高考生物复习：专项突破（十）生物工程

Lr第一篇专题突破

z、

V题卜生物工程

课标内容

(1)植物组织培养和植物体细胞杂交技术。

(2)动物细胞培养及干细胞的应用。

(3)动物细胞融合技术和单克隆抗体的制备。

(4)动物体细胞核移植技术。

(5)胚胎工程的理论基础及应用。

(6)重组DNA技术的基本工具。

(7)基因工程的基本操作程序。

(8)DNA的粗提取和鉴定。

(9)DNA片段的扩增及电泳鉴定。

(10)基因工程的应用。

(H)蛋白质工程。

(12)转基因产品的安全性。

(13)关注生殖性克隆与治疗性克隆。

(14)生物武器及其对人类的危害。

梳理核心知识

》建网络

原理/①细胞的全能性、细胞膜的流动性

(

⑥早期胚胎在相同生理环境条件胚细胞'拉物里织埴蓑、植物体细胞杂交技术

下空间位置的转移工程'T关健寺臻美观分化和再分化

砌好鲍②细胞增殖

充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力

一迹塞卜国眇获得新细胞，不形成个体

(

发育良好、形态正常的⑦桑甚

<|

胚或囊胚"（原理卜③动物细胞核的全能性

动物体细I

割

一胞核移植

加快繁殖速度I陞里卜获得克隆动物个.体

,、、'•，无性第拉

动物细］园理卜④细胞膜的流动性

原理与方法步骤［DNA的提取和鉴定］

胞融合区法卜物理法、化学法、生物法

作为喘林的，/备条件一、'

限制酶、⑧DNA连接酶、复位一［操作工具〕给小鼠注射抗原

旦J建固的筛选与获取已免疫的B淋巴细

胞和骨髓瘤细胞

程公⑨基因表达载体的构建

PCRii操作

⑤产生专一抗体的

程序

厂将目的基因导入受体细胞杂交瘤细胞

;目的基因的检测与鉴定乂两次力虎的8的与方法

没甯涉及磷基及补配1对

⑩驷T操作对象］

蛋白质

改造现有蛋白质或制造一工程

结果

种新的蛋白质

》挖教材

选择性必修3P44"旁栏思考题”

1.动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞的原因：胃蛋白酶适于在较强的酸性

条件下发挥作用，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2〜7,4,胃蛋白酶在此环境

|=|：1没有活性。

选择性必修3P48“相关信息”

2.灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病

原体的抗原结构。

选择性必修3P48“正文信息”

3.单克隆抗体制备过程中涉及两次筛选，第一次是利用选择培养基,筛选出杂交

瘤细胞；第二次是克隆化培养和抗体检测,目的是筛选出足够数量的能分泌所需

抗体的杂交瘤细胞。

选择性必修3P54“相关信息”

4.目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也可采用梯度

离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细

胞透明带的情况下去核或使其中的DJ应变性。

选择性必修3P68“小字内容”

5.艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA,还证

明了DNA—可以在同种生物的丕同个体之间转移。

选择性必修3P77“相关信息”—

6.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中

2+

一般要添加MgO引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短

单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核昔酸。

选择性必修3P81“资料卡”

7.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T—DNA(可

转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染的体DNA上。

选择性必修3P90“正文”

8.构建乳腺生物反应器时需要将药用蛋白基因与乳腺史特属表达的基因的启动

子等调控元件重组在一起。

选择性必修3P109“思考・讨论”

9.设计试管婴儿在植入前需要对胚胎进行遗传堂诊断。

》扫易错

L判断有关细胞工程和胚胎工程说法的正误

⑴在脱分化过程中，增大细胞分裂素与生长素含量的比值，可利于根的分化生

长。(X)

(2)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(X)

(3)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。(J)

(4)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。(X)

(5)杂交瘤细胞制备过程中，可用灭活的病毒诱导细胞融合。(J)

(6)植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。(X)

(7)重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。(J)

(8)使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎产生免疫排斥反应。(X)

