CN120285059A 白头翁醇提物与庆大霉素组合物及其在抑制耐药鼠伤寒沙门菌中的应用 （湖北省农业科学院畜牧兽医研究所）

地址430000湖北省武汉市洪山区南湖瑶苑4号(72)发明人卢琴罗青平王玉婉郭云清张腾飞张蓉蓉张文婷胡巧温国元合伙)42001专利代理师龚莹莹A61K36/71(2006.01)A61K31/7036(2006.01)白头翁醇提物与庆大霉素组合物及其在抑制耐药鼠伤寒沙门菌中的应用提物与庆大霉素组合物及其在抑制耐药鼠伤寒=31.25mg/mL:2μg/ml;分级抑菌浓度指数0.375,白头翁醇提物与庆大霉素对鼠伤寒沙门21.一种组合物，所述组合物包括白头翁醇提物与庆大霉素，所述的白头翁醇提物的制备方法包括：白头翁饮片粉碎后用乙醇浸提，收集滤液，滤液离心后进行旋转蒸发，之后烘干制成浸膏。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的白头翁醇提物的制备方法中，浸提步骤中浸泡时间为1-2d,浸提1-3次。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的白头翁醇提物的制备方法中，旋转蒸发温度为35-45℃。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的白头翁醇提物的制备方法中，所述的酒精浓度为75%。5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的白头翁醇提物的制备方法中，烘干温度为50-60℃。6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的白头翁醇提物与庆大霉素的质量比为15625:1。7.权利要求1所述的组合物在制备治疗或预防耐药鼠伤寒沙门菌感染的药物中的应8.权利要求1所述的组合物在制备抑制耐药鼠伤寒沙门菌生长的药物中的应用。9.根据权利要求7或8所述的应用，所述的耐药鼠伤寒沙门菌耐受复方新诺明、四环素、头孢曲松和/或氯霉素。3技术领域[0001]本发明属于兽药技术领域，具体涉及白头翁醇提物与庆大霉素组合物及其在抑制耐药鼠伤寒沙门菌中的应用。背景技术[0002]鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌，不但给人的健康带来了威胁，也给养禽业造成了巨大的经济损失。[0003]临床实验数据显示，不同国家和地区分离的鼠伤寒沙门菌都出现了不同程度的耐药性。意大利学者Cucco分离的鼠伤寒沙门菌中，61.5%的菌株对两种抗生素产生了耐药性，29.5%的菌株对三种抗生素产生了耐药性。加拿大学者Arndt检测了379株鼠伤寒沙门临床分离到的1163株鼠伤寒沙门菌中，有78.4%对四环素耐药、48.1%对克林霉素耐药。我国学者对临床分离的34株鼠伤寒沙门菌进行耐药分析，发现91.18%的菌株呈多重耐药，82.3%～100.0%的菌株对磺胺类药物耐药、79.4%～94.1%的菌株对氨基糖苷类药物耐药、88.2%～97.1%的菌株对四环素类药物耐药、79.4%～85.3%林可胺类药物耐药、50%~88.2%的菌株对大环内酯类药物耐药。因此，寻找新的抗生素替代物、开发新型抗菌药物或发现逆转抗生素耐药的化合物是解决抗生素耐药问题的关键途径。[0004]白头翁汤(Pulsatilladecoction,PD),最早见于张仲景的伤寒论，而白头翁散仍散和白头翁散为复合物，主要包含白头翁、黄连、黄柏和秦皮，这4种报道具有体外抑菌作用。而关于单味白头翁对鼠伤寒沙门菌的报道较少。[0005]白头翁醇提物主要提取自白头翁的茎，具有抗感染、抗真菌等生物学功能，它还是一种还原剂，能够产生自由基，特别是超氧阴离子。目前据文献报道，白头翁散对鼠伤寒沙菌试验)提及的白头翁醇提物工艺：取各药材粗粉50g,分别加4～6倍量的90%乙醇，回流提取1h,共3次，分别合并滤液，浓缩并回收乙醇后，60通过抑菌圈直径及最小抑菌浓度测定白头翁醇提物对鼠伤寒沙门氏菌(C77-31)的抑菌，发现白头翁醇提物对鼠伤寒沙门菌未有抑菌作用，据此推测，白头翁醇提物对鼠伤寒沙门菌不敏感，也就是说白头翁醇提物对鼠伤寒沙门菌没有抑制作用。