抗体clone12F4,特异性结合Aβ1-42的C-terminus,BioLegend,Inc.)溶液，浓度5-50ng/mL(优选10ng/mL)孵育2h。最后用1%BSA封闭30min以减少非特异性吸附。其中，上述每个步骤前先移除上一步骤的原液并用1×PBS溶液清洗三遍。[0133](3)制备检测抗体包被的金纳米颗粒。将10¹²NPs/mL链霉亲和素包被的金纳米颗粒(Nanopartz,C11-50-TS-PBS-50-1,粒径50nm)与500ng/mL-5μg/mL(优选2μg/mL)的Fc端生物素功能化检测抗体(多克隆抗体clone6E10,特异性结合Aβ1-42的N-terminus,BioLegend,Inc.)共孵育30min,最后离心重悬收集包被检测抗体的金纳米颗粒。[0134](4)将检测芯片置于棱镜上观测位置，两者间滴加折射率匹配液(0lympus,F30CC,折射率n=1.518),调节入射光角度至71度，即可产生SPR效应。随着SPR效应的增强，CCD相机收集到的光强急剧下降，光强在SPR角附近达到最低值。检测在SPR角附近进行。通过流体通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的Tris-HCL缓冲液，然后缓慢通入混有μL/min。同时，将对电极和参比电极插入检测样品溶液中，形成回路，通过电化加电场力。[0135](5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力5min(正电场，+0.4V),加速目标蛋白和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-0.2V),调节目标蛋白与检测探针的结合时间，以15-60FPS(优选16.7FPS)的帧率采集记录SPRi数据。[0136](6)对所采集的图像进行处理，通过开源软件imageJ对图像进行差分处理(后一帧减前一帧),得到去除背景噪声的单分子成像信息；手动统计统一位置下颗粒的结合和解离事件，由此获得每个分子结合的寿命；最后根据结合时间筛选出特异性结合的事件。根据颗粒的特异性吸附和非特异性吸附的时间不同，可以区分两者进行分析。[0137](7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果(图7的a)。电场调控下目标多肽的检测限为4.34fg/mL(～1.08fM),可见电场力调节范围较小，对亲和力较强的抗原抗体的结合难以实现满意的调控，后续选用更大的外力对颗粒进行调控。[0138]实施例6:[0139]本实例在实例5的基础上，将电场调控变为磁场调控，通过更大的外力来调节高亲和力抗体与目标蛋白的结合时间，其外力调控的通用动态分析方法如下：[0140](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi改建而来的外力调控下的单分子动态检测平台作为检测仪器，其中光路中所用光学器件均孔径N.A=0.25的透镜，光源为Superlum的超宽带光源SLED(Qphotonics),光源控制电流的强度在140mA,功率为2mW,观察视野为2048×2048pixels(fieldofview:3.325×磁场力用磁镊提供，磁镊为MagnetechCorpora