(9)牛胚胎移植时可用囊胚期滋养层细胞进行性别鉴定。(J)

(10)胚胎移植中，供体和受体相当于双亲中的父本和母本。(X)

2.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误

(l)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(X)

(2)E.co〃DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(X)

(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(J)

(4)将胰岛素基因表达载体导入受体细胞借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因

的受体细胞筛选出来。(♦)

(5)转基因抗虫棉植株的抗虫效果必须通过分子检测进行鉴定。(X)

(6)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(J)

(7)蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。(/)

(8)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。3

》练表达

1.体外进行动物细胞培养时，培养液要定期更换，其目的是

提示以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害

2.胚胎细胞的核移植获得克隆动物的难度小于体细胞核移植，其原因

提示胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易

3.制备的单克隆抗体在临床上不能直接用于人体，还需要对抗体进行人源化，即

对鼠源单克隆抗体进行改造，使其大部分氨基酸序列为人源序列所替代，该过程

的意义是.............................................................

O

提示鼠源单克隆抗体对人而言可能是异种抗原，经人源化后能保留抗体的特异

性，降低其异源性

4.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件

外，还应具有的条件是

(答出两点即可)。

提示对靶细胞具有较高的转化效率；在宿主细胞中不会引起免疫排斥

5.[2021•全国甲卷,38(2)(4)](2)PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、

三步，其中复性的结果是.......................................0

(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指...............................。该技术

目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。

提示(2)延伸两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合(4)一

种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术

6.[2019•全国卷I,38(3)]目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶，而不使

用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________..

O

提示耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会

失活

7.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物，引物的作用

是..................................................................0

提示使DNA聚合酶能够从引物的3,端开始连接脱氧核甘酸

8.PMI基因存在于下图的基因组中，若使用PCR技术扩增时需

酶催化，可选择图中四种引物A、B、C、D中的引物.......，原因.........

