分子生物学考点

分子生物学考点整理

符广勇朱兰

第一章.绪论

一、分子生物学概念

分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分

子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主

动地改造和重组Fl然界的基础学科。

二、重组DNA技术

又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接

起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状.

二、基因表达的调控

基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。

四、转录因子

转录因子是能与基因5'端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表

达的蛋白质分子。

第二章.染色体与DNA

一、染色体上的蛋白质

染色体上的蚤白质主要包括组蛋白和北组蛋白。根据凝胶电泳性质可以把组蚤白分为Hl.H2A.H2B.H3.H4。

这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精钮酸。

二、组蛋白的特性

1.进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3.H4。

2.无组织特异性到目前为止，仅发现7类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有任，精

细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。

3.肽链上.氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链r.o

4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。

5.富含赖氨酸的组蛋白也

三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白

四、真核细胞DNA序列的分类

1.不重复序列

2.中度重复序列

3.高度重复序列

重复序列的意义：

若某•重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；

在短时间内可同时产生大量的基因产物。

重复序列的应用：

应用于分子标记的作用：卫星DNA(便于分子标记)和微卫星DNA

五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别

1.真核基因组庞大，原核生物基因组小

2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重第序列

3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列

4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子

5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，外乎没有内含子结构

6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子

和沉默子

7.其核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有

8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构

六、重叠基因(Overlappinggene)

指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基

因的组成部分。

开放阅读框：openrendingfrome

七、DNA双链的变性和复性

变性：当DNA溶液温度接近沸点或者PH较高时，互补的两条链就可能分开的过程。

处性：当变性的DNA溶液缓慢降温时，DNA的互补链又可以重新聚合，重新形成规则的双螺旋的过程。

增色效应：当DNA溶液温度升高到接近水的沸点时，260nm的吸光度明显增加的现象。

解链温度(Tm):双螺旋DNA有一半解旋时的溶液温度

影响因素：

DNA中G+C的含量;

溶液中的离r强度；

DNA的均一性。

八、复制子(replicon)

DNA复制从起点开始到终止点区域的DNA序列。

其核生物染色体NDA上有多个县制起始点，可进行多夏制子的同步复制；原核生物DNA只有一个复制起始点,

其起始点可以连续发动复制。

九、冈崎片段

DNA复制过程中，后随链的复制是不连续的，必须形成•小段DNA,这些小段DNA再由DNA连接酹连接成完

整的DNA,这些小片段称为冈崎片段。

1.出现冈崎片段或半保留复制的原因：

2.DNA的两条链在化学极性上是相反的。一条从5'到3',另一条从3'到5'

3.DNA聚合前只能催化DNA按照5'向3、端延长。

生物体内DNA复制时不可能完全处于单链状态，因此不可能两端同时复制。

十、聚合酶的功能

RNA聚合酶能从头合成RNA链；DNA聚合酶不能从头合成DNA,只能延长已有的DNA链。

原核生物DNA聚合酶I、II和III的性质比较

性质NDA聚合酶・IDNA聚合senDNA聚合酶HI

3'—5'+十+

5'-3,*--

新生链合成--+

相对分子质量10390900

细胞内分子数400910-20

生物学活性较高低最高

[■•一、DNA的损伤

损伤原因：

1.自发性损伤

a.DNA复制中的错误

碱基配对错误

b.DNA自发性化学变化

碱基异构互变；减基脱氨基作用；脱喀咤、脱嚓吟；碱基修饰与键断裂

2.物理因素引起的DNA损伤

a.紫外线引起的DNA损伤:喘噬二聚体

b.电离辐射引起的DNA损伤

3化学因素引起的DNA损伤

十二、DNA的修系

1.错配修复

2.切除修复

a.碱基切除修复

b.核甘酸切除修复

3.重组修复

4.DNA的直接修复

5.SOS反应

十三、转座子(iransposonTn)