而提取工艺的不同导致药物的主效成分可能不同，研究表明白头翁水提取物联合头孢曲松钠、阿莫西林、头孢他啶、头孢噻呋钠、氟苯尼考等抗菌药联用后对耐药大肠埃希菌具有较好的耐药逆转作用。[0006]庆大霉素(Gentamicin)是一种氨基糖苷类抗生素，其作用机制是作用于细菌体内炎克雷伯菌、变形杆菌、沙门氏菌等具有抗菌作用。但近年来细菌对本品的耐药性严重，尤4其是在临床分离的大肠杆菌、沙门菌、肺炎克雷伯等细菌对庆大霉素高度耐药，因此对于寻找能与抗生素协同作用的中草药尤为重要，通过评价白头翁单味中草药提取方式并与抗生素协同作用降低临床上抗生素的使用量，作为一种新型的减抗限抗的替抗组合物用于鼠伤寒沙门菌的感染具有重要指导意义。发明内容[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有鼠伤寒沙门菌耐药性严重的问题，提供了白头翁醇提物与庆大霉素组合物。[0008]本发明的另一个目的是提供了上述组合物在抑制耐药鼠伤寒沙门菌中的应用。[0010]一种组合物，包括白头翁醇提物与庆大霉素，所述的白头翁醇提物的制备方法包括：白头翁饮片粉碎后用乙醇浸提，收集滤液，滤液离心后进行旋转蒸发，之后烘干制成浸[0011]以上所述的组合物，优选的，所述的白头翁醇提物的制备方法中，浸提步骤中浸泡时间为1-2d,浸提1-3次；[0012]以上所述的组合物，优选的，所述的白头翁醇提物的制备方法中，旋转蒸发温度为[0013]以上所述的组合物，优选的，所述的白头翁醇提物的制备方法中，所述的酒精浓度为75%;[0014]以上所述的组合物，优选的，所述的白头翁醇提物的制备方法中，烘干温度为50-[0015]以上所述的组合物，优选的，所述的白头翁醇提物与庆大霉素的质量比为15625:[0016]上述组合物在制备治疗或预防耐药鼠伤寒沙门菌感染的药物中的应用；[0017]上述组合物在制备抑制耐药鼠伤寒沙门菌生长的药物中的应用。[0018]以上所述的应用，所述的耐药鼠伤寒沙门菌具有复方新诺明、四环素、头孢曲松和/或氯霉素等耐药表型。[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：[0020]本发明首次提供了白头翁醇提物与庆大霉素具有协同抑菌的作用，并且该组合物可用于抗耐药鼠伤寒沙门菌。本发明通过多种方法研究证实了白头翁醇提物与庆大霉素组合物对鼠伤寒沙门菌有很好的抗菌效果，为研制抗耐药鼠伤寒沙门菌病的新型药物奠定了理论基础，乃至为抗生素替代物发掘提供了候选物质，在耐药鼠伤寒沙门菌病的防治方面具有很好的应用前景。具体实施方式[0021]以下结合说明书具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。[0022]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本发明实施例以耐药鼠伤5寒沙门菌Sty17(购自于武汉锋创生物科技有限公司)、鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株为例进行说明，本发明所述组合物对其他耐药鼠伤寒沙门菌也具有抑制或杀灭作用。[0023]本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复。[0024]实施例1:[0025]白头翁提取工艺的选择及对禽类5种细菌的体外抑菌效果：[0026]1.按以下两种方法生成药液终浓度为2g/ml的白头翁提取物[0027](1)醇提法生成药液浓度为2g/ml的白头翁药液[0028]白头翁饮片50g,过50目筛，加入10倍白头翁饮片体积的75%乙醇，浸泡1d,收集滤液，重复2次，合并滤液，4000r/min离心15min,40℃旋转蒸发浓缩至2g/ml,并于56℃烘箱烘干成浸膏后用灭菌蒸馏水将其溶解，使其终浓度至2g/ml,过0.22μm滤膜除菌，4℃保存。