O

5,PM，基因3，

=Al=IB

3，IZZ]C

提示耐高温的DNA聚合B、C基因位于此片段的中间部位，耐高温

DNA聚合酶只能从9一3,延伸子链

9.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的

作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过___________

O

提示抗盐基因(或目的基因)将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，

观察该烟草植株的生长状态

10用膀胱生物反应器也能生产干扰素，与乳腺生物反应器相比，其优势是

（答出2点即可）。

提示不受年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效

》悟真题

1.（2022.全国乙卷，38）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中

发挥了重要作用。回答下列问题：

（1）新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT—PCR

法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的

酶是,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据

检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。

（2）为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒

RNA中的来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温

度最低的一步是。

⑶某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗

体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明

（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均

为阳性，说明。

（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异

性蛋白S（具有抗原性）的编码序歹U（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基

因工程技术获得大量蛋白So基因工程的基本操作流程是

答案（1）逆转录酶（或反转录酶）（2）特异性核甘酸序列复性（3）曾感染新冠

病毒，已康复已感染新冠病毒，是患者（4）筛选与获取目的基因一构建基因

表达载体一导入受体细胞一目的基因的检测与鉴定

解析（1）以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆

转录酶（或反转录酶）。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根

据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。（2）为确保PCR扩增获得的是特异

性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠

病毒RNA中的特异性核甘酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性

（90℃以上）一复性（50℃左右）一延伸（72℃左右），其中温度最低的一步是复性。

⑶某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗

体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已经康复；

若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。（4）

基因工程的基本操作流程是：筛选与获取目的基因一构建基因表达载体一将目的

基因导入受体细胞一目的基因的检测与鉴定。

2.（2022.全国甲卷，38）某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间

内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操

作。回答下列问题：

⑴为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是

.。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是

..................................................;精子体外获能可采用化学

诱导法，诱导精子获能的药物是（答出1点即可）。利

用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达

到时才具备与精子受精的能力。

⑵体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的

成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有（答出3点

即可）等。将培养好的良种囊胚保存备用。

⑶请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具

有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是

答案（1）放入一196℃的液氮中保存（或冷冻保存）刚排出的精子必需在雌性生

殖道内发生相应生理变化后才能受精肝素或钙离子载体Mil中期（2）维生

素、氨基酸、核甘酸（3）对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚

胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊

优良性状的后代

解析（1）精液可以放入一196℃的液氮中保存（或冷冻保存），使用前再将精液解

冻离心分离。刚排出的精子必需在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能受精，

故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有培养法和化

学诱导法，化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液

中，用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期（Mil

中期）才能具备与精子受精的能力。（2）进行早期胚胎培养的培养液中，除了无机

盐、激素、血清外，还含有维生素、氨基酸、核甘酸等。（3）要利用保存的囊胚

和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料，获得具有该公羊优良性状的后代，主要

是利用胚胎移植技术，即对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎

移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优

良性状的后代。

微专题1细胞工程与胚胎工程

讲•核心要点

1.植物组织培养的过程原理：植物细胞的全能性

条件：无菌、离体、一定的营养物质、

激素（生长素、细胞分裂素等）

?二国林培年基向

3卓脱然的再理（一阴

'”离体的组愈伤组件胚状体上*

织或细胞/;\\试吕田

渤庖锦利疏彼、克窥则:生产细胞产物利用愈伤

，是一种高度液泡化的呈：i组织，制作人工种子利

;无定形状态的薄壁细胞工用胚状体

提醒①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。

②脱分化阶段不需光，再分化阶段需光。

③生长素/细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，

促进芽的分化、抑制根的形成。

④体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，基因的表达具有

选择性。

2.植物体细胞杂交技术

原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性

;纤维素酶和"诱导物理法：电融合法、离心法

诱导

:果胶酶处理"融合■化学法：PEG融合法、高Ca"-高pH

;去除细胞壁丫.融合法

---------------7/--------------------------------------------------------------------

1/;0克服了区辣杂女不舒。性S

马铃薯马铃小、屋再生.反脱分化M再分化N处

细胞原生质匕但缅廊一»一\一二

岛__-自/正在融杂种

v―"0合的好细卷愈伤a再生d出杂种

番茄番茄是牌细册组织小植株植株

细胞原生质体生”、件JV

：苏星出如雨壁（融合完庆的标志）；

提醒①与再生细胞壁密切相关的细胞器是高尔基体。

②原生质体融合后有多种结果需要筛选。

③从变异角度看，植物体细胞杂交技术属于染色体数目变异，杂种植株的基因型、

染色体和染色体组数目均为原两植物直接相加。

3.动物细胞培养原理：细胞增殖

囱*分化隹底价、境殖，一般具有贴壁生长、;

能力强、更多子塔家;和接触抑制的特点:

工

一

原

动物胚胰蛋白酶处理传

细

代

代

机械方法或胞或离心法收集

胎或幼培

悬

培

养后分瓶培荔”

龄动物液

胰蛋白酶（或胶养

一

组织块原蛋白酶）处理一

提醒①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：

第一次：处理组织，使其分散成单个细胞。

第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。

②避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定

期更换培养液。

③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。

4.单克隆抗体的制备原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖

如激兔授金先产生史2的%林巴绅胞

［给小鼠注射特定抗原）［提取骨髓瘤细胞）

“扩大培养

继叫华I［骨髓盲细胞）

,淋巴细胞I--------）

I----------1--------------------土〉能大蜃增殖，

:-灭活病毒不能分泌扰林

'能分泌招手诱导融合

性执体不能「动物细胞触谷买破了看、

大号理序J性杂交方法的局限，使

•,1、远--缘--杂--交--成--为--可--能----/

未融合细胞、B-B细胞

瘤-瘤细胞］杂交瘤细胞|；

利用选择培，

g无能分，此书,筛选一二二二二二二:

凭3又飞［杂交看细胞）养基筛选；

,克隆化培养▼和抗体检测、

［产生特定抗体的杂交瘤细嗣

［体内培养（小输腔内川体外赢（培养液中））

能港脑说别拢原的

倬克隆抗体），,兜?譬

I----------------.j,,扰原火生将4性结

令，并且可大量制备

提醒2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分

泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。

5.动物体细胞（核移植技术）克隆技术

原理：动物细胞核的全能性

提醒（1）核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原

因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色

体变异。③外界环境可能引起表型改变。

（2）克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受

精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。

6.胚胎移植的操作流程

遗传性状优良和生产能力强的

供体、有健康的体质和正常繁

殖能力的受体

同期发情处理和对供体母畜进

行超数排卵处理仅性腺激景

|配种或进行人工授精|不在原肠胚的■段移植，a为此

时分化住皮氤抄板成功聿很

西篥卜冲卵偷，另外不能立为步植'受籽纤

对胚胎的

收集、检■［检查卜对胚胎进行质量检查上这时胚

胎应发育到桑意胚或囊胚阶段

查、处理

力而TL直接向受体移植或放入-196t

包理卜的液氮中保存

［移植胚胎）

［对受体进行妊娠检查］

7.胚胎分割无性繁殖或克隆

发育良好、形态正常的桑逝胚或囊胚

胚胎分割可增加动物后代的数量，其实质

壁渗尸是动物的无性繁殖或克隆

对囊胚分割时，注意将内细胞团均等分割,

否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发

育。对未知性别的胚胎可以取遨蓑层细胞,

做DNA分析进行性别鉴定

》经典再现t

1.下列有关细胞工程的叙述正确的有④

①将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。

（2021・江苏卷，11D）

②单克隆抗体制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合。（2021.山东

卷，15B）

③植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变

异。（2021•江苏卷，5D）

④经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防。（2021.辽宁卷，3D）

⑤动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。（2021.浙江1月，18B）

⑥胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养。（2020.江苏卷,

23D）

2.下列有关胚胎工程的叙述正确的有①②。

①早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体。（2021.江

苏卷，11B）

②体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理。（2020•山东卷，14B）

③胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。（2020.山东卷，14C）

④胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。（2018•江

苏卷，10C）

⑤利用胚胎分割技术，同卵多胎较同卵双胎成功率更高。（2018•江苏卷，10D）

练•高考重点

1.（2021.福建卷，11）科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术

流程示意图如下。

杂

杂

种

种

细

植

胞

株

下列叙述正确的是（）

A.愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的

B.获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状

C可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生

D.用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体

答案D

解析愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞脱分化形成的，A错误；由于基因的选择性

表达和基因间的互作效应，获得的杂种植株不一定能够表现双亲的优良性状，B

错误；可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合，但不能诱导细胞壁的再生，C

错误；由于植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，故可以用纤维素酶和果胶酶

处理愈伤组织以获得原生质体，D正确。

2.（2022.山东卷，15）如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子,

在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是

抗体1抗体2抗体3

A.双抗可同时与2种抗原结合

B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞

C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原

D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞

答案D

解析根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结