是基因中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的

一个位置“跳跃”到另一个位置，也称跳跃基因。

转座作用的遗传效应：

1.转座引起插入突变，可导致基因失活

2.转座产生新的基因

3.转座产生的染色体畸变，引起D\A缺少或倒位

第三章转座引起生物进化，能产生有新的生物学功能的基闪和新的蛋白质分子

第四章生物信息的传递(上)从DNA到RNA

一、复制与转录的异同点

相同点：

1.都按碱基互补配对进行

2.都需要DNA作为模板

3.都是从5'-3'方向进行

4.都依赖DNA的双链

5.核甘酸之间都是通过磷酸二酯键来连接

不同点：

1.原料不同。转录以核精核昔为原料，复制以脱氧核精核昔为原料。

2.聚合酶不同。转录用RNA聚合旃，复制用DNA聚合所。

3.产物不同。转录产物为RM,复制产物为DNA。

4.转录只发生在DNA任意一条链上，复制以两条DNA链为模板

5.转录中A-U配对，复制时A-T配对。

6.转录不需要引物，复制需要引物。

复制产物叮亲代具有高保真性，绝大多数是完全相同的，而转录产物与结构基因相比，除U'T互换外,

成熟的RNA与模板序列相差很大

二、转录的特点

1.转录不需要引物。

2.转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止。对于其核生物而占，一个转录单元就是一个基

因，而原核生物可以是多个基因。

3.转录只发生在DNA的任意一条链上，为不对称转录。

4.转录后产物经过加工修饰后，才能成为成熟、书.活性的RNA片段。

三、转录单元

从启动子到转录终止子结束的一段DNA序列。

四、流产式起始

转录起始形成2-9个核甘酸的短RXA转录物后就将其释放，RNA徒不再延伸。

五、真核生物细胞中二类RNA聚合的特性比较

酶细胞内定位转录产物相对活性对a-鹅膏草碱的敏

感度

RNA聚合酶I核仁rRNA最高不敏感

RNA聚合酶II核质hnRNA较高敏感

RNA聚合酶III核质IRNA最低存在物种特异性

六、启动子：promcler

指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。

原核生物启动子的结构：

转录起点：与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个喋吟。以+1表示。5,端的序

列为上游序列，3'端的序列为下游序列。

原核生物启动子结构特点：

TO区称TATA盒：-35区称GACA盒。

-10区与-35区的最佳距离为：6〜19bp。

真核生物启动子结构特点：

-25〜-30区称TATA盒；-70〜-78区称CAAT盒；-80〜TOObp称为GC盒。

启动子分类：

组成型启动子：

优点：调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。

缺点：启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成浪费.而在需要该基因大量表达的特

定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果

诱导型启动子：

优点：其独特的优点在于可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，快速

诱导基因转录的“开”或“关”。这样不仅不会造成植物体内资源的浪费，又可提高植物的

抗性。

缺点：受外界化学或物理信号调控

七、原核生物与真核生物mRNA的比较

1.原核生物mRNA的半衰期短：真核生物mRNA半衰期较长。

2.原核生物mRNA为多顺反子：真核生物mRNA为单顺反子。

3.原核生物mRNA5'端没有帽子结构，3,端没有或只有较短的多聚腺昔酸尾巴：真核生物mRNA5'端有帽

子结构，3'端几乎都有多聚膜甘酸尾巴。

4.原核生物mRNA有SD序列；真核生物mRNA没有SD序列。

八、多顺反子mRNA和单顺反子mRNA

豕顺反子mRNA(po1ycistronicmRNA):一个mRNA包含多个蛋白质的编吗序列，即包含多个JF放阅读框.

单顺反子mRNA(monocistron:cMrna):一个mRNA只包含编码一个蛋白质的编码序列。

SD序列：原核生物起始密码AUG上游7〜12个核甘酸处的一个富含腺喋吟的区域，在翻译中与16SrRNA3f

端反向互补。

九、真核生物和原核生物转录的差异

1.转录的位置不同。原核生物在细胞质中，真核生物在细胞核中。

2.转录的启动子结构不同。

3.RNA聚合酶不同。原核生物只有1种RNA聚合朝，真核生物有3种.

