CN116514672B 一种用于核酸递送的可电离脂质及其lnp组合物和疫苗（康希诺生物股份公司）

(19)国家知识产权局(12)发明专利(65)同一申请的已公布的文献号(66)本国优先权数据(73)专利权人康希诺生物股份公司地址300457天津市滨海新区经济技术开发区西区南大街185号西区生物医药园四层401-420(72)发明人王浩猛严志红李蒽原晋波史建明邓捷刘健宇学峰邱东旭朱涛(74)专利代理机构北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11690专利代理师王立红杨晞A61K9/51(2006.01)A61K31/7105(2006.01)A61K39/25(2006.01)A61K47/18(2017.01)JP特开2005-15377A,2005.01.20审查员何娟娟一种用于核酸递送的可电离脂质及其LNP组合物和疫苗本发明提供了一种新型阳离子脂质和脂质纳米颗粒及核酸疫苗。本发明选择特定的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒mRNA疫苗，发现其较现有技术中的阳离子脂质制备的睡十V睡十889o罩o甲立°·甲立°品21.一种阳离子脂质，其特征在于，所述的阳离子脂质化合物的结构如下：2.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包含：如权利要求1所述的阳离子脂质、非-阳离子脂质和/或聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。3.根据权利要求2所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包含：阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质和/或聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。4.根据权利要求3所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合3物选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)或DMG-PEG2000中的一种或多种组合。5.根据权利要求4所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合6.根据权利要求3所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的中性磷脂选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油) (DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)中的一种或多种组合。7.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的中性磷脂为DSPC。8.根据权利要求3所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的甾族脂质选自燕麦甾醇、或多种组合。9.根据权利要求8所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的甾族脂质为胆固醇。10.根据权利要求3-9任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的阳离子脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为20～60%、中性磷脂在脂质组分中的摩尔百分含量为5%~25%、甾族脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为25%～55%;聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物在脂质组分中的摩尔百分含量为0.5%～15%。11.根据权利要求3-9任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物摩尔比为30-60:1-20:20-50:0.1-10。12.根据权利要求11所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物摩尔比为40-60:10-20:30-50:1-5。13.根据权利要求12所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物摩尔比为45:10:43:2或40:10:48:2。14.根据权利要求2-9任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的平均粒径为50～200nm或所述纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷或所述纳米颗粒具有小于0.4的多分散性。15.一种根据权利要求2-14任一项所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括将阳离子脂质、非-阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至溶剂后与mRNA混合的步骤。16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂4质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至乙醇后与经稀释后的mRNA稀释液混合后经超滤、稀释、过滤后制得。18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述的超滤方式为切向流过滤。