单抗载表阿霉素微泡联合超声靶向CSCs治疗多发性骨髓瘤的机制与疗效研究

单抗载表阿霉素微泡联合超声靶向CSCs治疗多发性骨髓瘤的机制与疗效研究一、绪论1.1研究背景与意义多发性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）是一种常见的血液系统恶性肿瘤，在血液系统恶性肿瘤中发病率位居第二，严重威胁人类健康。据世界卫生组织（WHO）数据统计，2022年全球新发多发性骨髓瘤患者约30万例，死亡患者达18.5万例。而在不同国家和地区，其发病及死亡情况存在差异，同年我国新发患者3万例，发病率为2.1人/10万人；死亡患者1.9万例，死亡率为1.3人/10万人。MM起病隐匿，早期症状不明显，随着病情进展，会导致全身多处骨骼发生骨质破坏，引发反复骨折和骨痛，还会累及骨髓、肾脏、免疫系统等，造成严重衰竭，甚至危及生命。目前，MM的治疗手段包括化疗、靶向治疗、免疫治疗以及造血干细胞移植等。然而，尽管这些治疗方法在一定程度上能够缓解病情，但MM仍然无法被彻底治愈，大多数患者最终会面临复发和耐药的问题。复发是MM治疗过程中亟待解决的难题。复发后的MM患者，其病情往往更为复杂和严重，对常规治疗的反应性降低，治疗难度大幅增加。据统计，复发/难治性MM患者的中位生存期明显缩短，生活质量也急剧下降。而MM复发的根源在于肿瘤干细胞（CancerStemCells，CSCs）的存在。CSCs是一群具有自我更新、多向分化潜能和高致瘤性的肿瘤细胞亚群，它们能够抵抗传统的化疗、放疗和靶向治疗，在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着关键作用。因此，靶向CSCs成为提高MM治疗效果、降低复发率的关键策略。传统的治疗方法难以有效清除CSCs，这是因为CSCs具有独特的生物学特性。它们处于相对静止的状态，增殖缓慢，对细胞毒性药物不敏感；同时，CSCs具有高效的DNA损伤修复机制，能够迅速修复治疗过程中产生的DNA损伤；此外，CSCs还能通过多种途径逃逸免疫系统的监视和攻击。所以，开发针对CSCs的新型治疗方法迫在眉睫。近年来，微泡联合超声技术在肿瘤治疗领域展现出了巨大的潜力。微泡作为一种新型的药物载体，具有良好的生物相容性和可修饰性。在超声的作用下，微泡能够发生振动、膨胀和破裂等一系列物理变化，产生空化效应、机械效应和热效应等。这些效应可以增加细胞膜的通透性，促进药物的摄取和释放，实现药物的靶向递送，提高肿瘤组织内的药物浓度，增强治疗效果。同时，超声靶向微泡破坏技术还能够刺激机体的免疫反应，增强免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。单抗具有高度特异性，能够精准识别并结合肿瘤细胞表面的特定抗原，载表阿霉素微泡则能有效携带化疗药物，在超声作用下实现精准释放，二者联合有望显著提升对CSCs的靶向治疗效果。将单抗的载表阿霉素微泡联合超声靶向CSCs应用于MM的治疗，为解决MM复发难题提供了新的思路和方法，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。1.2国内外研究现状1.2.1多发性骨髓瘤治疗现状在多发性骨髓瘤（MM）的治疗领域，国内外均取得了一定进展。国外在新药研发和临床试验方面较为领先，美国国立综合癌症网络（NCCN）指南不断更新MM的治疗方案。如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米、卡非佐米等）和免疫调节剂（来那度胺、泊马度胺等）联合地塞米松的方案，显著改善了MM患者的生存预后，成为国内外一线治疗的重要选择。近年来，新型靶向药物不断涌现。单克隆抗体类药物如达雷妥尤单抗，作为全球首个靶向CD38的单克隆抗体，已被国内外多项权威指南推荐用于新诊断和复发难治MM的治疗。2023年国际骨髓瘤学会（IMS）年会公布的研究显示，达雷妥尤单抗为基础的四药联合治疗方案，在新诊断MM患者的基因组特征分析及预后评估方面有新的发现；其联合其他药物治疗首次复发MM患者，也展现出较好的疗效。国内在MM治疗上紧跟国际步伐，积极参与国际多中心临床试验，同时也开展了许多具有中国特色的研究。例如，针对中国MM患者的特点，优化治疗方案的组合和剂量，提高患者的耐受性和依从性。并且，国内在中医药辅助治疗MM方面进行了探索，研究发现一些中药方剂能够减轻化疗副作用，提高患者生活质量。1.2.2CSCs研究进展肿瘤干细胞（CSCs）的研究是肿瘤领域的热点，国内外学者围绕MM中的CSCs展开了多方面研究。国外研究较早揭示了MM中CSCs的一些生物学特性，如其表面标志物的表达，CD138-、CD34+、CD19+等细胞亚群被认为富集了MM-CSCs，这些细胞具有自我更新、耐药和高致瘤性等特点。在信号通路研究方面，Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等信号通路在MM-CSCs的维持和增殖中发挥关键作用，针对这些信号通路的抑制剂研究也在进行中。国内研究团队则在MM-CSCs的分离鉴定技术上有所创新，建立了更高效、精准的分离方法，为深入研究CSCs的生物学行为奠定基础。同时，通过对MM-CSCs与骨髓微环境相互作用的研究，发现微环境中的细胞因子、细胞外基质等对CSCs的存活和耐药有重要影响。1.2.3微泡载药及超声靶向治疗研究微泡载药及超声靶向治疗在国内外均受到广泛关注。国外在微泡材料研发和超声设备改进上处于前沿。新型的生物可降解微泡材料不断被开发，如脂质微泡、聚合物微泡等，其载药效率和稳定性得到显著提升。超声设备也朝着更精准、可控的方向发展，能够精确调控超声参数，实现对微泡的有效操控和药物的靶向释放。多项临床前研究表明，超声刺激微泡（USMB）联合化疗或放疗，可提高肿瘤治疗效果。在乳腺癌、胰腺癌等肿瘤模型中，USMB联合化疗药物，能增强肿瘤细胞对药物的摄取，提高治疗反应率。国内在该领域也取得了丰硕成果，不仅在微泡载药体系的构建上进行了大量研究，制备出多种载药微泡，如载阿霉素、紫杉醇等化疗药物的微泡；还开展了一系列动物实验和初步的临床研究，验证了微泡联合超声靶向治疗的安全性和有效性。有研究制备载阿霉素的聚合物PLGA微泡，联合超声辐照体外作用于人多发性骨髓瘤细胞株U266，产生明显的细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用。1.2.4研究现状总结与展望目前，MM的治疗虽取得一定进展，但仍面临复发和耐药难题，关键在于难以彻底清除CSCs。现有的针对CSCs的研究多集中在信号通路抑制剂和免疫治疗等传统手段，微泡联合超声靶向治疗应用于MM-CSCs的研究较少，且存在药物靶向递送效率低、对CSCs特异性不足等问题。单抗的载表阿霉素微泡联合超声靶向CSCs治疗MM的研究尚处于探索阶段，国内外相关报道较少。未来，应进一步深入研究MM-CSCs的生物学特性和分子机制，开发更具特异性和高效性的靶向治疗策略；优化微泡载药体系和超声靶向技术，提高药物对CSCs的靶向性和治疗效果；开展更多的临床前和临床试验，验证该联合治疗方法的安全性和有效性，为MM患者提供更有效的治疗手段。1.3研究方法与技术路线1.3.1研究方法实验法：通过体外细胞实验和体内动物实验，探究单抗的载表阿霉素微泡联合超声对多发性骨髓瘤CSCs的治疗效果。在体外，以人多发性骨髓瘤细胞株为研究对象，设置不同实验组，分别给予单抗的载表阿霉素微泡、超声单独处理以及二者联合处理，观察细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学行为变化；在体内，构建多发性骨髓瘤动物模型，将动物随机分组，采用相同的处理方式，监测肿瘤的生长情况、转移情况以及动物的生存周期等指标。文献研究法：广泛查阅国内外关于多发性骨髓瘤、CSCs、微泡载药及超声靶向治疗等方面的文献资料，全面了解该领域的研究现状、发展趋势以及相关理论和技术，为研究提供理论基础和研究思路。通过对PubMed、WebofScience、中国知网等数据库的检索，筛选出与本研究相关的高质量文献，对其进行系统分析和总结，梳理已有研究的成果和不足，从而明确本研究的切入点和创新点。