4.RNA聚合酶的特性不同。真皮生物的RNA聚合酶不能独立转录P.NA,原核生物可以。

5.转录产物不同。原核生物转录产物为多顺反子，真核生物转录产物为单顺反子。

6.转录后RNA加工修饰不同。真核生物加工修饰较复杂，原核生物较简单。

十、真核生物mRNA的转录后加工

5'端加帽的作用：

1.保护mRNA5'端不被降解。

2.为核糖体识别模板提供信号，提高翻译效率。

3.作为进出细胞核的识别标记。

4.提高mRNA的剪接效率。

5.参与80s复合物的形成。

1.3'端加尾的作用：

2.有利于mRNA通过核孔。

3.有利于mRNA的稳定。

4.增加翻译效率。

5.提高mRNA的剪接效率。

6.是RT-PCR设宜引物的部位。

剪接(splicing)：从DNA模板转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起

来形成一个连续的RNA分子的过程。

十一、真核生物tRNA前体的转录后加工

1.内含子的剪接

2.3'端添加CCA

3.核甘酸修饰。tRNA是含稀有核甘酸最多的RNA。

十二、RNA的可变剪接

又叫选择性剪接，在mRNA前体的剪接过程中，参加剪接的外显子可以不按其线性次

序剪接，内含子也可以不被切除而保留。

十三、RNA的编辑

指基因转录产生的mRNA分子中，由于核甘酸的缺失、插入或置换，基因转录物的序

列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成不同于基因序列中的编码信

息的现象。

十四、细胞内RNA的种类及各自的生理功能

转运RNAtRNA转运氨基酸

核糖体RNArRNA核蛋白体组成成分

信使RNAmRXA蛋白质合成模板

核不均一RNAhnRNA成熟mRNA的前体

小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接

小胞浆RNAscRNA蛋白质在内质网定位合成的信号识别体的

组成成分

反义RNAanRXA对基因的表达起调控作用

核仁小分子RNAsnoRNA参9核糖核酸酹对特定体结构的识别

核梅ribozymeRNA有酶活性的RNA

十五、RNA生物功能的多样性

1.RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用

2.RM具有重要的催化功能和其他持家功能

3.RNA转录后加工修饰依赖于其他各类小RNA和其他蛋白质复合物

4.RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用

5.RNA在生物进化中起重:要作用。

第五章生物信息的传递(下)

-从mRNA到蛋白质

一、摆动性

mRNA密码子的前两位碱基和tRNA的反密码子严格配对，而密码子第三位碱基与反密码

子第一位碱基不严格遵守减基互补配对规则。

二、tRNA的二级结构

关键部位：受体臂和反密码子臂。

受体臂3,端的最后三个碱基序列永远是CCA序列，其作用是接受氨基酸，形成氨酰-tR\A°

反峦码于臂是与mRNA结合的部位。

三、tRNA的种类

1.起始tRNA和延伸Trna

能特异性地识别mRNA模板上起始密码f•的tRNA叫起始tRNA,其他tRNA统称为延伸tRNA。

原核生物起始tRNA:甲酰甲琉氨酸tR\A(fMet-tRNAfMet)o

真核生物起始tRNA:甲硫氨酸tRNA(Met-tRNAMet)

2.同工tRNA

携带氨基酸相同而反密码子不同的一组tRNAo

3.校正tRNA

也称抑制IRNA,指在蛋白质的结构基因中，由于某个氨基酸的密码子变为终止密码子，使翻译过程提前

终止。包括无义突变和错义突变。

无义突变：某个氨基酸的密码子突变为终止密码子。

错义突变：某个氨基酸的密码子突变为另外一种氨基酸的密码子。

注：任何tRNA都不能识别终止密码子，只有校正tRNA和释放因子可以识别。

四、原核生物和真核生物的翻译起始因子

原核生物的翻译起始因子：IF-1.IF-2.IF-3

真核生物的翻译起始因子：cIFT.cIF-2.cIF-3

五.蛋白质前体的加工

1.N端fMet或Met的切除

2.二硫键的形成

3.特定氨基酸的修饰

4.切除新生肽链中的非功能片段

六、分子伴侣(molecularchaperone)

细胞内帮助新生肽链正确组装为成熟蛋白质，而本身却不是最终功能蛋白质分子的组

成成分的蛋白质分子。

七、信号肽(signaipeptide)

在起始密码子•后，有一段疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨菸酸序列被称为信号肽.