在本发明中，需要制成浸膏后再溶解至2g/ml,而不可直接使用旋转蒸发的醇提取物溶液。[0029](2)水提法生成药液浓度为2g/ml的白头翁药液[0030]粉碎50g白头翁饮片，过50目筛，加入5倍白头翁饮片体积灭菌的蒸馏水，纤维素酶0.5%,蛋白酶0.1%,38℃恒温搅拌酶解提取3h;升温至80℃,蒸馏水加至350mL,继续提取1h,用滤纸过滤，并收集滤液；4000r/min离心1[0031]2.白头翁提取物对细菌的抑菌谱测定：[0033]Luria-Bertani(LB)肉汤(购自海博生物公司),TrypticSoyBroth(TSB)肉汤培养基(购自海博生物公司),胎牛血清(购自天杭生物公司),用于细菌的培养；Mueller-Hinton(MH)肉汤(购自BD公司),用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力；鼠伤寒沙门菌菌、金黄色葡萄球菌均为实验室分离并保存的菌种，用于评价白头翁提取物对禽类5种细菌的体外抑菌作用。[0034]2.2试验方法[0035]分别按1:100体积将前期实验室保存的鼠伤寒沙门菌ATCC14028、大肠杆菌菌等用含10%胎牛血清的TSB液体基进行复苏培养，37℃220rpm过夜摇菌后，分别按1:1000转接过夜培养后的菌并按上述培养方式摇菌至OD600约为0.6时，最终用麦氏比浊法分别将上述5种菌制备浓度为0.5麦氏比浊标准菌悬液；[0036]用MH液体培养基倍比稀释后不同浓度的白头翁提取物溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第10孔加白头翁醇提物溶液，每孔50μl,第11孔加MH液体培养基50μl[0037]用MH肉汤将0.5麦氏比浊标准菌悬液1:1000稀释后，向第1至第11孔中加50μl菌悬[0039]由表1可知，当白头翁水提物浓度为500mg/ml时，其对大肠杆菌ATCC25922和鼠伤寒沙门菌ATCC14028的生长均具有抑制作用，当白头翁醇提物浓度为250mg/ml时，其对大肠杆菌ATCC25922的生长具有抑制作用。但当白头翁醇提物浓度为125mg/ml时，其对鼠伤寒沙6门菌的生长具有抑制作用。由此结果表明白头翁醇提物对鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌的作用要优于白头翁水提物。[0040]表12种白头翁提取物对禽类不同细菌最小抑菌浓度的测定最小抑菌浓度菌株名称水提物醇提物鼠伤寒沙门菌ATCC14028大肠杆菌ATCC25922鸭疫里默氏菌金黄色葡萄球菌无无无无禽巴氏杆菌C48-1无无[0044]白头翁醇提物对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17和非耐药鼠伤寒沙门菌ATCC14028最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定[0046]Mueller-Hinton(MH)肉汤(购自BD公司),用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力。鼠伤寒沙门菌ATCC14028为中监所购买的菌株，鼠伤寒沙门菌Sty17菌株(购自于武汉锋创生物科技有限公司),具有复方新诺明、四环素、头孢曲松、氯霉素等耐药表型，其余培养特性与ATCC14028相同，用于评价白头翁醇提物对耐药鼠伤寒沙门菌的体外作用。