马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程

GB/TXXXX—202X

前  言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》

的规定起草。

本文件代替GB/T29375-2012《马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程》，除文字表述、结构

调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

a）删除了规范性引用文件“GB18133-2000”，增加了“GB/T31790、GB/T36833、

GB/T36816、GB/T36846”（见2，2012年版的2）；

b）增加了“试管苗”的定义（见3.8）；

c）更改了布局原则的表述，更改为分条表述（见4.1.1，4.1.2，4.1.3，4.1.4，2012年版

的4.1）；

d）删除了“定期消毒，按照40%的甲醛和高锰酸钾2:1的比例，40%的甲醛溶液10mL

倒入5g高锰酸钾容器内（每立方米空间用量），进行熏蒸”，更改为“接种室、培养室应

保持卫生，每周至少消毒一次。可使用二氧化氯、臭氧密闭熏蒸，或紫外灯照射结合75%

乙醇喷雾等方式消毒”（见4.3.1，2012年版的4.4.1）；

e）更改了紫外灯的时间，更改为“30min”（见4.3.3，2012年版的4.4.3）；

f）删除了若将温室作为培养室的内容（见2012版的4.4.6）；

g）增加了“每天巡查培养苗生长状况，发现污染及时清理，并进行培养室消毒。”（见

4.3.6，2012年版的4.4.7）；

h）更改了语句表述，增加了“选择丰产性好的标记单株”；将“幼龄薯”更改为“薯

块”（见5.1.1，2012年版的5.1.1.1和5.1.1.2）；

i）增加了病毒和类病毒的检测方法，删除了“按照GB18133-2000附录A和B的方法检

测”（见5.1.2，2012年版的5.1.2）；

j）删除了人工打破休眠的具体方法“用1%硫脲+5mg/L赤霉素的溶液浸种5min”及催

芽方法“可采用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%乙醇喷湿进行表面消毒，置于25℃黑暗

条件下催芽；或播种于含水量20%灭菌细沙中发芽（水中含5mg/L多菌灵）”（见2012年版

的5.1.3.1和5.1.3.3）；

k）更改了病毒检测前试管苗转接的长度及检测的表述，更改为“取带有1~2个叶片的上

部茎段转入新的器皿中继续培养，编号不变；根据病毒检测要求的取样量，对下部茎段继续

培养或直接进行病毒检测，样品不能粘有培养基。”（见6.1，2012年版的6.1和6.2）；

l）增加了病毒病的检测方法，删除了“按照GB18133-2000附录A执行”（见6.2，2012

年版的6.3）；

m）更改了基础苗培养条件，更改为“温度20℃～26℃、相对湿度50%～70%、光照强

度2000Lx～4500Lx、光照时数10h～16h/d”（见8.3，2012年版的8.3）；

n）更改了基础苗保存条件，更改为“温度8℃～16℃、相对湿度50%～70%、光照强

度3000Lx～4500Lx”（见9.2，2012年版的9.2）；

o）更改了常规扩繁培养基量的表述，将“每瓶加入1/5容量的培养基”更改为“厚度2cm

左右”（见10.3，2012年版的10.1.3）；

p）更改了扩繁培养条件，更改为“白天20℃～26℃，光照强度2000Lx～4500Lx，

光照时间14h～16h/d，培养18d～25d”（见10.6，2012年版的10.1.6）；

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GB/TXXXX—202X

q）更改了再次切段繁殖的长度，将“待长出7～8片叶片后”更改为“待长出5～8个叶

片后”（见10.7，2012年版的10.1.7）；

r）删除了水培扩繁和壮苗扩繁的内容（见2012年版的10.2和11）；

s）删除附录F壮苗培养基配方（见2012年版的附录F）。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由内蒙古大学和中国标准化研究院提出。