1.信号肽的作用：

2.完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件

3.仅有信号肽还不足以保证蛋白质转运的发生

4.信号肽的切除并不是作用所必需的

5.并非所有的转运蛋白质都有可降解的信号肽。

八、核定位蛋白的转运机制

核孔复合物(nulcearporecomplexNPC)

核定位信号(nulcearlocalizationsignerNLS)

出核信号(nulcearexportsignerNES)

第五章分子生物学研究方法上一一DNA.RNA及蛋白质操作技

术

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸

序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等是分子生物学研究的核心技术。

基因工事件

程：是

指在体

外将核

酸分子

插入病

毒、质

粒或其

他载体

分子

中，构

成遗传

物质的

新组

合，使

之进入

新的宿

主细胞

内并获

得持续

稳定的

增殖能

力和表

达。

介干牛物

学的三大

成就：第

一，在20

世纪40年

代确定了

遗传信息

的携带

者，即基

因的分子

载体是

DNA而不

是蛋白

质，解决

了遗传物

质的基础

问题：第

二50年代

提出了

DNA分子

的双螺旋

结构模型

和半保留

复制，解

决了基因

的自我复

制和世代

交替问

题：第三

50年代末

到60年代

相继提出

了中心法

则和操纵

子学说，

成功破译

了遗传密

码，阐明

了遗传信

息的流动

与表达机

制。

年份

1961Nirenberg破译了第一个遗传密码：Jacob和Monod毙出了基因表达的操纵子模型

1967第一次发现DNA连接酹

1982美英批准使用第一例基因工程药物一胰岛素，现代胰岛素是第三代抗体也是第三代

1983获得第一例转基因植物烟草

1986GMO首次在环境中释放

1994第一批基因工程西红柿在美国上市

2000完成第一个高等植物拟南芥的全序测定(1.2xl08bp)

GMO(GenticallyModitiedOrgenisn):遗传修饰的生物体：通过分子生物学技

术，对生物的基因组进行遗传修饰，所得到的基因组成和性状改变了的生物

体。

基因克隆载体的条件：具有多克隆位点必须含有供选择的转化子标记基因能

携带外源DNA片段。

多克隆位点：MLS(multiplecloningsite)在一个载体上，有很多酶的识别

位点。

转化子：含有外源DAN分子的宿主细胞。重组子：含有重组DNA分子的细胞

一、a-互补蓝白斑筛选原理：

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用a互补现象进行筛选是最常

用的一种鉴定方法。

1.、载体上含有lacZ'基因，LacZ'基因编码的a肽铮是p半乳糖普酶的氨基端的短片段］146

个氨基酸)。

2.宿主细胞DNA含有编码B半乳糖甘酶的粉基端的基因，该基因编码B半乳糖甘酶

段基端的序列w片段。

3、a肽,w片段单独存在是均无活性。具有两者结合是使得培养基X-gal,生成蓝色的浸氯

叫咻。由此非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落呈白色。

因此，任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种3半乳糖甘酹突变的大肠杆菌细

胞后，便会产生出有功能活性的B半乳糖甘陶，在IPTG(异丙基硫代B-D-半乳糖哲)诱导后，在含有X-gal

的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后，就会破坏。

肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的P半乳糖昔酶相互补的活性a肽，而导致不能形成有功能

活性的P半乳糖甘超，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色雨落。

二.DNA重组实验步骤：

1目的基因和载体的提取：供体生物基因或称外源基因的提取

2限制性酶切：目的基因切成不同大小片段

3前接：连接到另一个DNA分子上

4转化：将这个重组DNA分子转入受体细胞

5筛选和坚定：对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定

6基因表达扩增：对含有重组DNA的细胞进行大量的培养，检测外源基因是否表达

三、DNA基本操作技术

Souther.blot鉴定DNA.Norther.blot鉴定RNA,Wester.blot鉴定蛋白质

电泳：带电荷颗粒与带电相反的电极方向移动

凝胶电泳的分辨能力同凝狡的类型和浓度有关。

1核酸凝胶电泳中加入淳化乙锭(EtBt)核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约

50ngDNA所形成的条带

2琼脂凝胶电泳是一种非常快速、简便、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法

3聚丙烯酰胺凝胶电泳催化剂为甲叉双丙烯酰胺。可以分离低相对分子质量蛋白质，小于

IkbdDNA片段和DNA序列分析

4脉冲电场凝胶电泳可用于分离超大相对分子质量的DN-A.