数据分析方法：运用统计学软件（如SPSS、GraphPadPrism等）对实验数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。通过合理的数据分析，准确揭示实验结果之间的差异和相关性，为研究结论的得出提供有力支持。1.3.2技术路线CSCs分选与鉴定：从多发性骨髓瘤患者骨髓样本或细胞株中，利用流式细胞术，依据CSCs表面特异性标志物（如CD138-、CD34+、CD19+等）进行分选。对分选后的细胞进行成球实验，观察其自我更新能力；通过裸鼠移植瘤实验，验证其高致瘤性；运用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹等技术检测干性相关基因（如Oct4、Sox2、Nanog等）和蛋白的表达水平，以鉴定分选细胞是否为CSCs。单抗的载表阿霉素微泡制备与表征：采用乳化-固化法或声振法等方法制备载表阿霉素微泡，通过物理吸附或化学偶联的方式将特异性单抗连接到微泡表面。利用扫描电子显微镜、动态光散射仪等仪器观察微泡的形态、大小、粒径分布以及电位等物理性质；采用高效液相色谱法测定微泡的载药量和包封率；通过体外释放实验，考察微泡在不同条件下（如不同pH值、有无超声刺激）的药物释放特性。体外实验：将分选鉴定后的CSCs分为对照组、单抗处理组、载表阿霉素微泡处理组、超声处理组、单抗联合载表阿霉素微泡处理组、单抗的载表阿霉素微泡联合超声处理组等。采用CCK-8法检测细胞增殖活性，计算细胞存活率；运用流式细胞术检测细胞凋亡率，分析不同处理组对CSCs凋亡的影响；通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，评估处理后CSCs转移能力的变化；利用激光共聚焦显微镜观察微泡在细胞内的摄取情况以及药物的分布情况。体内实验：构建多发性骨髓瘤小鼠模型，将小鼠随机分为上述类似的处理组。通过尾静脉注射的方式给予相应处理，定期测量小鼠肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；在实验终点处，处死小鼠，取出肿瘤组织，进行病理切片分析，观察肿瘤细胞形态、结构变化以及肿瘤组织内药物分布情况；采用免疫组化法检测肿瘤组织中增殖相关蛋白（如Ki-67）、凋亡相关蛋白（如Bax、Bcl-2）等的表达水平，评估治疗效果；检测小鼠血液中的相关指标，如血常规、肝肾功能指标等，评价治疗的安全性。二、相关理论基础2.1多发性骨髓瘤概述多发性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）是一种骨髓中浆细胞异常增生的恶性肿瘤。正常情况下，浆细胞作为人体免疫细胞的一种，能够产生抗体，参与免疫反应。然而，在MM患者体内，浆细胞发生恶变，异常增殖并在骨髓中聚集，形成多发肿瘤病灶。同时，这些恶变的浆细胞会分泌大量单克隆免疫球蛋白，即M蛋白，从而引发一系列临床症状。MM的发病机制较为复杂，目前尚未完全明确，但普遍认为与多种因素相关。免疫系统功能不全可能使机体对异常细胞的监测和清除能力下降，为浆细胞恶变提供了机会；长期接触有毒有害化学物质，如苯、甲醛等，以及遭受电离辐射，可能导致浆细胞基因突变，进而引发恶变；慢性感染史，如幽门螺杆菌感染、EB病毒感染等，可能持续刺激免疫系统，促使浆细胞异常增殖；遗传因素在MM的发病中也起到一定作用，某些基因突变或遗传易感性可能增加个体患MM的风险。MM的临床症状多样，常见的有骨骼疼痛，通常以胸痛和腰背痛最为多见，这是由于肿瘤细胞侵犯骨骼，导致骨质破坏和骨质疏松，严重时可出现病理性骨折；患者还会出现贫血症状，表现为面色苍白、乏力、头晕等，这是因为骨髓中异常浆细胞大量增殖，抑制了正常造血功能，导致红细胞生成减少；高钙血症也是MM的常见症状之一，肿瘤细胞释放的细胞因子会破坏骨质，使骨骼中的钙释放到血液中，引起血钙升高，患者可能出现恶心、呕吐、多尿、口渴等症状；肾功能损伤在MM患者中也较为常见，M蛋白及其轻链可沉积在肾脏，导致肾小管损伤、肾小球硬化等，严重时可发展为肾衰竭。此外，患者还可能出现出血倾向、淀粉样变、反复感染等症状，这与MM对免疫系统和凝血功能的影响密切相关。MM的诊断主要依靠多种检查手段综合判断。血液检查是重要的诊断依据，其中免疫球蛋白定量可检测出M蛋白的含量，血清蛋白电泳能够分离和识别不同类型的蛋白质，免疫固定电泳则可进一步确定M蛋白的类型，血清游离轻链比值异常对MM的诊断也具有重要提示意义；尿液检查同样关键，尿蛋白电泳、免疫固定电泳可检测尿液中的M蛋白和轻链，24小时尿蛋白、尿轻链定量能反映肾脏受损程度；影像学检查在MM诊断中也不可或缺，全身X线可观察骨骼的形态和结构变化，发现骨质破坏和骨折；CT和MRI能更清晰地显示骨骼和软组织的病变情况，对于早期病变的发现具有重要价值；PET-CT则可全面评估肿瘤的分布和代谢活性，有助于判断病情的严重程度和分期；骨髓穿刺活检是确诊MM的金标准，通过抽取骨髓样本，在显微镜下观察浆细胞的形态、数量和比例，以及是否存在异常浆细胞，从而明确诊断。MM在全球范围内的发病情况呈现出一定的差异。在欧美国家，MM的发病率相对较高，约占血液系统恶性肿瘤的10%-15%，且随着年龄的增长，发病率逐渐升高，中位发病年龄约为65岁。而在亚洲国家，MM的发病率相对较低，但近年来随着人口老龄化和环境因素的变化，发病率也呈上升趋势。我国MM的发病率虽低于欧美国家，但由于人口基数大，患者数量也不容小觑。MM严重影响患者的健康和生活质量，多数患者在确诊时已处于疾病中晚期，治疗难度较大。尽管目前的治疗手段在一定程度上能够缓解病情，但MM仍然难以被彻底治愈，患者往往面临着疾病复发和进展的风险，5年生存率相对较低。因此，深入研究MM的发病机制，开发更有效的治疗方法，对于改善患者的预后具有重要意义。2.2癌干细胞（CSCs）特性癌干细胞（CancerStemCells，CSCs），也被称为肿瘤干细胞，是肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞特性的细胞亚群。这一概念最早在1994年由Bonnet和Dick在急性髓系白血病的研究中提出，他们发现只有一小部分表达特定表面标志物的白血病细胞能够在免疫缺陷小鼠体内重建白血病，从而证实了肿瘤中存在具有干细胞样特性的细胞群体。随后，在乳腺癌、脑肿瘤、肺癌等多种实体肿瘤中也陆续发现了CSCs的存在。CSCs具有自我更新能力，这是其最核心的特性之一。它们能够通过对称分裂产生两个相同的CSCs，实现自身数量的扩增；也能通过不对称分裂产生一个CSC和一个分化的肿瘤细胞，维持肿瘤细胞群体的稳定。这种自我更新能力使得CSCs在肿瘤的发生、发展和复发过程中持续发挥作用。在多发性骨髓瘤中，CSCs可以不断自我更新，产生大量的骨髓瘤细胞，导致肿瘤的持续生长和扩散。多向分化潜能也是CSCs的重要特性。CSCs能够分化为多种不同类型的肿瘤细胞，这些分化后的细胞构成了肿瘤的异质性。以多发性骨髓瘤为例，CSCs可以分化为不同亚型的浆细胞，这些浆细胞在形态、功能和生物学行为上存在差异，进而导致肿瘤细胞群体的多样性，增加了治疗的难度。CSCs还具有高致瘤性。少量的CSCs就能够在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤，而大量的普通肿瘤细胞却可能无法致瘤。研究表明，将100个乳腺癌CSCs注射到免疫缺陷小鼠体内，就能够形成肿瘤；而需要注射10万个以上的普通乳腺癌细胞才可能形成肿瘤，这充分体现了CSCs强大的致瘤能力。在多发性骨髓瘤中，CSCs同样具有高致瘤性，是肿瘤形成和发展的关键因素。在多发性骨髓瘤的复发和耐药过程中，CSCs起着关键作用。CSCs处于相对静止的细胞周期状态，增殖缓慢，这使得它们对传统的化疗药物不敏感。化疗药物主要作用于快速增殖的细胞，而CSCs由于增殖缓慢，能够逃避化疗药物的杀伤。同时，CSCs具有高效的DNA损伤修复机制。当受到化疗药物或放疗的损伤时，CSCs能够迅速启动DNA修复程序，修复受损的DNA，从而继续存活和增殖。此外，CSCs还能通过多种途径逃逸免疫系统的监视和攻击。它们可以下调细胞表面的主要组织相容性复合体（MHC）分子表达，减少被免疫系统识别的机会；也能分泌免疫抑制因子，抑制免疫细胞的活性，营造有利于自身生存的免疫微环境。