本文件由全国蔬菜标准化技术委员会（SAC/TC467）归口。

本文件起草单位：内蒙古大学、中国标准化研究院、定西马铃薯研究所、内蒙古格瑞得

马铃薯种业集团有限公司、张家口市农业科学院、重庆市薯类脱毒种苗快繁中心、恩施土家

族苗族自治州农科院

本文件主要起草人：张若芳、杨丽、孙清华、蒲媛媛、冯志文、吴健、Utpal、杜密茹、

齐建建、吴茜、李进福、李冬虎、马恢、黄振霖、高剑华

本文件及其所代替或废止的文件的历次版本发布情况为：

——替代GB/T29375-2012。

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GB/TXXXX—202X

马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程

1范围

本文件确立了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程。

本文件适用于马铃薯脱毒试管苗的培育和扩繁。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期

的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改单）适用于本文件。

GB/T31790马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法

GB/T36833马铃薯X病毒检疫鉴定方法

GB/T36816马铃薯Y病毒检疫鉴定方法

GB/T36846马铃薯M病毒检疫鉴定方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

茎尖stemtip

有分生组织（0.05mm～0.1mm）及芽原基和正在发育的叶原基的芽顶端部分（0.1mm～

10mm）。

3.2

叶原基leafprimordium

在茎尖生长点的基部形成的突起。

3.3

茎尖分生组织meristem

茎尖部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群。

3.4

离体培养in-vitropropagation

从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控

制条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

3.5

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GB/TXXXX—202X

脱毒苗in-vitrovirus-freeplantlet

经检测不带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马

铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯纺锤块茎

类病毒（PSTVd）等（类）病毒的试管苗。

3.6

核心苗coreplantlet

通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状的脱

毒苗。

3.7

基础苗basicplantlet

由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗。

3.8

试管苗tissuecultureplantlets

根据不同生产目的与要求，在试管、玻璃瓶等容器中通过基质培养的脱毒苗。

4脱毒苗生产车间

4.1布局

4.1.1周围无污染源，具备隔离条件。

4.1.2生产车间布局应遵循“环境清洁、便于操作、方便消毒”的原则。

4.1.3入口处宜有风淋系统，具备更衣室、清洗室、配制室、灭菌室、贮存室、接种室、培

养室等，各室应隔离。

4.1.4培养室具备充足的自然或人工光源。

4.1.5脱毒苗生产车间布局平面示意图见图1。

培接贮灭配清更

养种存菌制洗衣

室室室室室室室

风

淋

入口

图1脱毒苗生产车间布局平面示意图

4.2设备、试剂

脱毒苗生产的组培设备、试剂参见附录A。

4.3卫生要求

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4.3.1接种室、培养室应保持卫生，每周至少消毒一次。可使用二氧化氯、臭氧密闭熏蒸，

或紫外灯照射结合75%乙醇喷雾等方式消毒。

4.3.2接种前接种室应过滤通风。

4.3.3使用超净工作台时，应提前30min打开紫外灯。接种时打开风机关闭紫外灯，超净工

作台面及内壁用75%乙醇擦拭消毒。

4.3.4镊子、剪刀、解剖刀、解剖针等工具使用前应灭菌，且每次接触植物材料的部位应灼

烧或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用。

4.3.5工作人员应穿消毒工作服，洗净双手，且在操作过程中随时用75%的乙醇擦拭手和工

作台面。

4.3.6每天巡查试管苗生长状况，发现污染及时清除，并进行培养室消毒。

5茎尖脱毒与培养

5.1脱毒材料的选取

5.1.1田间选择

现蕾期至开花期，选择具备原品种典型性状、生长势强的健康植株做好标记，收获期从

丰产性好的标记单株中挑选无病斑、虫蛀、机械损伤，符合品种特性的薯块作为脱毒材料。

也可在苗期选取具备原品种典型性状的健康植株中、下部短枝茎尖或腋芽作为脱毒材料。

5.1.2病毒检测筛选

入选的薯块或植株，按照GB/T31790-2015中检测方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒

（PSTVd）、按照GB/T36833-2018中检测方法检测马铃薯X病毒（PVX）、按照GB/T

36816-2018中检测方法检测马铃薯Y病毒（PVY）、按照GB/T36846-2018中检测方法检测

马铃薯M病毒（PVM），采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测马铃薯卷叶病毒

（PLRV）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）。筛选无PSTVd的块茎或植株

作为茎尖脱毒基础材料；若检测到无病毒薯块或植株，可直接进行扩繁。

5.1.3催芽处理和病毒钝化

5.1.3.1薯块可通过自然出芽或人为干预打破休眠催芽。

5.1.3.2对含有S病毒、X病毒的薯块，新芽长至2cm～3cm时置于（37±1）℃培养箱中钝

化病毒3～4周。

5.2茎尖培养

5.2.1茎尖培养基的制备

5.2.1.1茎尖培养基配方参见附录B。

5.2.1.2将制备好的茎尖培养基快速分装于容器中，并封口。

5.2.1.3将分装好的容器置于灭菌锅内，121℃高压（1.1kg/cm2）灭菌20min，冷却，放置

3d～5d，无污染的培养基备用。

5.2.2材料消毒

取经5.1.3处理后薯块上2cm～3cm的芽，剪去外叶，流水冲洗30min，移入接种室，

在超净工作台上用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗，再用2%次氯酸钠浸泡7min～10min，