四、细菌转化

概念：(transformation)是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA

而导致性状特征发生遗传改变的过程。细菌转化的方法有CaC12法、电击法

五、聚合酶链式反应技术

PCR技术：即聚合酶链式反应技术(polymerasechainreaction)一种体外扩

增DNA的方法，PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两个单链引物。经过高温变性

将模板DNA分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后食中

温延伸，反应液的游离核甘酸紧接着5.端到3.端合成一条互补的新链。循环

使DNA数目不断倍增。

关键是TagDNA耐热DNA聚合酶的发现

PCR技术过程原理：

PCR技术的基本原理类似于似于DNA的天然复制过程，DNA聚合酶以一段单链DNA为模

板，通过一个或两个人工合成的吞核甘酸引物与单链DNA模板中的一段序列互不结合，形

成部分双链，在适宜的温度和环境下，在体外通过酶促反应迅速扩增一段目的基因。其特异

性依赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物。

PCR反应包括高温变性一一低温退火——中温延伸三个反应基本步骤：

模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经过PCR扩

增形成的双链DNA解离成单链，以便与引物的结合，为下一轮做准备

模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55c左右，引物与

模板DNA单链的互补序列配对节和。退火温度主要与引物的长度和碱基组成有关。

链的延伸：DNA模板与引物结合形成的部分双链在TagDNA聚合酶或其他DNA聚合

酶的作用下，以dNTP为反应的原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则，合成一条新的

与模板DNA链互补的新链。

多次重复以上三个过程就可以获得大量的目的DNA片段。基本要素：Tris-HCL缓冲液、Mg2+、

Dntp.TapDNA聚合酶引物浓度反应温度和循环次数

PCR技术与DNA复制的异同：

相同点：反应的底物都是dNTP;都需要DNA聚合酶的催化，而且链的延伸都只

能是5,-3,方向；都需要模板，都按半保留复制机理进行；都需要引物；都

需要Mg2+催化。

不同点：1、DNA复制和PCR反应分别在细胞内和体外完成的。2、细胞内的DNA

的复制是半不连续复制，而PCR中，DNA是连续的；3、细胞内DNA的复制时，不

需要将双链完全解开形成单链，按半不连续方式进行DNA的复制，而PCR反应

中，DNA双链必须完全解链，复制过程都是连续进行的；4细胞内DNA的复制时,

DNA的解链通过解链酶催化，而PCR反应中是通过高温使双链解离；5、细胞内

DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成RNA链，而PCR反应中所需的引物是

人工合成的寡聚核昔酸；6细胞内DNA复制时，温度保持一致，而PCR反应中温

度在解链温度，退火及延仲3个温度之间变化

六、基因组DNA文库的构建

基因组DNA文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物

细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇称为基因组DNA文库：

除了伽马噬菌体以外，柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母

人工染色体（YAC）都可用于基因组文库的构建

cDNA文库：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA将cDNA与载体DNA重

组，并转化到宿主细菌或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体这样的克隆

群体即cDNA文库

基因文库：是某一生物体全部或部分基因的集合，将某个生物的基因组DNA或者cDNA片段

与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳

性菌，所得到的菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库

cDNA文库基因组DNA文库的区别：

1基因组文库中包含了所有的基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内元和调节序列，

因此在研究基因结构时没有多大用处。

2.cDNA文库代表了mRNA的来源，其中•些特定的转录本丰富而另•些很少，所以存在丰度

的差别；而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因的序列。

3.从不同细胞类型制备cDNA文.库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表认的基

因，基因组文库则不能。

4、基因组文库由于含有不表达序列，因此比cDNA文库大。

5、mRNA在不同组织之间存在丰度的差异，因此cDNA文库的在构建时对于mRNA含量较少的

就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题。

七、基因文库的筛选

基因文库的筛选探针是带有标记的己知的核酸序列

核酸杂交法原理P189:将圆形硝酸纤维素膜放在含有琼脂培养的培养皿表面,

将带筛选菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，进行适当的温育，同

时保留原来的菌落平板做对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落

发生裂解，DNA随之变性。接着用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成

DNA的印记。用32P标记的探针杂交，经过放射自显影图像。在经过X线底片上

显黑色斑点的就是试验中寻找的目的克隆，可以通过对应丁平板上位置找到相

应的克隆

PCR筛选法

免疫筛选法：基于抗原特异性结合原理，所以该法适用于对表达文库的筛选。

为什么要加二抗：1防止一抗可能冲洗干净，无法检测到目的基因。2、防止呈现假阳性。

SNP应用技术：singlenucleotidepolymorphism单核甘酸多态性

指基因组DNA序列中由于单个核昔酸的突变而引起的多态性。

第六章分子生物学研究法下-基因功能研究技术

表达序列标签：EST(expressedsequencetag)