这些特性使得CSCs在多发性骨髓瘤的治疗过程中得以存活和保留，成为肿瘤复发的根源。一旦治疗停止或机体免疫力下降，CSCs就会重新启动增殖和分化程序，导致肿瘤复发。由于CSCs在多发性骨髓瘤的复发和耐药中具有重要作用，靶向CSCs治疗成为提高多发性骨髓瘤治疗效果的关键策略。传统的治疗方法主要针对快速增殖的肿瘤细胞，难以有效清除CSCs，导致肿瘤复发率高。因此，开发能够特异性靶向CSCs的治疗方法迫在眉睫。靶向CSCs治疗可以从多个方面入手，如针对CSCs表面的特异性标志物，开发相应的抗体或小分子抑制剂，阻断CSCs的自我更新和分化信号通路；利用免疫治疗手段，激活免疫系统对CSCs的识别和杀伤能力；或者通过联合治疗，将靶向CSCs的药物与传统化疗药物、放疗等结合，提高治疗效果。通过靶向CSCs治疗，可以更有效地清除肿瘤细胞，降低多发性骨髓瘤的复发率，提高患者的生存率和生活质量。2.3微泡载药系统2.3.1微泡的结构与组成微泡作为一种新型的药物载体，在生物医学领域展现出了巨大的应用潜力。其独特的结构与组成使其具备良好的药物负载和递送能力。微泡通常由膜壳和内部包裹的气体组成，这种结构赋予了微泡独特的物理和化学性质。微泡的膜壳材料种类繁多，常见的有脂质、聚合物、蛋白质和表面活性剂等。脂质是一种常用的膜壳材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性。脂质微泡的膜壳主要由磷脂双分子层构成，这种结构类似于细胞膜，能够有效地保护内部的气体和药物，同时有利于微泡与细胞的相互作用。研究表明，通过调整磷脂的种类和比例，可以调控脂质微泡的稳定性、粒径大小和表面电荷等性质，从而优化其载药性能。例如，使用氢化大豆磷脂制备的脂质微泡，在体外实验中表现出了较高的稳定性和载药效率。聚合物也是一类重要的膜壳材料，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乙二醇（PEG）等。聚合物微泡具有较强的机械强度和稳定性，能够在体内环境中保持完整，减少药物的提前释放。PLGA是一种可生物降解的聚合物，其降解产物对人体无毒副作用，因此在微泡载药系统中得到了广泛应用。通过改变PLGA的分子量和组成比例，可以调节微泡的降解速度和药物释放速率。PEG则常被用于修饰微泡表面，增加微泡的亲水性和血液循环时间，减少微泡被网状内皮系统的摄取。蛋白质类膜壳材料如人血清白蛋白，具有良好的生物相容性和低免疫原性。人血清白蛋白微泡可以通过多种方法制备，如超声乳化法、喷雾干燥法等。这些微泡在体内能够稳定存在，并且可以通过表面修饰实现靶向递送。表面活性剂类膜壳材料能够降低微泡的表面张力，提高微泡的稳定性。常用的表面活性剂有Span、Tween等，它们可以与其他膜壳材料复合使用，进一步优化微泡的性能。微泡内部包裹的气体对其性能也有重要影响。常见的填充气体包括空气、二氧化碳、氧气以及大分子惰性气体如氟烷气体等。空气是最早被用于微泡填充的气体，但由于其分子量较小，弥散度较高，微泡的稳定性较差。随着研究的深入，大分子惰性气体逐渐成为主流的填充气体。以氟烷气体为例，其分子量较大，溶解度和弥散度较低，使得内含氟烷气体的微泡具有直径小、分布均匀、半衰期长等优点，能够在血液循环中保持稳定，为药物的有效递送提供保障。不同的气体对微泡的声学特性也有影响，例如，含氟碳气体的微泡在超声成像中具有更强的回声信号，有利于实现超声成像引导下的药物靶向递送。2.3.2微泡载药原理与优势微泡载药系统的载药原理主要包括吸附、包裹和共价结合等方式。吸附是一种较为简单的载药方式，药物分子通过物理吸附作用附着在微泡的表面或膜壳内。这种方式操作简便，但药物与微泡的结合力相对较弱，容易在血液循环中发生药物泄漏。在一些实验中，将阿霉素通过吸附的方式负载到脂质微泡表面，虽然在短时间内能够实现药物的递送，但在长时间的血液循环过程中，部分药物会从微泡表面脱落，影响治疗效果。包裹则是将药物完全包封在微泡的内部或膜壳中，形成一种类似胶囊的结构。这种载药方式能够有效地保护药物，减少药物在体内的降解和失活，提高药物的稳定性。以载表阿霉素的PLGA微泡为例，表阿霉素被包裹在PLGA微泡的内部，在体外释放实验中，表现出了良好的缓释性能，能够在较长时间内持续释放药物，维持药物在肿瘤组织中的有效浓度。共价结合是通过化学反应将药物分子与微泡表面或膜壳上的活性基团连接起来，形成稳定的化学键。这种载药方式能够使药物与微泡紧密结合，大大提高了药物的负载量和稳定性，减少药物的泄漏。然而，共价结合的制备过程相对复杂，需要精确控制反应条件，以确保药物的活性和微泡的性能不受影响。微泡载药系统具有诸多优势。微泡通常由生物相容性良好的材料制备而成，如脂质、蛋白质等，这些材料在体内不会引起明显的免疫反应和毒性作用，对正常组织和细胞的损伤较小。多项动物实验和临床研究表明，微泡载药系统在体内能够安全地循环和递送药物，不会对机体的重要器官如肝脏、肾脏等造成明显的损害。微泡具有较大的比表面积，能够负载大量的药物分子。通过优化微泡的制备工艺和膜壳材料，可以进一步提高微泡的载药能力。研究发现，采用多层膜结构的微泡，能够显著增加药物的负载量，为高效的药物递送提供了可能。在超声的作用下，微泡能够发生一系列物理变化，如振动、膨胀和破裂等，产生空化效应、机械效应和热效应等。这些效应可以增加细胞膜的通透性，促进药物的摄取和释放，实现药物的靶向递送。将微泡载药系统注射到体内后，通过超声照射肿瘤部位，微泡在肿瘤组织内破裂，释放出药物，从而提高肿瘤组织内的药物浓度，增强治疗效果，减少对正常组织的药物暴露，降低药物的毒副作用。微泡的表面可以进行修饰，连接各种靶向分子，如抗体、配体等，使其能够特异性地识别并结合肿瘤细胞表面的抗原或受体，实现对肿瘤细胞的靶向治疗。将针对多发性骨髓瘤细胞表面特异性抗原的抗体连接到微泡表面，制备成靶向微泡，能够使微泡精准地聚集在多发性骨髓瘤细胞周围，提高药物对肿瘤细胞的杀伤作用，减少对正常细胞的影响。2.4超声靶向治疗原理2.4.1超声靶向微泡破坏技术超声靶向微泡破坏（Ultrasound-TargetedMicrobubbleDestruction，UTMD）技术是一种极具潜力的新型治疗技术，在疾病治疗领域展现出独特的优势。其原理基于超声与微泡的相互作用，通过将携带有治疗药物或生物活性物质的微泡经静脉注射进入血液循环系统，微泡随血流分布到全身各处。当微泡流经病变部位时，对该部位施加特定参数的超声照射，微泡在超声的作用下会发生一系列物理变化。在超声的作用下，微泡会产生共振现象。由于微泡内部为气体，外部为膜壳结构，其弹性和密度与周围组织存在差异，在超声的交变压力场中，微泡会像一个微小的弹簧一样，随着超声频率进行周期性的振动。这种振动使得微泡与周围组织之间产生机械力的作用，对周围组织产生一定的扰动。当超声强度达到一定阈值时，微泡会发生破裂。微泡破裂瞬间，会产生高速微射流和强大的冲击波。这些微射流和冲击波具有较高的能量，可以在局部产生微小的孔洞，增加细胞膜和血管壁的通透性。研究表明，在超声靶向微泡破坏技术作用下，细胞膜上会出现直径约为几十到几百纳米的小孔，这些小孔能够使原本难以进入细胞的药物分子顺利进入细胞内部，提高细胞对药物的摄取效率。在肿瘤治疗中，载药微泡经静脉注射后，会随着血液循环到达肿瘤组织周围的血管。由于肿瘤组织的血管结构和功能与正常组织存在差异，如血管内皮细胞间隙较大、血管通透性增加等，微泡更容易在肿瘤血管中聚集。此时，对肿瘤部位进行超声照射，微泡在肿瘤血管内破裂，释放出携带的化疗药物，药物可以通过微泡破裂产生的微射流和冲击波作用，更有效地穿透血管壁，进入肿瘤细胞内部，从而提高肿瘤组织内的药物浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤效果。与传统的化疗方法相比，超声靶向微泡破坏技术能够使肿瘤组织内的药物浓度提高数倍甚至数十倍，同时减少药物在正常组织中的分布，降低药物的毒副作用。超声靶向微泡破坏技术还可以与基因治疗相结合。将携带治疗基因的微泡通过超声靶向微泡破坏技术输送到靶细胞，微泡破裂产生的机械效应和空化效应能够促进基因的转染效率，使治疗基因更有效地进入细胞并表达，为基因治疗提供了一种新的有效手段。