无菌水冲洗4次～5次。

5.2.3茎尖剥离与接种

11

GB/TXXXX—202X

借助40×双目解剖镜，剥去外叶，剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长点，用解剖刀或

解剖针切取带1～2个叶原基的生长点（0.1mm～0.3mm），迅速置于茎尖培养基表面，器

皿口用酒精灯灭菌并封口，注明编号、品种名称、接种时间。

5.2.4离体培养

5.2.4.1在温度20℃～25℃、相对湿度70%、光照强度2000Lx～3000Lx、光照时数16h/d

的条件下离体培养。

5.2.4.2定期查看，待形成肉眼可见的茎叶后，转移到MS培养基（配方参见附录C），培养

成带4～5个叶片的幼苗。

6病毒检测

6.1将每个器皿的幼苗，在超净工作台内切取带有1~2个叶片的上部茎段转入新的器皿中继

续培养，编号不变；根据病毒检测要求的取样量，对下部茎段继续培养或直接进行病毒检测，

样品不能粘有培养基。

6.2检测方法采用5.1.2的方法，也可以采用灵敏度更高的检测技术，筛选出不含PVX、PVY、

PVS、PLRV、PVM、PVA病毒的脱毒苗。

7试种观察

将部分脱毒苗移栽到防虫温网室，结出的薯块种植到田间试种观察，符合原品种典型性

状的脱毒苗即为核心苗。

8基础苗培养

8.1对核心苗切段扩繁。将培养器皿置于超净工作台上，器皿口用75%乙醇擦拭消毒，用镊

子取出核心苗，按单茎节切段，每个切段至少带1个叶片。

8.2将剪下切段的腋芽朝上插入MS培养基（配方参见附录C）或其它脱毒苗扩繁培养基上

（配方参见附录D），器皿口用酒精灯灭菌并封口，注明编号、品种名称、接种时间等。

8.3培养条件：温度20℃～26℃、相对湿度50%～70%、光照强度2000Lx～4500Lx、光

照时数10h～16h/d。

9基础苗保存

9.1选择保存培养基（配方参见附录E）保存基础苗。

9.2将基础苗置于温度8℃～16℃、相对湿度50%～70%、光照强度3000Lx～4500Lx、

光照时数10h～14h/d的条件下使其缓慢生长，继代培养出一定数量的脱毒苗保存。

10扩繁

10.1扩繁前检测基础苗是否带病毒（PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、PVA）和类病毒（PSTVd）。