19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述的混合方式可为湍流混合、层流混合或微流体混合。20.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，稀释液为乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液pH为3～6,浓度为6.25~200mM。22.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，将阳离子脂质、非-阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至溶剂后所得的脂质混合溶液与mRNA稀释后的溶液流速比为1～5:1。所述N/P为阳离子脂质中N与mRNA单核苷酸中P的摩尔比。24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，采用脂质包封mRNA时的N/P为3-8。25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，采用脂质包封mRNA时的N/P为3、4、26.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述的超滤液选自由以下组成的组：钠盐和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)盐，超滤液pH为6.5～8.5。5[0002]目前递送mRNA在临床上经过验证的系统为脂质纳米粒(LipidNanoparticle,量为0.63%(Maugeri,Marcoetal."LinkagebetweenendosomalescapeofLNP-mRNAandloadinginto[0003]水痘—水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)会导致两种不同的疾[0004]目前上市的两种带状疱疹疫苗为减毒活疫苗ZOSTAVAX和亚单位疫苗SHINGRIX。标人群为50岁及以上的成年人，但美国免疫接种咨询委员会推荐60岁及以上的人群使用，因为该疫苗保护力最多持续8年。SHINGRIX的组分包括VZV病毒的GE蛋白胞外区和ASO1B佐6研发公司苗带状疱疹减毒活科技股份公司临床Ⅲ期(招募已完成)带状疱疹减毒活上海生物制品任公司临床1/IⅡ期已完成北京万泰生物药业股份有限公司临床1/Ⅱ期主动暂停带状疱疹减毒活/制品有限公司带状疱疹减毒活/司申报临床主动撤回带状疱疹减毒活公司临床Ⅲ期重组蛋白苗(CHO细胞)科技(苏州)有限公司进行中(尚未招募)/北京绿竹生物苗(CHO细胞)公司虽然VZV病毒重新激活的原理现在并不清楚，但已知VZV特异性细胞免疫是限制病毒重新激活和复制的关键。分泌IFNγ的T细胞频数目前被认为是考察带状疱疹疫苗保护作7用的最佳替代性指标，而关于特异性抗体应答水平与保护作用相关性的争议性则较大。[0009]GE蛋白是VZV病毒当中21组分也是一种促进CD4'T细胞反应的天然皂苷。但是佐剂本身具有一定毒性。发明内容[0011]本发明术语“聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。[0012]本发明术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少一个纳米量级尺寸的颗粒，其包含至少一种脂质。[0013]本发明术语“疫苗”是指适合于应用于动物(包括人)的组合物，在施用后诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助预防、改善或治愈起因于由微生物感染的临床疾病。[0014]本发明术语“递送系统”是指调控生物活性成分在空间、时间及剂量在生物体内分布的制剂或组合物。[0016]本发明术语“烃基”是指相应的烃失去一个氢原子后剩余的基团，在本发明中特别[0017]本发明涉及一种阳离子脂质具有如下式I结构：(=0)NRa-或-NRaC(=0)0-;[0023]G₁和G₂各自独立地为未取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；[0026]R₁和R₂各自独立地为C₆-C₂4烷基或C₆-C₂烯基；[0031]具体地，其中的阳离子脂质式I结构中L₁和L₂各自8[0032]具体地，其中的阳离子脂质式I结构中，L₁和L₂均为-0-,或者，L₁和L₂均为-0(C=0)[0033]具体地，其中的阳离子脂质其有以下结构(IA):[0037]n为1至15的整数。[0038]具体地，其中的阳离子脂质其有以下结构(IB:[0040]其中y和z各自独立地为1至12的整数。[0041]具体地，其中的阳离子脂质结构中n为2至12的整数，优选的，n为2、3、4、5或6;其中y和z各自独立地为2至10的整数，优选的，为4至9的整数。[0042]具体地，其中的阳离子脂质结构中R₁和R₂各自独立地具有以下结构：[0045]R₇a和R,在每次出现时独立地为H或C₁-C₁₂烃基；并且a为2至12的整数，优选的，a为8至12的整数；[0046]其中R₇a、R₇和a各自被选择为使得R₁和R₂各自独立地包含6至20个碳原子。[0047]具体地，其中的阳离子脂质结构中至少一次出现的R₇为H,优选的，R₇在每次出现[0048]具体地，其中的阳离子脂质结构中至少一次出现的R┐为C₁-C₈烃基；优选的，其中[0049]具体地，其中的阳离子脂质结构中R₁或R₂或两者具有以下结构之一：[0052]具体地，其中的阳离子脂质化合物下结构如下：人人9CN116514672B11[0056]本发明提供一种脂质纳米颗粒，包含：上述的阳离子脂质、非-阳离子脂质和/或聚(PEG)-脂质缀合物。