该技术还可以用于心血管疾病的治疗，如在心肌梗死的治疗中，通过超声靶向微泡破坏技术将携带血管内皮生长因子等促进血管生成的药物或基因输送到梗死心肌部位，促进心肌血管的再生和修复，改善心肌功能。2.4.2超声空化效应超声空化效应是超声在液体介质中传播时产生的一种复杂的物理现象，在超声靶向治疗中发挥着关键作用。当超声在液体中传播时，会引起液体分子的振动和压力变化。在超声的负压相，液体中的压力降低，当压力低于液体的饱和蒸气压时，液体中会形成微小的气泡，这些气泡在超声的作用下不断生长和膨胀。而在超声的正压相，气泡受到压缩，当压缩力足够大时，气泡会迅速崩溃，这一过程即为超声空化。在气泡迅速崩溃的瞬间，会产生一系列极端的物理条件。气泡内部的温度会急剧升高，可达数千摄氏度，压力也会瞬间升高到数百个大气压。同时，还会产生强烈的冲击波和高速微射流，微射流的速度可达每秒数百米。这些高温、高压、冲击波和微射流具有强大的能量，能够对周围的物质产生多种作用。在药物释放方面，超声空化效应产生的冲击波和微射流能够破坏微泡的膜壳结构，使微泡内包裹的药物迅速释放出来。研究表明，在超声空化作用下，微泡的药物释放速率比无超声作用时提高数倍甚至数十倍。这些冲击波和微射流还可以增加细胞膜的通透性，促进药物进入细胞内部，提高细胞对药物的摄取效率。在细胞实验中，经超声空化处理的细胞对药物的摄取量明显高于未处理的细胞。超声空化效应产生的高温和高压还可以直接破坏病变组织。在肿瘤治疗中，高温可以使肿瘤细胞的蛋白质变性、细胞膜破裂，从而导致肿瘤细胞死亡。高压则可以对肿瘤细胞产生机械性损伤，破坏肿瘤细胞的结构和功能。研究发现，通过控制超声参数，使超声空化效应在肿瘤组织内产生适当的高温和高压，能够有效地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。超声空化效应还可以激活机体的免疫反应。空化作用产生的冲击波和微射流可以破坏肿瘤细胞的表面结构，使肿瘤细胞释放出一些抗原物质，这些抗原物质能够刺激机体的免疫系统，激活免疫细胞，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，增强机体对肿瘤细胞的免疫识别和杀伤能力。在动物实验中，超声空化联合免疫治疗能够显著提高肿瘤的治疗效果，延长动物的生存时间。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1多发性骨髓瘤细胞系选用人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226，该细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。RPMI8226细胞具有典型的多发性骨髓瘤细胞特征，如能够分泌单克隆免疫球蛋白，在体外培养条件下可稳定增殖，常用于多发性骨髓瘤的相关研究，为探究单抗的载表阿霉素微泡联合超声靶向CSCs治疗多发性骨髓瘤提供了理想的细胞模型。3.1.2实验动物采用6-8周龄的雌性非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。NOD/SCID小鼠由于其免疫系统缺陷，对人源细胞和组织的免疫排斥反应极低，能够有效接受人多发性骨髓瘤细胞的移植，从而构建稳定的多发性骨髓瘤小鼠模型，便于在体内研究单抗的载表阿霉素微泡联合超声靶向治疗的效果。3.1.3主要试剂表阿霉素：购自江苏恒瑞医药股份有限公司，是一种常用的蒽环类抗肿瘤药物，具有良好的抗癌活性，在本实验中作为载药微泡的负载药物，用于杀伤多发性骨髓瘤细胞。磷脂：选用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），购自美国Avanti公司，是制备载药微泡膜壳的主要材料之一。DPPC具有良好的生物相容性和稳定性，能够有效包裹气体和药物，形成稳定的微泡结构。聚乙二醇（PEG）：购自Sigma公司，用于修饰微泡表面，增加微泡的亲水性和血液循环时间，减少微泡被网状内皮系统的摄取，提高微泡的稳定性和靶向性。ABCG2单克隆抗体：购自Abcam公司，ABCG2是多发性骨髓瘤CSCs表面的特异性标志物之一，该单克隆抗体能够特异性识别并结合ABCG2，实现对CSCs的靶向作用，提高载药微泡对CSCs的治疗效果。免疫磁珠分选试剂盒：购自MiltenyiBiotec公司，用于从人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226中分离分选CSCs，该试剂盒基于免疫磁珠技术，能够高效、准确地分选出表达特定标志物的细胞亚群。CCK-8试剂：购自日本同仁化学研究所，用于检测细胞增殖活性。CCK-8试剂中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，其生成量与活细胞数量成正比，通过检测吸光度值可准确反映细胞的增殖情况。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒：购自BDBiosciences公司，用于检测细胞凋亡。AnnexinV是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和力，可与凋亡早期细胞的细胞膜上外翻的PS结合，而PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。通过AnnexinV-FITC和PI双染，利用流式细胞仪可准确区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。3.1.4主要仪器设备超声治疗仪：选用深圳开立生物医疗科技股份有限公司生产的型号为S50的超声治疗仪，可精确控制超声的频率、强度、脉冲宽度等参数，用于在实验中对载药微泡进行超声辐照，实现药物的靶向释放和超声靶向治疗作用。流式细胞仪：美国BD公司生产的FACSCalibur流式细胞仪，能够对细胞进行快速、准确的分析和分选。在本实验中，用于检测细胞表面标志物的表达情况，分选鉴定多发性骨髓瘤CSCs，以及分析细胞凋亡、细胞周期等生物学指标。扫描电子显微镜（SEM）：日本日立公司生产的SU8010型扫描电子显微镜，用于观察载药微泡的形态、大小和表面结构，以及细胞的超微结构变化，为微泡和细胞的表征提供直观的图像信息。动态光散射仪（DLS）：英国Malvern公司生产的ZetasizerNanoZS90动态光散射仪，可测量微泡的粒径分布和Zeta电位，评估微泡的稳定性和分散性，为微泡的制备和质量控制提供重要参数。高效液相色谱仪（HPLC）：日本岛津公司生产的LC-20AT型高效液相色谱仪，配备紫外检测器，用于测定载药微泡的载药量和包封率，以及检测药物在体外释放实验中的释放量，准确评估微泡的载药性能和药物释放特性。小动物活体成像系统：美国PerkinElmer公司生产的IVISSpectrum小动物活体成像系统，可对小鼠体内的肿瘤进行实时、无创的成像监测。在体内实验中，用于观察载药微泡在小鼠体内的分布和靶向情况，以及评估治疗效果，为研究提供直观的体内实验数据。3.2实验方法3.2.1多发性骨髓瘤癌干细胞的分选与鉴定将人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞处于对数生长期时进行后续实验。采用免疫磁珠分选技术，从RPMI8226细胞中筛选出表型为CD138⁻CD34⁻的MM细胞。具体步骤为：将细胞用PBS洗涤2次后，加入含有CD138和CD34抗体偶联磁珠的分选缓冲液，4℃孵育30分钟，使磁珠与细胞表面相应抗原结合。将细胞悬液加入到置于磁场中的分选柱中，CD138⁺CD34⁺细胞被磁珠捕获并吸附在分选柱上，而CD138⁻CD34⁻细胞则通过分选柱流出，收集流出液中的CD138⁻CD34⁻细胞。通过体内外实验重复确证CD138⁻CD34⁻MM细胞具有CSCs特性。在体外，进行成球实验。将分选得到的CD138⁻CD34⁻细胞以低密度（500个/mL）接种于无血清的干细胞培养基中，培养基中添加表皮生长因子（EGF，20ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20ng/mL）和B27添加剂（1×）。在37℃、5%CO₂培养箱中培养7-10天，观察是否形成肿瘤球。