合，A正确；根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白

类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；由于双抗是在两种

不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成的，因此，筛

选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原一抗体检测，从

而实现对双抗的筛选，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的

浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。

3.（2022.河南九师联盟）S蛋白是新冠病毒表面的一种抗原蛋白，能引起机体的特

异性免疫反应。下图是国产腺病毒载体疫苗的生产流程，该疫苗可以有效预防新

冠病毒感染。回答下列问题：

转染到扩增携带s蛋白基

细胞培养、因的非复制型

纯化重组腺病毒

⑴构建重组腺病毒载体基因组需要用到的酶是-培养扩增细

胞时，细胞常出现贴壁生长现象，分瓶前应

⑵腺病毒疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S

蛋白的合成，其过程是_______________________________________________________

（用文字和箭头表示）。

⑶新冠抗体是人体产生的能直接攻击新冠病毒的蛋白质，直接给患者注射抗体

能起到很好的治疗效果。一般可以通过________、细胞培养和蛋白质提取技术制

备单克隆抗体。若要制备针对新冠病毒的单克隆抗体，需要用多次注射

小鼠，之后再从小鼠脾脏中分离出________,与小鼠骨髓瘤细胞共同制备杂交瘤

细胞。要得到满足生产需要的杂交瘤细胞至少需要筛选________次。

答案（1）限制酶和DNA连接酶用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散细胞，并

加入新培养液配成细胞悬液

（2）S蛋白基因楚凌mRNA蒯及S蛋白

（3）（动物）细胞融合S蛋白已免疫的B淋巴细胞2

4.（2022.河北衡水金卷）胚胎干细胞在揭示人与动物的发育机制、药学研究、细胞

替代治疗及基因治疗中有着广阔的应用前景。不同物种、不同胚胎之间存在较大

的差异，不同物种胚胎干细胞的建系方法和培养条件也各不相同，研究人员对阿

尔巴斯白绒绵羊胚胎干细胞的培养条件开展了相关研究。回答下列问题：

⑴通过体内受精获得胚胎干细胞的过程中，应对处于发情期的阿尔巴斯白绒母

绵羊注射促性腺激素，目的是。

选用优质公羊与其交配48〜80h后，从母绵羊的（部位）冲卵回收得到早

期胚胎。

⑵培养羊早期胚胎前先取小鼠的成纤维细胞制备饲养层细胞，在小鼠的成纤维

细胞培养液中加入可将其从培养瓶的瓶壁上分离下来形成单细胞悬液。

将羊早期胚胎置于饲养层细胞上培养的目的是,

羊胚胎干细胞在形态上表现为o

⑶研究人员配制A、B两种胚胎干细胞的培养液时，均添加了lOOIU/mL青霉素

和0.05mg/mL链霉素，加入青霉素和链霉素的目的是

（4）若探究机械法（用口吸管将内细胞团切割成小块）、酶消化法、培养液A、培养

液B对胚胎干细胞传代培养的影响，请补充完整实验组的处理：实验组1：机械

法获取胚胎干细胞+培养液A,实验组2：

实验组3：机械法获取胚胎干细胞+培养液B；实验组4：

答案（1）促进母绵羊排出更多卵细胞（超数排卵），以便获得多枚胚胎输卵管

(2)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)维持胚胎干细胞处于不分化状态体积小、细胞核

大、核仁明显

(3)抑制微生物的生长繁殖，避免培养过程中出现杂菌污染

(4)酶消化法获取胚胎干细胞+培养液A酶消化法获取胚胎干细胞+培养液B

微专题2基因工程(含PCR技术)

讲•核心要点

1.基因工程的基本工具

厂、识别双链DNA分子的特定核甘酸

余制碰卜序列，并切开特定部位两个核昔

内切核K酸之间的磷酸二酯键

产，/'邈卜产生至末端或平末端

席前能将双链DNA片段“缝合”起来,

广、/叱电厂恢复被限制酶切开的磷酸二酯键

^DNAV

连接题前E.coliDNA连接酶：连接黏性末端

国T4DNA连接酶：既能连接黏性末端

也能连接平末端

国科质粒、噬菌体、动植物病毒等

能自我复制：有一个至多个限制

酶切割位点；有特殊的标记基因;

对受体细胞无毒害

提醒①基因工程中的载体B与细胞膜上的载体不同。

②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体

定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。

2.基因工程的四个操作步骤

(1)目的基因的筛选与获取

目的基.通过构建基因文库来获取

因获金卜利用PCR获取和扩增目的基因

提醒①目的基因主要是指编码蛋白质的基因。

②在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。

③当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。

(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建

提醒①启动子、终止子

a.启动子（DNA片段）手起始密码子（位于mRNA上）。

b.终止子（DNA片段）W终止密码子（位于mRNA上）。

②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。

③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启

动子连接到一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。

⑶将目的基因导入受体细胞

细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞

农杆菌转化法、花粉管Ca2+处理法

常用方法显微注射技术

通道法（感受态细胞法）

原核细胞

受体细胞受精卵、体细胞受精卵使用最广泛的是大

肠杆菌

提醒辨析农杆菌转化法中的“两个两次”