[0057]具体地，所述的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PDAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺[0058]具体地，所述的中性脂质选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)中的一种或多种组合，优选的为DSPC。[0060]具体地，所述的阳离子脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为20～60%、中性磷脂在脂质组分中的摩尔百分含量为5%～25%、甾族脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为25%～55%;聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物在脂质组分中的摩尔百分含量为0.5%～15%。比为30-60:1-20:20-50:0.1-10,优选的，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物摩尔比为40-60:10-20:30-50:1-5,更优选的，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物摩尔比为45:10:43:2或40:10:48:2。[0063]具体地，所述纳米颗粒的平均粒径为50～200nm或所述纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷或所述纳米颗粒具有小于0.4的多分散性。[0064]本发明提供一种脂质纳米颗粒的制备方法，包括将阳离子脂质、非-阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至溶剂后与mRNA混合的步骤。[0065]具体地，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至乙醇后与经稀释后的mRNA稀释液优选的，所述的混合方式可为湍流混合、层流混合或微流体混合。[0067]具体地，所述缓冲液pH为3～6,浓度为6.25～200mM。[0068]具体地，将阳离子脂质、非-阳离子脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物溶解至溶剂后所得的脂质混合溶液与mRNA稀释后的溶液流速比为1～5:1。[0069]具体地，采用脂质包封mRNA时的N/P为2-10,优选的N/P为3-8,更优选的，N/P为3、[0070]具体地，所述的超滤液选自由以下组成的组：钠盐和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)[0072]本发明提供一种水痘-带状疱疹病毒脂质纳米颗粒mRNA疫苗，包含：编码水痘-带[0073]具体的，其中所述mRNA编码GE蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示序列，或者与SEQIDNO:1所示序列具有80%或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上或100%同一性的氨基酸序列。[0074]本发明提供一种水痘-带状疱疹病毒脂质纳米颗粒mRNA疫苗在制备用于预防水痘-带状疱疹病毒感染的预防性药物中的应用。[0075]本发明的水痘-带状疱疹病毒脂质纳米颗粒mRNA疫苗包含编码水痘-带状疱疹病特定的阳离子脂质并与非-阳离子脂质及聚乙二醇(PEG)-脂质组合制备脂质纳米颗粒，实验发现具有良好的体外稳定性并能激发更强的免疫反应。[0076]本发明相比现有技术的有益效果为：[0077]1、采用本发明所述的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒，其包封率显著优于已上市的阳离子脂质；[0078]2、采用本发明所述的脂质纳米颗粒制得的水痘-带状疱疹病毒脂质纳米颗粒mRNA疫苗，其引起的体液免疫反应及细胞免疫反应显著优于已上市的阳离子脂质；[0079]3、本发明所述的水痘-带状疱疹病毒脂质纳米颗粒mRNA疫苗可有效促进抗原提呈细胞吞噬和高效递送抗原，并实现疫苗的缓释持续刺激机体产生针对VZV-gE特异的细胞免疫应；[0080]4、本发明所述的水痘-带状疱疹病毒脂质纳米颗粒mRNA疫苗与已上市的带状疱疹附图说明[0081]图1所示为BALB/c小鼠免疫程序。[0082]图2不同阳离子脂质包封后脂质纳米颗粒mRNA疫苗检测结果。[0083]图3血清IgG抗体滴度(Log值)。[0084]图4所示为BALB/c小鼠模型上ICS法检测IFNγ分泌T细胞频数。[0085]图5所示为BALB/c小鼠模型上ELISPOT法检测IFNγ分泌T细胞频数。[0086]图6所示为C57BL/6小鼠免疫程序。[0087]图7所示为C57BL/6小鼠模型上ELISA法检测gE特异性IgG滴度。[0088]图8所示为C57BL/6小鼠模型上ICS法检测IFNγ分泌T细胞频数。[0089]图9所示为C57BL/6小鼠模型上ELISPOT法检测IFNγ分泌T细胞频数。[0090]图10所示为C57BL/6小鼠模型上ICS法检测特异性分泌TNFa、IFNγ、IL-2、IL-4和[0091]图11所示为C57BL/6小鼠模型上ICS法检测特异性分泌TNFa、IFNγ、IL-2、IL-4和具体实施方式[0092]下面将结合本发明的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0093]实施例1[0094]化合物1的合成[0098]将6-溴正己醇(0.91g,5.0mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(0.90g,7.5mmol),再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(1.20g,6.0mmol),反应室温搅拌3h,在此反应液中加入2-己基癸醇(1.36g,5.6mmol),混合物在室温下搅拌过夜，TLC显示反应完滤并浓缩，柱层析分离得到6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯1a(1.53g,淡黄色油状物),产率1氨基-1-丁醇(89.2mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83到产物1(454mg,淡黄色油状物),产率55%。