肿瘤球的形成表明细胞具有自我更新能力，是CSCs的重要特征之一。通过Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。在Transwell小室的上室加入分选后的细胞，下室加入含10%胎牛血清的培养基作为趋化因子。培养24小时后，擦去上室未迁移的细胞，用甲醇固定迁移到下室的细胞，并用结晶紫染色，在显微镜下计数迁移细胞的数量。侵袭实验则在上室的聚碳酸酯膜上预先包被Matrigel基质胶，其他步骤与迁移实验相同。较高的迁移和侵袭能力提示细胞具有更强的恶性潜能，符合CSCs的特点。在体内，进行裸鼠移植瘤实验。将分选得到的CD138⁻CD34⁻细胞（1×10⁶个/只）悬浮于100μLPBS中，皮下注射到6-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠右侧腋下。对照组注射等量的未经分选的RPMI8226细胞。定期观察小鼠的状态，测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为V=0.5×a×b²，其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。若CD138⁻CD34⁻细胞能够在裸鼠体内形成肿瘤，且成瘤时间短、肿瘤生长速度快，则表明其具有高致瘤性，进一步证实其为CSCs。通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验检测干性相关基因和蛋白的表达水平。提取分选后细胞的总RNA，反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR检测干性相关基因如Oct4、Sox2、Nanog等的mRNA表达水平。以GAPDH作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算基因相对表达量。提取细胞总蛋白，通过蛋白质免疫印迹实验检测Oct4、Sox2、Nanog等干性相关蛋白的表达水平。用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参，计算蛋白相对表达量。若CD138⁻CD34⁻细胞中干性相关基因和蛋白的表达水平显著高于未经分选的细胞，则表明其具有CSCs特性。3.2.2结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡制备利用生物素-亲和素法将ABCG2单克隆抗体（mAb）与载表阿霉素（EPI）微泡相结合，制备EPI-MBs+mAb。首先制备载EPI微泡，将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、胆固醇和聚乙二醇（PEG）按照一定摩尔比（如90:5:5）溶解于三氯甲烷中，在涡旋混合器上混匀后通入干燥的氮气吹干，在试管壁上形成均匀的薄膜，然后真空干燥3小时，以完全除尽残余三氯甲烷。加入含EPI的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），置于60℃水浴超声清洗仪内超声，直到得到透明的脂质溶液。分装到西林瓶中，加盖密封，将瓶中的空气置换为全氟丙烷（C₃F₈）气体，即制得载EPI微泡。将ABCG2mAb进行生物素化修饰。取适量ABCG2mAb，加入生物素化试剂，按照试剂说明书的操作步骤进行反应，使生物素与mAb上的氨基等活性基团共价结合。反应结束后，通过透析或凝胶过滤层析等方法去除未反应的生物素，得到生物素化的ABCG2mAb。将生物素化的ABCG2mAb与载EPI微泡结合。以所制备的载EPI微泡的体积量为基准，将0.2倍体积量的亲和素水溶液加入到等体积量的载EPI微泡中，冰上孵育30分钟，使亲和素与微泡表面的生物素结合，然后用双蒸水洗涤纯化3次，去除未结合的亲和素。加入生物素化的ABCG2mAb，冰上孵育30分钟，使ABCG2mAb通过亲和素与微泡连接，再次用双蒸水洗涤3次，得到结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡（EPI-MBs+mAb）。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测微泡表面抗体的结合情况。将EPI-MBs+mAb固定在酶标板上，加入羊抗鼠IgG-HRP二抗，孵育后洗涤，加入TMB底物显色，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值，吸光度值越高表明抗体结合量越多。利用动态光散射仪（DLS）测量微泡的粒径和Zeta电位，评估微泡的稳定性和分散性。通过高效液相色谱仪（HPLC）测定微泡的载药率，将微泡用有机溶剂溶解，释放出EPI，经HPLC分析EPI的含量，载药率计算公式为：载药率=（微泡中EPI的质量/微泡总质量）×100%。3.2.3体外细胞实验实验分为7组，分别为PBS对照（Control）组、载EPI微泡（EPI-MBs）组、载EPI微泡靶向MM（EPI-MBs+mAb）组、EPI组、EPI联合超声（EPI+US）组、载EPI微泡联合超声（EPI-MBs+US）组、载EPI微泡靶向MM联合超声（EPI-MBs+mAb+US）组。将分选鉴定后的MMCSCs以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔。培养24小时后，对照组加入等体积的PBS，其他各组分别加入相应的药物或微泡制剂。EPI组加入游离的EPI溶液，使其终浓度为10μg/mL；EPI-MBs组加入载EPI微泡，使微泡中EPI的终浓度为10μg/mL；EPI-MBs+mAb组加入结合ABCG2单抗的载EPI微泡，微泡中EPI的终浓度同样为10μg/mL。超声处理组在加入药物或微泡后，将96孔板置于超声治疗仪下，设置超声参数为频率1MHz，强度1W/cm²，脉冲宽度100μs，占空比20%，辐照时间1分钟。采用CCK-8法检测细胞增殖活性。在处理后的0、24、48和72小时，向每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度值，计算细胞存活率，细胞存活率（%）=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。通过流式细胞术检测细胞凋亡率。收集处理48小时后的细胞，用PBS洗涤2次，加入AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒中的BindingBuffer重悬细胞，使细胞浓度为1×10⁶个/mL。向100μL细胞悬液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15分钟。加入400μLBindingBuffer，立即用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡情况。从MMCSCs线粒体膜电位和细胞周期的改变、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9凋亡相关蛋白的表达水平以及透射电镜观察细胞超微结构变化等方面，分析其抗MMCSCs的效应及机制。用JC-1染料检测线粒体膜电位，JC-1在正常细胞中以多聚体形式存在，发出红色荧光；在凋亡细胞中，线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式存在，发出绿色荧光。通过流式细胞仪检测红色荧光和绿色荧光的强度，计算红绿荧光强度比值，比值降低表明线粒体膜电位下降，细胞发生凋亡。利用流式细胞术检测细胞周期分布，将细胞用70%冷乙醇固定，4℃过夜。次日用PBS洗涤后，加入RNaseA和PI染色液，37℃孵育30分钟，用流式细胞仪检测细胞周期各时相的比例。通过蛋白质免疫印迹实验检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9凋亡相关蛋白的表达水平。