检测参照6执行。

10.2选择用MS固体培养基（配方参见附录C）或扩繁培养基（配方参见附录D）。

10.3将配制好的培养基装入器皿中，厚度2cm左右，封口；将分装好的器皿置于灭菌锅内，

121℃高压（1.1kg/cm2）灭菌20min，冷却，放置3d～5d。

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GB/TXXXX—202X

10.4检测合格的基础苗切段扩繁。将培养器皿置于超净工作台上，器皿口用75%乙醇擦拭

消毒并用酒精灯灭菌，用镊子取出脱毒苗，按单茎节切段，每个切段至少带1个叶片。

10.5将剪下切段的腋芽朝上插入培养基，器皿口用酒精灯灭菌并封口，注明编号、品种名称、

接种时间等。

10.6培养条件：白天20℃～26℃，夜间16℃～20℃，光照强度2000Lx～4500Lx，光照

时间14h～16h/d，培养18d～25d。

10.7待长出5～8个叶片后可再次切段继代繁殖。

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GB/TXXXX—202X

AA

附录A

附录B（资料性附录）

附录C组培设备、试剂

C.1配制室

C.1.1防酸碱台面的试验台。

C.1.2冰箱。

C.1.3药品柜。

C.1.4器械柜。

C.1.5天平。

C.1.6pH计。

C.1.7纯水仪。

C.1.8容量瓶、细口瓶、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、移液器、试剂勺等。

C.1.9试管、锥形瓶、培养瓶（盒）、封口膜、线绳或橡皮筋。

C.1.10不锈钢锅。

C.1.11电磁炉。

C.2清洗室及灭菌室

C.2.1水槽。

C.2.2控水架。

C.2.3烘箱。

C.2.4高压灭菌锅。

C.3接种室

C.3.1超净工作台。

C.3.2空调。

C.3.3培养基存放架。

C.3.4紫外灯、臭氧发生器等。

C.3.5酒精灯。

C.3.6镊子、剪刀、解剖针、解剖刀等。

C.3.740×双目解剖镜。

C.4培养室

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GB/TXXXX—202X

C.4.1LED光源培养架（带时间控制器）。

C.4.2紫外灯、臭氧发生器等。

C.4.3空调。

C.4.4加湿机。

C.4.5温、湿度仪。

C.5药品

C.5.1次氯酸钠饱和溶液。

C.5.275%乙醇。

C.5.3激动素、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、D-泛酸钙、

萘乙酸（NAA）。

C.5.4卡拉胶、琼脂或倍立凝。

C.5.5蔗糖、食用白糖。

C.5.6附录B～附录E中的所有试剂。

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GB/TXXXX—202X

BB

附录D

附录E（资料性附录）

附录F茎尖培养基配方

表B.1茎尖培养基配方

质量浓度

母液成分化学试剂

MS（1962）aFAO（1986）bCIPc

硝酸钾（KNO3）1900mg/L1900mg/L1900mg/L

大

硝酸铵（NH4NO3）1650mg/L1650mg/L1650mg/L

量

氯化钙（CaCl2•2H2O）440mg/L440mg/L440mg/L

元

硫酸镁（MgSO4•7H2O）370mg/L500mg/L370mg/L

素

磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg/L170mg/L170mg/L

铁硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）27.8mg/L27.8mg/L27.8mg/L

盐乙二胺四乙酸二钠（Na2•EDTA）37.3mg/L37.3mg/L37.3mg/L

硫酸锰（MnSO4•4H2O）22.3mg/L0.5mg/L22.3mg/L

硼酸（H3BO4）6.2mg/L1.0mg/L6.2mg/L

微

硫酸锌（ZnSO4•4H2O）8.6mg/L1.0mg/L8.6mg/L

量

碘化钾（KI）0.83mg/L0.01mg/L0.83mg/L

元

硫酸铜（CuSO4•5H2O）0.025mg/L0.03mg/L0.025mg/L

素

氯化钴（CoCl2•6HO）0.025mg/L0.025mg/L

钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）0.25mg/L0.25mg/L

烟酸0.5mg/L1.0mg/L0.5mg/L

肌醇100mg/L100mg/L100mg/L

有

硫酸盐腺嘌呤80mg/L0.25mg/L

机

泛酸钙0.5mg/L2.0mg/L

成

甘氨酸2.0mg/L2.0mg/L

分

盐酸硫胺素（维生素B1）0.5mg/L1.0mg/L0.5mg/L

盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5mg/L1.0mg/L0.5mg/L

生物素0.2mg/L

激

激动素0.04mg/L～1.0mg/L

素

吲哚乙酸1mg/L～3.0mg/L

糖蔗糖30g20g30g

其他琼脂6g8g6g

a茎尖培养基为MS培养基加激素。

b联合国粮农组织推荐的茎尖培养基配方。

c国际马铃薯中心的茎尖培养基配方。

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GB/TXXXX—202X

CC

附录G

附录H（资料性附录）

附录IMS培养基配方

表C.1MS培养基配方

质量浓度

母液成分化学试剂

（mg/L）

硝酸铵（NH4NO3）1650

硝酸钾（KNO3）1900

大量元素

氯化钙（CaCI2•2H2O）440

硫酸镁（MgSO4•7H2O）370

磷酸二氢钾（KH2PO4）170

碘化钾（KI）0.83

硼酸（H3BO3）6.2

硫酸锰（MnSO4•4H2O）22.3

微量元素硫酸锌（ZnSO4•7H2O）8.6

钼酸钠（Na2MoO•2H2O）0.25

硫酸铜（CuSO4•5H2O）0.025

氯化钴（CoCI2•6H2O）0.025

硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）27.8

铁盐

乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA·2H2O）37.3

肌醇100

烟酸0.5

有机成分盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5

盐酸硫胺素（维生素B1）0.1

甘氨酸2.0

注1：MS固体培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+琼脂6g/L（卡拉胶4.5g/L），pH值为5.6~5.8。