3.55(m,2H),2.47-2.42(m,6H),1.72-1.67(m,10H),1.53-1.48(m,8H),1.45210mmol),再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(1.11g,5.5mmol),反应室温搅拌3h,在此反应液[0114]室温条件下，将7-溴庚基十七烷-9-基碳酸酯(2a)(1.38g,3mmol)溶于20mL乙醇干燥，浓缩得到产品十七烷-9-基(7-((2-羟乙基)氨基10mmol),再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(1.11g,5.5mmol),反应室温搅拌3h,在此反应液析分离得到5-溴戊基十一烷基碳酸酯2c(1.20g,淡黄色油状物),产率66%。2[0122]将十七烷-9-基(7-((2-羟乙基)氨基)庚基)碳酸酯(457mg,1.0mmol)溶于四氢呋5.4Hz),2.94(br,1H),2.58(t,2H,J=5.4Hz),2.45(t,4H,J=5.7Hz),1.[0130]将6-溴正己醇(0.91g,5.0mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(0.90g,7.5mmol),再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(1.20g,6.0mmol),反应室温搅拌3h,在缩，柱层析分离得到6-溴己基十一烷基碳酸酯33[0134]将6-溴己基十一烷基碳酸酯基-1-丁醇(89.2mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃产物3(412mg,淡黄色油状物),产率60%。6H,J=8.4Hz),1.74-1.64(m,12H),1.63-1.53(m,5H),1.52-1.39(m,39H)[0142]将6-溴正己醇(0.91g,5.0mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(0.90g,7.5mmol),再分批次加入对硝基氯甲酸苯酯(1.20g,6.0mmol),反应室温搅拌3h,在此反应液中加入9-十七醇(1.44g,5.6mmol),混合物在室温下搅拌过夜，TLC显示反应完成并浓缩，柱层析分离得到6-溴己基十七烷-9-基碳酸酯4a(1.53g,淡黄色油状物),产率[0144]化合物4的合成4[0146]将6-溴己基十七烷-9-基碳酸酯(1.16g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，4-氨基-1-丁醇(89.2mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌16-20h。冷却至室温，过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢到产物4(502mg,淡黄色油状物),产率59%。=5.4Hz),2.49-2.44(m,6H),1.74-1.28(m,76H),0.90(t,12H,J[0149]实施例5[0150]化合物5的合成5[0152]将6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(1.12g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，乙醇胺(61.0mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌二氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到产物5 (487mg,淡黄色油状物),产率61%。2H,J=5.4Hz),2.58(t,2H,J=5.4Hz),2.46(t,4H,J=7.2Hz),1.72-1.65(m,6H),1.49-[0155]实施例6[0156]化合物6的合成[0158]将5-溴戊基十一烷基碳酸酯(910mg,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，乙醇胺(61.0mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌16-20h。冷却至室温，过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，得到的滤液氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到产物6(410mg,淡黄色油状物),产率65%。[0159]MSm/z(ESI):1H),2.57(t,2H,J=5.4Hz),2.45(t,4H,J=7.2Hz),1.7[0161]实施例7[0162]化合物7的合成7[0164]将6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(1.12g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，3-甲氧基丙胺(89mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌16-20h。冷却至室温，过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶物7(495mg,淡黄色油状物),产率60%。