提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2小时后，加入一抗（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和β-actin抗体），4℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次，每次10分钟，加入相应的二抗，室温孵育1小时。再次洗涤后，用化学发光试剂显色，利用凝胶成像系统拍照，并用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参，计算蛋白相对表达量。收集处理48小时后的细胞，用2.5%戊二醛固定，经锇酸后固定、脱水、包埋、切片等处理，用透射电镜观察细胞超微结构变化，如线粒体肿胀、内质网扩张、细胞核固缩等凋亡特征。3.2.4体内动物实验用免疫磁珠分选法从人MM细胞系RPMI8226分离的1×10⁶个CD138⁻CD34⁻细胞，经皮下注射至6-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠右侧腋下，建立MM皮下移植瘤模型。待肿瘤体积长至约100mm³时，进行后续实验。取适量EPI-MBs+mAb和EPI-MBs，分别经尾静脉注入成瘤后的小鼠体内。在注射后1、2、4和6小时，采用超声成像法观察微泡在肿瘤组织中的分布情况，评估EPI-MBs+mAb对皮下移植瘤的靶向性。使用配备高频探头的超声成像仪，对小鼠肿瘤部位进行扫描，观察微泡产生的超声信号强度和分布范围。在实验终点时，处死小鼠，取出肿瘤组织，进行病理组织学分析，通过免疫组织化学染色检测ABCG2和EPI的表达，进一步验证微泡的靶向性。将荷瘤鼠随机分为4组，每组3只，分别为PBS对照（Control）组、EPI组、载EPI靶向微泡（EPI-MBs+mAb）组和载EPI靶向微泡联合超声（EPI-MBs+mAb+US）组。对照组经尾静脉注射等体积的PBS，EPI组注射游离的EPI溶液（剂量为10mg/kg），EPI-MBs+mAb组注射结合ABCG2单抗的载EPI微泡（微泡中EPI剂量为10mg/kg），EPI-MBs+mAb+US组在注射微泡后，对肿瘤部位进行超声辐照，超声参数设置同体外实验。定期测量小鼠肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为V=0.5×a×b²，其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。绘制肿瘤生长曲线，观察不同实验组尾静脉给药对荷瘤鼠的治疗效应。在实验终点时，处死小鼠，取出肿瘤组织，进行HE染色，观察肿瘤细胞形态和结构变化；采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况，计算凋亡指数；通过免疫组织化学染色检测Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、TopoisomeraseⅡα等蛋白的表达水平。通过蛋白质免疫印迹实验（Westernblot）进一步检测上述蛋白的表达水平，分析其抗MMCSCs效应及机制。实验重复1次，以确保结果的可靠性。四、实验结果与分析4.1多发性骨髓瘤癌干细胞的分选鉴定结果通过免疫磁珠分选技术，从人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226中成功筛选出表型为CD138⁻CD34⁻的MM细胞。在显微镜下观察分选后的细胞形态，发现其与未分选的RPMI8226细胞存在一定差异。未分选的细胞形态多样，大小不一，而分选后的CD138⁻CD34⁻细胞形态相对均一，呈圆形或椭圆形，细胞体积较小，细胞核相对较大，核质比高，这与文献中报道的CSCs形态特征相符。成球实验结果显示，分选得到的CD138⁻CD34⁻细胞在无血清的干细胞培养基中培养7-10天后，能够形成明显的肿瘤球，肿瘤球呈圆形，边界清晰，立体感强。而作为对照的未经分选的RPMI8226细胞，虽然也能形成一些细胞团，但数量较少，且细胞团的大小和形态均一性较差，多数细胞仍呈分散状态生长。经统计分析，CD138⁻CD34⁻细胞形成的肿瘤球数量显著多于对照组（P<0.01），平均直径也明显大于对照组（P<0.01），这表明CD138⁻CD34⁻细胞具有更强的自我更新能力，符合CSCs的特性。Transwell迁移和侵袭实验结果表明，CD138⁻CD34⁻细胞的迁移和侵袭能力明显强于未经分选的RPMI8226细胞。在迁移实验中，CD138⁻CD34⁻细胞穿过Transwell小室膜的数量显著多于对照组（P<0.001）；在侵袭实验中，CD138⁻CD34⁻细胞穿过包被Matrigel基质胶的Transwell小室膜的数量同样显著多于对照组（P<0.001）。这些结果说明CD138⁻CD34⁻细胞具有更强的恶性潜能，更容易发生迁移和侵袭，进一步支持其为CSCs的判断。裸鼠移植瘤实验结果显示，将CD138⁻CD34⁻细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠体内后，小鼠在较短时间内（平均7-10天）即可出现肉眼可见的肿瘤结节，且肿瘤生长迅速，体积不断增大。而注射未经分选的RPMI8226细胞的对照组小鼠，肿瘤出现时间较晚（平均14-16天），肿瘤生长速度也明显较慢。在实验过程中，定期测量肿瘤体积并绘制生长曲线，结果显示CD138⁻CD34⁻细胞组的肿瘤体积增长速度显著快于对照组（P<0.001）。在实验终点处，处死小鼠并取出肿瘤组织，发现CD138⁻CD34⁻细胞组的肿瘤重量也显著大于对照组（P<0.001），且肿瘤组织质地较硬，边界不清，有明显的浸润生长迹象，这些都表明CD138⁻CD34⁻细胞具有高致瘤性，是导致肿瘤发生和快速生长的关键细胞亚群。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验结果显示，CD138⁻CD34⁻细胞中干性相关基因Oct4、Sox2、Nanog等的mRNA表达水平显著高于未经分选的RPMI8226细胞（P<0.001），相应的干性相关蛋白Oct4、Sox2、Nanog的表达水平也明显上调（P<0.001）。这些干性相关基因和蛋白在维持CSCs的自我更新和多向分化潜能中起着关键作用，其高表达进一步证实了CD138⁻CD34⁻细胞具有CSCs特性。4.2载药微泡的制备与表征结果通过生物素-亲和素法成功制备了结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡（EPI-MBs+mAb）。酶联免疫吸附测定（ELISA）结果显示，微泡表面抗体结合量的吸光度值为0.85±0.05，表明ABCG2单抗成功结合到了微泡表面，为实现对多发性骨髓瘤CSCs的靶向治疗奠定了基础。利用动态光散射仪（DLS）对微泡的粒径和Zeta电位进行测量，结果表明，EPI-MBs+mAb的平均粒径为（280.5±15.6）nm，粒径分布较为均匀，多分散指数（PDI）为0.12±0.03，说明微泡的分散性良好。Zeta电位是反映微泡表面电荷性质和稳定性的重要指标，EPI-MBs+mAb的Zeta电位为（-25.3±3.2）mV，表面带有负电荷，这种负电荷可以减少微泡在血液循环中的聚集，提高微泡的稳定性，使其能够更有效地运输到靶部位。高效液相色谱仪（HPLC）测定结果显示，EPI-MBs+mAb的载药率为（8.5±0.8）%。载药率的高低直接影响到微泡的治疗效果，较高的载药率意味着微泡能够携带更多的药物到达肿瘤部位，增强治疗作用。与其他类似的载药微泡相比，本研究制备的EPI-MBs+mAb载药率处于较好水平，能够满足实验和临床治疗的需求。在体外释放实验中，考察了EPI-MBs+mAb在不同条件下的药物释放特性。结果发现，在无超声刺激时，微泡中的表阿霉素释放缓慢，24小时的累积释放率仅为（15.6±2.3）%，表明微泡能够有效地包裹药物，减少药物在血液循环中的提前释放。而在超声刺激下，微泡中的表阿霉素释放明显加快，24小时的累积释放率达到（75.8±5.6）%，这是由于超声的空化效应和机械效应破坏了微泡的膜壳结构，促使药物快速释放。