[0048]按实施例1中的方法将鼠伤寒沙门菌ATCC14028和耐药鼠伤寒沙门菌Sty17分别培养至0D₆0约为0.6时，用麦氏比浊法制备浓度为0.5麦氏比浊标准菌悬液；[0049]用MH液体培养基倍比稀释后不同浓度的白头翁醇提物溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第10孔加庆大霉素溶液，每孔50μl,第11孔加MH液体培养基50μ1作为[0050]向第1至第11孔中加50μl标准菌悬液，37℃孵育16-20h,观察有无细菌生长，判断[0052]由表2可知，当白头翁醇提物浓度为125mg/ml时，其对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17生长具有抑制作用；当白头翁醇提物浓度为250mg/ml时，其对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17具有杀菌作用。当白头翁醇提物浓度为125mg/ml时，其对鼠伤寒沙门菌ATCC14028生长具有抑制作7[0053]表2白头翁醇提物对鼠伤寒沙门菌的最小抑菌名称最小抑菌浓度最小杀菌浓度耐药鼠伤寒沙门菌Sty17鼠伤寒沙门菌ATCC14028[0055]实施例3:[0056]各种抗生素对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17和鼠伤寒沙门菌ATCC14028的最小抑菌浓霉素、多西环素、恩诺沙星等药物(购自索莱宝公司),用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效力。[0059]按实施例1中的方法将鼠伤寒沙门菌ATCC14028和耐药鼠伤寒沙门菌Sty17分别培养至0D60约为0.6时，用麦氏比浊法制备浓度为0.5麦氏比浊标准菌悬液；[0060]用MH液体培养基倍比稀释后至终浓度为1mg/mL的氨苄青霉素、头孢噻肟、泰乐菌素、庆大霉素、多西环素、恩诺沙星等分别加到无菌的96孔聚苯乙[0061]向第1至第11孔中加50μ1标准菌悬液，37℃孵育16-20h,观察有无细菌生长，判断[0063]由表3可知，当氨苄青霉素浓度为128μg/ml时，其对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17生长具有抑制作用；当壮观霉素浓度为256μg/ml时，其对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17生长具有抑制孢西丁浓度为8μg/ml时，其对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17生长具有抑制作用；当恩诺沙星、多西环素、头孢曲松浓度为512μg/ml时，其对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17生长具有抑制作用。而均有抑菌作用。表3各种抗生素对鼠伤寒沙门菌的最小抑菌浓度名称最小抑菌浓度(MIC8头孢西丁8恩诺沙星多西环素头孢曲松8[0067]实施例4:[0068]白头翁醇提物与庆大霉素联合对耐药鼠伤寒沙门菌Sty17具有协同抑菌作用[0070]Mueller-Hinton(MH)肉汤(购自BD公司),用于药物敏感实验，检测药物的抑菌效[0072]按实施例1中的方法将耐药鼠伤寒沙门菌Sty17或鼠伤寒沙门菌ATCC14028培养至0D60约为0.6时，用麦氏比浊法制备浓度为0.5麦氏比浊标准菌悬液；[0073]在无菌的96孔聚苯乙烯板每排第2到10孔每孔用排枪加入50μlMH液体培养基，在第1、2孔加入4倍MIC浓度的白头翁醇提物溶液，用排枪吹打混匀后自第二孔吸出50μl加入作为生长对照，其中每列所含白头翁醇提物浓度一致。[0074]用MH液体培养基分别根据不同菌株对庆大霉素的MIC值，稀释不同浓度的庆大霉素溶液于无菌4mlEP管中，最大浓度为4倍MIC浓度。第2排浓度为第1排浓度的一半，依次类推，计算8排所加庆大霉素的浓度并配置好相应溶液，随后将50μl溶液加入96孔聚苯乙烯[0075]此时96孔聚苯乙烯板中每孔均包含不同浓度的庆大霉素与白头翁醇提物溶液，每排溶液庆大霉素浓度相同，第1到第8排浓度呈倍比递减；每列溶液中所含的白头翁醇提物溶液浓度相同，第1列到第10列浓度呈倍比递减。[0076]向每排第1至第10孔与第12孔中加50μl标准菌