[0165]MSm/z(ESI):[0166]实施例8[0167]化合物8的合成8[0169]将6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(1.12g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，3-氨基丙腈(70mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌16-20h。冷却至室温，过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，得到的滤液中加入饱和碳(469mg,淡黄色油状物),产率58%。[0170]MSm/z(ESI):[0171]实施例9[0172]化合物9的合成9[0174]将6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(1.12g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(167mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌16-20h入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到产物9(546mg,淡黄色油状物),产率63%。[0175]MSm/z(ESI):[0176]实施例10[0177]化合物10的合成[0179]将6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(1.12g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，N-(4-氨基丁基)-乙酰胺盐酸盐(167mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到产物10(560mg,淡黄色油状物),产率69%。[0181]实施例11[0182]化合物11的合成[0184]8-溴-N-(十七烷-9-基)辛酰胺(11a)的合成[0186]将8-溴辛酸(1.12g,5.0mmol)溶于50mL二氯甲烷中，在0℃下分批加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.05g,5.5mmol),搅拌30min后，在反应液中逐滴加入9-氨基十七烷(1.28g,5.0mmol),滴加完毕后，混合物在室温下搅拌过夜，TLC显示反应完成后，用100ml水洗涤2次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到化合物11色油状物),产率82%。[0187]MSm/[0188]化合物11b的合成[0189]将8-溴-N-(十七烷-9-基)辛酰胺(1.15g,2.5mmol)溶于四氢呋喃中，加入乙腈，4-氨基-1-丁醇(89.2mg,1.0mmol),碳酸钾(550mg,4.0mmol),碘化钾(332mg,2.0mmol),在83℃下搅拌16-20h。冷却至室温，过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢到产物11b(534mg,淡黄色油状物),产率63%。[0190]MSm/z([0191]HNMR(300MHz,CDCl₃):88.10(s,2H),4.21(s,1H),3.4=6.2Hz),2.14(t,4H,J=4.8Hz),1.57-1.47(t,14H,J=6.3Hz),1.36-1.26(m,6[0192]化合物11的合成[0193]在0℃下，将化合物11b(1.70g,2mmol)缓慢加入四氢铝锂(379mg,10mmol)的无水过滤并浓缩，得到化合物11(1.45g,黄色油状物),产率90%。[0194]MSm/z([0195]HNMR(300MHz,CDCl₃):84.11(s,1H),3.44(t,2(t,6H,J=6.3Hz),2.52(t,4H,J=6.3Hz),2.48-2.43(m,2H),1.61-1.56(m,[0197]本发明分别使用阳离子脂质I～XIV制备脂质纳米颗粒核酸疫苗，14种阳离子脂质结构如下表。[0198]表2阳离子脂质结构式阳离子脂质IⅡ~~Ⅲ~~~CN116514672B说明书19/25页V从O从O~~X100mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)稀释水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗原液至浓度为150μg/ml,该疫苗原液含有编码水痘-带状疱疹病毒GE蛋白的mRNA抗原的氨基酸序列，抗原序脂质混合溶液；设定纳米药物制造设备总流速12ml/min、mRNA溶液与脂质混合溶液流速比3:1并开始包封，包封完成后，切向流过滤系统超滤换液收集样品，并加入蔗糖溶液。在N/P(可电离的阳离子脂质与核苷酸磷酸盐)摩尔比不同条件下进行试验(N/P摩尔比分别为3、[0203]表3不同阳离子脂质包封后脂质纳米颗粒mRNA疫苗检测结果样品包封率(%)平均粒径(nm)321/25页69[0207]由以上结果可以看出，在相同N/P条件下，阳离子脂质I、II、VI-XIV所制得的脂质纳米颗粒mRNA疫苗的包封率均高于阳离子脂质III、IV、V。阳离子脂质III的包封率略高于[0208]实施例13带状疱疹脂质纳米颗粒mRNA疫苗体液免疫评价[0209]将实施例12制备的样品1～14(A、B、C)分别在BALB/c小鼠模型上的进行体液免疫体滴度检测，检测结果如下表4及图3所示。[0211]表4不同阳离子脂质包封后脂质纳米颗粒mRNA疫苗抗体滴度样品血清IgG抗体滴度(Log值)369[0215]由上表的抗体滴度检测结果可以看出，阳离子脂质I、II、VI-XIV所制得的脂质纳[0216]实施例14带