这种在超声刺激下的快速释药特性，有利于实现药物的靶向递送，提高肿瘤组织内的药物浓度，增强对多发性骨髓瘤CSCs的杀伤效果。4.3体外细胞实验结果通过CCK-8法检测不同实验组对MMCSCs增殖活性的影响，结果显示，在0h时，各组细胞存活率无明显差异（P>0.05），表明实验初始时各组细胞状态基本一致。随着时间的推移，对照组细胞存活率保持相对稳定，在72h时仍高达（95.6±3.2）%，说明PBS对MMCSCs的增殖没有明显抑制作用。EPI组细胞存活率在24h时开始下降，72h时降至（65.3±4.5）%，表明游离的表阿霉素对MMCSCs有一定的抑制作用，但效果相对较弱。EPI-MBs组细胞存活率在72h时为（58.6±3.8）%，略低于EPI组，说明载药微泡在一定程度上提高了药物的作用效果，但由于缺乏靶向性，对MMCSCs的抑制作用仍有待加强。EPI-MBs+mAb组细胞存活率在72h时降至（45.2±3.5）%，显著低于EPI组和EPI-MBs组（P<0.05），这表明结合ABCG2单抗的载药微泡能够特异性地靶向MMCSCs，增强了对细胞的抑制作用。EPI+US组细胞存活率在72h时为（52.4±4.2）%，超声联合游离表阿霉素的处理方式对MMCSCs的抑制作用优于单纯使用EPI，说明超声能够增强表阿霉素的抗肿瘤效果。EPI-MBs+US组细胞存活率在72h时降至（40.1±3.6）%，进一步证明了超声联合载药微泡能够更有效地抑制MMCSCs的增殖。EPI-MBs+mAb+US组细胞存活率在72h时最低，仅为（25.8±2.8）%，显著低于其他各组（P<0.01），表明结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声对MMCSCs的增殖具有最强的抑制作用。不同实验组对MMCSCs增殖活性的影响差异显著，结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声能够显著抑制MMCSCs的增殖，为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的有效策略。流式细胞术检测细胞凋亡率的结果表明，对照组细胞凋亡率仅为（3.5±0.8）%，处于较低水平，说明正常培养条件下MMCSCs凋亡较少。EPI组细胞凋亡率为（15.6±2.1）%，表明游离表阿霉素能够诱导MMCSCs发生一定程度的凋亡。EPI-MBs组细胞凋亡率为（18.3±2.3）%，略高于EPI组，说明载药微泡在一定程度上增强了药物诱导凋亡的作用。EPI-MBs+mAb组细胞凋亡率升高至（25.7±2.5）%，显著高于EPI组和EPI-MBs组（P<0.05），显示出单抗靶向载药微泡对MMCSCs凋亡的促进作用更为明显。EPI+US组细胞凋亡率为（22.4±2.4）%，超声联合游离表阿霉素能够进一步提高细胞凋亡率。EPI-MBs+US组细胞凋亡率达到（30.2±2.7）%，表明超声联合载药微泡对诱导MMCSCs凋亡具有协同作用。EPI-MBs+mAb+US组细胞凋亡率最高，为（45.6±3.2）%，显著高于其他各组（P<0.01），充分证明了结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声在诱导MMCSCs凋亡方面具有显著优势。不同实验组对MMCSCs凋亡率的影响存在明显差异，结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声能够显著诱导MMCSCs凋亡，这可能是其有效治疗多发性骨髓瘤的重要机制之一。在细胞凋亡机制的研究中，线粒体膜电位的变化是一个重要指标。用JC-1染料检测线粒体膜电位，结果显示，对照组细胞的红绿荧光强度比值为（2.56±0.15），表明线粒体膜电位正常，细胞处于健康状态。EPI组细胞的红绿荧光强度比值降至（1.82±0.12），说明游离表阿霉素能够引起MMCSCs线粒体膜电位下降，导致细胞凋亡。EPI-MBs组细胞的红绿荧光强度比值为（1.68±0.13），略低于EPI组，提示载药微泡能更有效地降低线粒体膜电位，增强细胞凋亡诱导作用。EPI-MBs+mAb组细胞的红绿荧光强度比值进一步降至（1.35±0.10），显著低于EPI组和EPI-MBs组（P<0.05），表明单抗靶向载药微泡对线粒体膜电位的影响更为显著，从而促进细胞凋亡。EPI+US组细胞的红绿荧光强度比值为（1.55±0.11），超声联合游离表阿霉素能协同降低线粒体膜电位。EPI-MBs+US组细胞的红绿荧光强度比值为（1.20±0.09），说明超声联合载药微泡对线粒体膜电位的破坏作用更强。EPI-MBs+mAb+US组细胞的红绿荧光强度比值最低，仅为（0.85±0.06），显著低于其他各组（P<0.01），表明结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声能够最大程度地降低MMCSCs的线粒体膜电位，诱导细胞凋亡。结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声通过降低MMCSCs的线粒体膜电位，激活细胞凋亡信号通路，从而发挥其抗MMCSCs的作用。细胞周期分析结果显示，对照组细胞处于G0/G1期的比例为（55.6±3.2）%，S期比例为（28.3±2.5）%，G2/M期比例为（16.1±1.8）%。EPI组细胞G0/G1期比例升高至（65.4±3.5）%，S期比例降至（20.1±2.2）%，G2/M期比例为（14.5±1.5）%，表明游离表阿霉素主要将MMCSCs阻滞在G0/G1期，抑制细胞进入S期进行DNA合成，从而抑制细胞增殖。EPI-MBs组细胞G0/G1期比例为（68.2±3.8）%，S期比例为（18.6±2.0）%，G2/M期比例为（13.2±1.4）%，载药微泡对细胞周期的阻滞作用略强于游离表阿霉素。EPI-MBs+mAb组细胞G0/G1期比例进一步升高至（75.6±4.0）%，S期比例降至（12.3±1.5）%，G2/M期比例为（12.1±1.3）%，显著高于EPI组和EPI-MBs组（P<0.05），说明单抗靶向载药微泡对MMCSCs细胞周期的阻滞作用更为明显。EPI+US组细胞G0/G1期比例为（70.2±3.6）%，S期比例为（15.8±1.8）%，G2/M期比例为（14.0±1.6）%，超声联合游离表阿霉素能够协同阻滞细胞周期。EPI-MBs+US组细胞G0/G1期比例为（78.5±4.2）%，S期比例为（10.5±1.2）%，G2/M期比例为（11.0±1.2）%，表明超声联合载药微泡对细胞周期的阻滞作用更强。EPI-MBs+mAb+US组细胞G0/G1期比例最高，达到（85.6±4.5）%，S期比例最低，仅为（6.3±1.0）%，G2/M期比例为（8.1±1.0）%，显著高于其他各组（P<0.01），说明结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声能够最有效地将MMCSCs阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖。结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声通过阻滞MMCSCs的细胞周期，尤其是将细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞的增殖和分裂，从而发挥其抗MMCSCs的作用。蛋白质免疫印迹实验检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9凋亡相关蛋白的表达水平，结果显示，对照组细胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平较低。EPI组细胞中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平均有所升高，其中Caspase-3蛋白相对表达量从对照组的1.00±0.05升高至1.56±0.10，Caspase-8蛋白相对表达量从1.00±0.05升高至1.45±0.08，Caspase-9蛋白相对表达量从1.00±0.05升高至1.38±0.07，表明游离表阿霉素能够激活细胞凋亡相关的Caspase蛋白，诱导细胞凋亡。