（正式版）DB65∕T 4669-2023 《小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法》

小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重Detectionmethodofpestedespetitsruminantsvirusandorfvir2023-07-20发布2023-09-20实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1--2020《标准化工作导则第1产建设兵团畜牧兽医工作总站。苏晓慧、薛文、秦菊、努尔麦麦提阿穆提、居马别克夏拉巴依、马亚珍、符玉涓、艾日登才次克、李璐、张丹、沙那瓦尔塔希、任娟、美热木古丽巴依待拉提、乌那尔汗吉斯汗、孙晓明、冯冰、陈玲、高姗姗、颜成旭、陆桂丽、茹仙古丽木明、加米拉、加伊娜古力、特列克库拉别克。维吾尔自治区动物疾病预防控制中心(新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝病预防控制中心(北京市大兴区天贵大街17号)、北京亿森宝生物科技有限公司(北京市北京经济技术开发区(通州)科创东五街2号)、新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区冬融街726号)、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站(新疆乌鲁木齐市米东区米东南路2188号红光雅居小区7号公建楼)、新疆维吾尔自治市新华南路167号)。疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心(新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝疫病预防控制中心(北京市大兴区天贵大街17号)、新疆维吾尔自治区市场监督新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话传真邮编：830004新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心联系电话传真邮编：中国动物疫病预防控制中心联系电话传真邮编：100125北京亿森宝生物科技有限公司联系电话传真邮编：100176新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话传真邮编：830004工2规范性引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本4试剂和引物检测引物探针见附录B。5仪器用具与耗材6操作步骤选择处于发热期(体温40℃~41℃)、排出脓性、浆液性眼分泌物、出现口腔溃疡症状的活畜采工2(0.01mol/LpH7.4,PBS)中。将含有渗出物的棉拭子在微量振荡器上去拭子。12000r/min离心5min,吸取上清300山于1.5mL灭菌离心管中，编号备用。选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3个~4个，脾、胸腺、肠粘膜和肺组织各约25g~50g,分别置于50mL离心管或密封袋中。每份组织分别从三个不同位置取样，称取样品约1g,用手术剪剪碎的样品混匀后取0.1g装入研磨管，于高通量研磨仪中研磨，加入1.5mL0.01mol/LpH7.4PBS继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，12000样品采集后，放置有冰盒的采样箱里送至实验室，在24h内进行检测。6.3DNA/RNA的提取6.3.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μ,充分颠倒混匀，室温静置36.3.2将液体吸入吸附柱中，12000r/min离心30s。6.3.3弃去收集管中液体，加入600μ洗涤液，12000r/min离心30s。6.3.4重复上述步骤6.3.3。6.3.5弃去收集管中液体，12000r/min离心2min,以除去残留的洗涤液。6.3.6将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液60山。6.3.7室温静置2min,12000r/min离心1min,离心管中液体为核酸模板。得到的核酸模板尽量在2h内进行实时荧光扩增，若需长时间保存须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融。6.3.8若使用核酸提取仪提取核酸，则按DNA/RNA提取试剂盒说明书进行操作。6.4.1试验前20min从-20℃冰箱中取出试剂盒等相应试剂，使试剂完全溶解。6.4.2每个检测反应体系总量为15μ:14μ山的荧光PCR反应液，1L的酶混合物。6.4.3盖紧PCR反应管盖后将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻保存。6.5加样(样本准备区)6.5.1分别向上述PCR反应管中加入已提取样本核酸模板各5μ,阳性对照和阴性对照核酸模板各加5μL,记录加样顺序。36.5.2盖紧管盖，瞬时离心36.6.1开机预热，检查仪器性能。6.6.2将PCR反应管放在样品槽中相为：45℃10min,1个循环；95℃10min,1个循环；95℃15s,60℃45s,40个循环，在每性脓疱病毒阳性质粒作为阳性对照，同时以双蒸水代替模板作为阴性对照。分别提取样品和对照品的6.7.2.1阴性对照：无扩增曲线且Ct值>38或无Ct值。6.7.2.2阳性：Ct值≤30,有明显指数增长，呈典型的S型曲线。兽疫病毒和羊传染性脓疱病毒核酸。若在“FAM”标记下出现典型的扩增曲线且Ct值≤35,则判定样本中小反刍兽疫病毒核酸阳性。若在“HEX”标记下出现典型的扩增曲线且Ct值≤35,则判定样本中羊传染性若被检样本的PCR反应体系通道无典型扩增曲线，且Ct值>38或无Ct值，则判定样本小反刍兽疫病4(规范性)A.1pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)氯化钠氯化钾二水合磷酸氢二钠磷酸二氢钾灭菌双蒸水A.2EDTA-Na₂(0.5mol/L,pH=8.0)溶液配制灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水氯化钠11.70g三羟甲基氨基甲烷9.46g0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(EDTAA.4洗涤液磷酸二氢钾氯化钠灭菌双蒸水A.5洗脱液磷酸二氢钾灭菌双蒸水5(规范性)实时荧光PCR检测B.1引物序列根据已报道的PPRV和ORFV的基因组序列各设计1套用于特异性扩增的引物和探针，具体引物信息与基因片段大小见表B.1和B.2。表B.1小反刍兽医病毒引物序列及目的片段长度引物引物序列(5′→3)预期片段大小/bp引物探针FAM-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGC表B.2羊传染性脓疱病毒引物序列及目的片段长度引物引物序列(5′→3)预期片段大小/bp引物探针HE