基因敲出(geneknock-out)又称基因打靶，针对一个序列已知但功能未知的基因，从

DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物

学功能。

通过同源重组使特定基因失活，以斫究该基因的功能的技术，也称基因打靶。

基因敲出的三种方法：同源重组插入突变RNA干扰

基因敲入：通过同源重组使同一种基因替换另一种基因，以便体内测定他们是否有相同的功能，或

将正常的基因引入基因组中置换突变基因，以达到靶向基因治疗目的的技术。

顺式作用元件：cis-cutingclement:是存在于基因旁侧序列中影响基因表达的序列，

包括启动子、增强子、沉默子、调控序列等。他们的作用是参与基因表达的调控。顺式作

用兀件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点、要与反式作用因子(蛋白质)相

互作用而起作用。

报告基因：reportergene:是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是

一个表达产物非常容易被鉴定的基因。

作为报告基因的条件：1已被克隆和全序列已测定2表达产物在受体细胞中不存在即无背景3其

表达产物能进行定量测定。

常用报告基因：葡萄糖甘酶Gus::绿色荧光蛋白GFP;：荧光素酶Lit

RNA干涉：RNAinterference:利用双链小RNA高效，特异性降解细胞内同源

mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。

第七章原核基因表达调控

基因表达：在一定调节机制控制下，基因通过转录和翻译，而产

生蛋白质产物或者转录后直接产生其RNA产物，如rRNAtRNA

等过程。

基因表达调控：指相同的结构基因并非在各种细胞中同时表达，而是根据机体生长发

育，繁殖的需要。随着环境的变化，有规律的选择性，程序性适度的表达，以适应其环境发

挥其生埋功能。

基因表达调控的生物学意义：适应环境，维持生长和增殖。维持个体发育与分化。

调节蛋白：是调节基因转录的蛋白因子包括3类：调节蛋白特异因子，阻遏蛋白，激活

蛋白。

基因表达调控的基本原理：

1基因表达调控的多层次复杂性

a基因结构的活化：b转录起始，最有效的调节环节：c转录的加工转运：d翻译及翻译

后加工

2基因转录调节的基本要素：

a特异的DNA调节序列，顺式作用原件：b调节蛋白，转录因子：cRNA聚合航

一、基因表达的特性：

1.时间特异性或阶段特异性

根据功能的需要，在某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生以适应细胞或个

体特定分化，发育的需要，

2.空间特异性

多细胞生物个体在某一特定的生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞和组织器

官中不同。从而导致特异性的蛋白质分子分布不同的细胞或组织器宜中，基因表达的产物所

表现出的这种分布差异

二、基因表达的方式

组成型表达：不易受环境变化影响的基因表达，在个体生长的任何一个阶段都能在大

多数细胞中持续表达

适应性表达：协调表达

三：管家基因：在生命全过程都是必须的，且在生物个体的几乎所有细胞中持续表达

的基因，意义维持生命的基本途径。

影响因素：启动序列、启动子与RNA聚合酶的相互作用

四、原核基因表达调控的分类

原核基因的表达主要发生在转录水平

转录调控的类型及特点

调节物结合到DNA上正调节负调节

是开启关闭

否关闭开启

试诉某一调控的区别机制：p249

在负调控中，调节基因的产物是阻遏蛋白。阻遏蛋白作用的部位是操纵区。分为

负控诱导：阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录

负控阻遏：（非活性）阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。

在正调控中，调节基因的产物是激活蛋白。分为

正控诱导：效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态，结构基因转录

正控阻遏：效应物分子的存在使得激活蛋白处于非活性状态。结构基因不转录。

由于启动子与操纵基因有部分重叠，当阻遏蛋白结合到操纵基因上与启动子，部分启

动子被占用，影响RNA聚合酶不能结合到启动子上，因此不能被转录，结构基因得不到表

达。

原核基因调捽的主要恃点：

可诱导调节：是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，有原来关闭的状态转

变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化

可阻遏调节：这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酹的工作过程中，由于一

些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达

弱化子：是原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转录作用的一段核昔酸序列，该区

域能形成不同的二级结构，利用原核生物转录与翻译的偶联机制对转录进行调节