注2：铁盐母液的配制：两种试剂分别称量并分别加热溶解，待两种试剂均溶解后混合，混合后的溶液继续加

热使其充分螯合，冷却后定容备用。

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GB/TXXXX—202X

DD

附录J

附录K（资料性附录）

附录L扩繁培养基配方

表D.1扩繁培养基配方

母液成分化学试剂质量浓度

硝酸钾（KNO3）1900mg/L

硝酸铵（NH4NO3）1650mg/L

大量元素磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg/L

氯化钙（CaCI2•2H2O）440mg/L

硫酸镁（MgSO4•7H2O）370mg/L

硼酸（H3BO3）6.2mg/L

硫酸锰（MnSO4•4H2O）22.3mg/L

钼酸钠（Na2MoO•2H2O）0.25mg/L

微量元素硫酸锌（ZnSO4•7H2O）8.6mg/L

碘化钾（KI）0.83mg/L

硫酸铜（CuSO4•5H2O）0.025mg/L

氯化钴（CoCI2•6H2O）0.025mg/L

硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）27.8mg/L

铁盐a

乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA·2H2O）37.3mg/L

蔗糖25g/L

其他

倍立凝4.5g/L~5g/L

注1：本配方pH值为5.6~5.8。

注2：可用卡拉胶或琼脂替代倍立凝。

a铁盐母液的配制：两种试剂分别称量并分别加热溶解，待两种试剂均溶解后混合，混合后的溶液继续加热使其

充分螯合，冷却后定容备用。

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GB/TXXXX—202X

EE

附录M

附录N（资料性附录）

附录O保存培养基配方

表E.1保存培养基配方

母液成分化学试剂质量浓度

硝酸钾（KNO3）1900mg/L

硝酸铵（NH4NO3）1650mg/L

大量元素磷酸二氢钾（KH2PO4）170mg/L

氯化钙（CaCl2·2H2O）440mg/L

硫酸镁（MgSO4·7H2O）370mg/L

硼酸（H3BO3）6.2mg/L

硫酸锰（MnSO4·4H2O）22.3mg/L

钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25mg/L

微量元素硫酸锌（ZnSO4·4H2O）8.6mg/L

碘化钾（KI）0.83mg/L

硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025mg/L

氯化钴（CoCl2·6H2O）0.025mg/L

硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸二钠（Na2·EDTA·2H2O）37.3mg/L

盐酸吡多辛（维生素B6）0.5mg/L

盐酸硫胺素（维生素B1）0.4mg/L

有机成分

甘氨酸2.0mg/L

烟酸0.5mg/L

生长抑制剂6.0mg/L~8.0mg/L

其他倍力凝4.5g/L~5g/L

蔗糖25g/L

注1：本配方pH值为5.6~5.8。

注2：可用卡拉胶或琼脂替代倍立凝。

______________1_9__________________

GB/TXXXX—202X

F

20

ICS65.020.01

CCSB04

GB

中华人民共和国国家标准

GB/TXXXX-202X

代替GB/T29375-2012

马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程

Codeofpracticeforin-vitrovirusfreeseedpotatoesplantletsbreeding

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

XXXXXXX发布

-6-

GB/TXXXX—202X

马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程

1范围

本文件确立了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程。

本文件适用于马铃薯脱毒试管苗的培育和扩繁。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期

的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改单）适用于本文件。

GB/T31790马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法

GB/T36833马铃薯X病毒检疫鉴定方法

GB/T36816马铃薯Y病毒检疫鉴定方法

GB/T36846马铃薯M病毒检疫鉴定方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

茎尖stemtip

有分生组织（0.05mm～0.1mm）及芽原基和正在发育的叶原基的芽顶端部分（0.1mm～

10mm）。

3.2

叶原基leafprimordium

在茎尖生长点的基部形成的突起。

3.3

茎尖分生组织meristem

茎尖部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群。

3.4

离体培养in-vitropropagation

从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控

制条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

3.5

9

GB/TXXXX—202X

脱毒苗in-vitrovirus-freeplantlet

经检测不带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马

铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯纺锤块茎

类病毒（PSTVd）等（类）病毒的试管苗。

3.6

核心苗coreplantlet

通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状的脱

毒苗。

3.7

基础苗basicplantlet

由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗。

3.