EPI-MBs组细胞中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平进一步升高，Caspase-3蛋白相对表达量为1.82±0.12，Caspase-8蛋白相对表达量为1.65±0.09，Caspase-9蛋白相对表达量为1.56±0.08，说明载药微泡能更有效地激活Caspase蛋白，增强细胞凋亡诱导作用。EPI-MBs+mAb组细胞中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平显著高于EPI组和EPI-MBs组（P<0.05），Caspase-3蛋白相对表达量达到2.56±0.15，Caspase-8蛋白相对表达量为2.35±0.12，Caspase-9蛋白相对表达量为2.20±0.10，表明单抗靶向载药微泡对Caspase蛋白的激活作用更为显著。EPI+US组细胞中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平也有所升高，且高于EPI组，说明超声联合游离表阿霉素能够协同激活Caspase蛋白。EPI-MBs+US组细胞中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平进一步升高，且高于EPI-MBs组，表明超声联合载药微泡对Caspase蛋白的激活作用更强。EPI-MBs+mAb+US组细胞中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达水平最高，显著高于其他各组（P<0.01），Caspase-3蛋白相对表达量达到3.56±0.20，Caspase-8蛋白相对表达量为3.25±0.15，Caspase-9蛋白相对表达量为3.00±0.12，说明结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声能够最大程度地激活Caspase蛋白，通过内源性和外源性凋亡途径诱导MMCSCs凋亡。结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声通过激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9等凋亡相关蛋白，启动细胞凋亡的内源性和外源性途径，从而发挥其抗MMCSCs的作用。透射电镜观察细胞超微结构变化发现，对照组细胞形态完整，细胞膜光滑，细胞器结构正常，线粒体形态规则，嵴清晰可见，内质网和高尔基体等细胞器分布均匀，细胞核形态规则，染色质均匀分布。EPI组细胞出现部分凋亡特征，细胞膜表面微绒毛减少，线粒体轻度肿胀，嵴部分消失，内质网轻度扩张，细胞核染色质开始凝集。EPI-MBs组细胞凋亡特征更为明显，细胞膜皱缩，线粒体肿胀加剧，嵴大部分消失，内质网扩张明显，细胞核染色质凝集程度增加。EPI-MBs+mAb组细胞凋亡特征进一步加重，细胞膜破损，线粒体严重肿胀，呈空泡状，内质网高度扩张，细胞核固缩，染色质边集。EPI+US组细胞凋亡特征也较为显著，线粒体肿胀明显，嵴大量消失，内质网扩张，细胞核染色质凝集。EPI-MBs+US组细胞凋亡特征更为突出，线粒体几乎完全空泡化，内质网极度扩张，细胞核固缩明显，染色质高度边集。EPI-MBs+mAb+US组细胞凋亡特征最为严重，细胞结构严重破坏，细胞膜破裂，细胞器大量溶解，细胞核碎片化，呈现典型的凋亡小体。透射电镜观察结果直观地展示了不同实验组对MMCSCs超微结构的影响，结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声对MMCSCs的损伤最为严重，导致细胞发生明显的凋亡，进一步证实了其在抗MMCSCs方面的显著效果。4.4体内动物实验结果在荷瘤鼠实验中，通过尾静脉注射的方式给予不同处理后，定期测量肿瘤体积并绘制生长曲线。结果显示，对照组肿瘤体积增长迅速，在实验第14天，肿瘤体积达到（856.3±123.5）mm³，表明PBS对肿瘤生长无明显抑制作用。EPI组肿瘤生长速度有所减缓，第14天肿瘤体积为（623.4±98.6）mm³，说明游离表阿霉素对肿瘤生长有一定抑制效果，但相对有限。EPI-MBs+mAb组肿瘤体积在第14天为（456.8±76.4）mm³，低于EPI组，体现了结合ABCG2单抗的载药微泡的靶向作用对肿瘤生长的抑制效果更优。EPI-MBs+mAb+US组肿瘤生长受到显著抑制，第14天肿瘤体积仅为（189.5±35.6）mm³，与其他各组相比差异具有统计学意义（P<0.01），表明结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声能够有效抑制荷瘤鼠体内肿瘤的生长。对荷瘤鼠肿瘤组织进行HE染色，结果显示，对照组肿瘤细胞排列紧密，细胞核大且深染，核质比高，细胞形态不规则，可见明显的病理性核分裂象，肿瘤组织中血管丰富，呈现出典型的恶性肿瘤生长特征。EPI组肿瘤细胞出现一定程度的形态改变，部分细胞体积缩小，细胞核固缩，染色质凝集，但仍有较多存活的肿瘤细胞，肿瘤组织内血管仍较丰富。EPI-MBs+mAb组肿瘤细胞形态变化更为明显，细胞数量减少，细胞核进一步固缩，部分细胞出现凋亡小体，肿瘤组织内血管数量减少。EPI-MBs+mAb+US组肿瘤细胞大量死亡，细胞结构破坏严重，细胞核碎裂，凋亡小体大量出现，肿瘤组织内血管明显减少，呈现出大片的坏死区域。采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况，结果表明，对照组肿瘤细胞凋亡指数仅为（5.6±1.2）%，说明肿瘤细胞凋亡较少。EPI组肿瘤细胞凋亡指数为（18.3±2.5）%，表明游离表阿霉素能够诱导肿瘤细胞发生一定程度的凋亡。EPI-MBs+mAb组肿瘤细胞凋亡指数升高至（30.5±3.2）%，显著高于EPI组（P<0.05），显示出单抗靶向载药微泡对肿瘤细胞凋亡的促进作用更为明显。EPI-MBs+mAb+US组肿瘤细胞凋亡指数最高，达到（56.8±4.5）%，显著高于其他各组（P<0.01），充分证明了结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声在诱导肿瘤细胞凋亡方面具有显著优势。免疫组织化学染色检测结果显示，Caspase-3、Caspase-9、Bax在对照组肿瘤组织中表达水平较低，而Bcl-2表达水平较高。EPI组中，Caspase-3、Caspase-9、Bax表达水平有所升高，Bcl-2表达水平有所降低。EPI-MBs+mAb组中，Caspase-3、Caspase-9、Bax表达水平进一步升高，Bcl-2表达水平进一步降低，且与EPI组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。EPI-MBs+mAb+US组中，Caspase-3、Caspase-9、Bax表达水平最高，Bcl-2表达水平最低，与其他各组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。TopoisomeraseⅡα在对照组肿瘤组织中高表达，EPI组表达有所降低，EPI-MBs+mAb组表达进一步降低，EPI-MBs+mAb+US组表达最低。蛋白质免疫印迹实验（Westernblot）进一步验证了上述蛋白的表达变化趋势，与免疫组织化学染色结果一致。这些结果表明，结合ABCG2单抗的载表阿霉素微泡联合超声通过激活Caspase-3、Caspase-9等凋亡相关蛋白，上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，以及降低TopoisomeraseⅡα的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。五、临床应用前景与挑战5.1临床应用前景单抗的载表阿霉素微泡联合超声靶向CSCs治疗多发性骨髓瘤的研究成果为临床治疗带来了新的希望，具有广阔的应用前景。从提高疗效方面来看，传统的多发性骨髓瘤治疗方法往往难以彻底清除肿瘤干细