葡萄糖效应：在葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、麦芽

糖等诱导物，与其对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来。

细菌的应急反应：当细菌在生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生应急

反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟昔四磷酸（ppGpp）和鸟昔五磷

酸（pppGpp）,ppGpp、pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是一大批操纵子，所

以称他们是超级调控子或称为魔斑。产生着两种物质的流导物是空载tRNA

安慰性诱导物：指的是与转录调控中实际诱导物相似的一类高效诱导物，但不是该诱

导酶的底物

安慰性诱导物：异丙基臻基半乳糖昔（IPTG）、筑甲基半乳糖甘（TMG）、0-硝基半乳糖昔

(ONPG)

乳糖缺乏时操纵基因

lacl启动子

DMAJZZMH

mRNA.

陨遏蛋白

四聚体

乳糖存在时

lacl启动于1册［IIlac后动子

।...........于

I阻遏蛋白不能结

mENA■・—・」・「.合到猱纵基因

多顺反子

mRNA

乳糖操纵子：包括调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。

乳糖操纵子

大肠杆菌的lac操纵子受到两方面的调控：•是对RNA聚合酶结合到启动子上去的调控（正调控）：

一是对操纵基因的调控（负调控）。

在含菊萄糖的培养基中大肠杆菌不能利用乳糖，只有改用乳糖时才能利用乳

操纵子

糖的调控机理是：当在培养基中只有乳犍时由于乳糖的代谢产物异乳糖是lac操纵子的诱导物，它可

以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基

因结合，于是RNA聚合的结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳

糖的酶，这就必当大肠杆菌的培养基中只有乳糖时利用乳糖的原因。

在含乳糖的培养基中加入葡萄糖时，不能利用乳糖的原因，即在lac操纵r的调控中，有降解物基因

活化蛋白（CAP）,当它特异地结合在启动子上时，能促进R\A聚合酶与启动子结合，促进转录（由于CAP

的结合能促进转录，称为阳性调控方式）。但游离的CAP不能与启动子结合，必须在细胞内有足够的cAMP

时，CAP首先与cAMP形成复合物，此复合物才能与启动子相结合。葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP

的含量，当向乳糖培养基中加入葡萄糖时，造成cAMP浓度降低，CAP便不能结合在启动子上。此时即使有

乳糖存在，RNA聚合酶不能与启动子结合，虽已解除了对操纵基因的阻遏，也不能进行转录，所以仍不能

利用乳糖。

lac操纵子的本底水平表达：在没有诱导物的存在下，细菌照样能合成少量的B-半乳

糖甘酶，透过酶的现象。

（1）两个矛盾:a诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要转运酶,

转运的合成有需要诱导：b乳糖并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是异构乳糖，而后者在

8-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的。

（2）解释：在没有诱导物的情况下，转运随和B-半乳糖昔诲仍有本地水平的麦达。阻遇物的结合并

非绝对紧密，偶尔会掉下，使得转录可以进行。表达量足矣使诱导过程得以启动。

操纵子：指原核基因和调控的单位，由启动子，调节基因，操纵基因及所控制的一组功

能上相关的结构基因组成

在一个完全被诱导的细胞中B-半乳糖甘酶，透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为

1:0.5:0.2,

第八章真核基因表达调控

原核生物的基因结构特点：①为一条环状双链DNA；②只有一个复制起点；③具有操纵子

结构；④绝大部分为单拷贝；⑤可表达基因约50%,大于真核生物小于病毒；⑥基因一般是

连续的，无内含子；⑦重复序列很少，8结构基因大部分能编码蛋白质。为多顺反子9基

因组很小，大多只有一条染色体。

单顺反子：一条mRNA只编码一种蛋白质的信息，只含一个开放阅读框。

真核生物基因组结构特点：

1.真核基因组庞大，原核生物基因组小

2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重任序列

3.真核基因组大部分此非编码序列，原核基因组大多是编码序列

4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子

5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，口乎没有内含了结构

6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子

和沉默子