①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位；第

二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。

②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导

入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

（4）目的基因的检测与鉴定

检测目的基因是否插入—

/受体细胞染色体DNA上一1方法jPCR案;

夯字匕检测目的基因是否转录—广i焚本」

杰兰不出mRNA

\检测目的基因是否翻译百淑抚原二抚

出蛋白质体杂交

于公声达抗虫或抗病接种实验等

3.PCR技术及应用

（l）PCR技术原理与条件

聚合酶链式反应的缩写，是一种体

匕乂广外迅速扩增DNA片段的技术

I［原理［-DNA半保留复制

;模板DNA、显物、四种脱氧核甘酸、

［条件）一缓冲液（含Mg"）、耐高温的DNA

PCR聚合酶（TagDNA聚合酶）

技术严叽有一段已知目的基因的核甘酸序列，

原理一则少根据这一序列合成引物

与条

件［扩增|_DNA的合成方向总是从子链的5,端

|方面向3,端延伸

'同丽—是一小段RNA或单链DNA,它能与

也四厂DNA母链的一段碱基序列互补配对

画卜短时间内大量扩增目的基因

，.-ADMA用负电荷，向正极力向移利

［产物鉴定卜常心用琼脂糖凝胶电泳法

（2）PCR技术的过程

当温度上升到90七以上时，双链DNA解

聚为单链

5j11111111rrr号

|加热至90~95tt

3f।।।।।।।।।।।-5'5Ziiiiiiiiiii_3'

-浦丽祚彝jso't差看前「而荷

基互补配对与两条单链DNA结合

ILIJJUL'.J!1"5,5,"17,ILLLLLy

引物I引物n

当温度上升到72七左右时，啊DNA聚合酶从弓I

物开始进行互补链的合成（从5'端向3'端延伸）

^।।।।।।।।।।r^।।।।।।।।।।।t：

5引物i引物n

提醒可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序

列。

4.蛋白质工程

(

操从预期的蛋白质功能出发

:蓑曲逊最」作

手'设计预期的蛋白质结构

；基因合成'段

、__________>设

一

计推测应有的氨基酸序列

-

流、I

;改造现有蛋：找到并改变相对应的魄

产

;白质，或制］氧核甘酸序列（基因或

!造一种新的;合成新的基因）

:蛋白质：I

、_________>获得所需要的蛋白质

练•高考重点

1.（2021.辽宁卷,4）下列有关细胞内的DNA及其复制过程的叙述，正确的是（）

A.子链延伸时游离的脱氧核昔酸添加到3,端

B.子链的合成过程不需要引物参与

C.DNA每条链的5,端是羟基末端

D.DNA聚合酶的作用是打开DNA双链

答案A

解析细胞内DNA复制时，子链延伸方向为夕一3、故游离的脱氧核甘酸添加

到3,端，A正确；子链的合成过程需要引物参与，B错误；DNA每条链的夕端

是磷酸基团末端，3,端是羟基末端，C错误；解旋酶的作用是打开DNA双链，D

错误。

2.（2021.湖北卷，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基

因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。

为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量

B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间

D.提高复性的温度

答案D

解析PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA

的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双

链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的

时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误;

在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合,

D正确。

3.(2021.福建卷，21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)

是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员

将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：

(1)根据枣树的MTcDNA的核甘酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩

增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因

位置。选用的引物组合应为O

甲

引物3引物4

5'T----------3,

15'

引物1引物2MTcDNA

A位点B位点

乙启动子

复

I复XhoI

制

制EcoRN\(KpnI

原

原-PstIWpstI

点

点

载体PSmaI载体E

终止子

抗性基因抗性基因

*11

—CTCGAG——GATATC——CTGCAG—

—GAGCTC——CTATAG——GACGTC—

।tt

XhoIEcoRVPstI

1I

—CCCGGG——GGTACC—

—GGGCCC——CCATGG—

♦।t

SmaIKonI

图1

(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于

载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载

体Eo载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。

①选用酶将载体P切开，再用(填“T4DNA或"E.co〃DNA")连

接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P。

②载体P，不具有表达MT基因的和0