影响生物转化的因素省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

影响生物转化主要原因第1页第二讲影响生物转化主要原因最正确微生物选择最正确反应条件确实立。第2页最正确微生物选择从现有最活泼菌株出发是相当主要。菌株取得路径：从此领域工作者或菌菌种保藏机构取得。从自然界取得。高产菌株取得，耗时、费劲。但一旦取得，其经济效益极佳。第3页寻找转化菌基本路径从自然界选种微生物对外界适应能力强，能在各种极端环境下生长繁殖，在自然界分布极为广泛。自然界野生微生物在漫长岁月里，经过自然选育形成含有适应各种恶劣环境本事。形成了独特代谢路径和调整技能及不一样酶和酶系统，从而来转化外界化合物。结论：野生微生物中蕴藏着各种新菌种和优良菌种宝库。第4页从生产中选种提升已知产物生产能力生产能力表示法：1.单位体积发酵液中产物量2.单位重量菌体干重所产生产物量3.每小时，单位体积发酵液中产物量4.每小时，单位重量菌体干重所产生产物量第5页最正确微生物应具备条件

1.采取生长快、培养基价廉及酶产量高菌株。2.使其它酶污染降至最低。3.菌株能生长在浓厚培养基中，便于提升产率。4.酶回收方法要简单易行。5.产品必须安全可用。6.生产过程中流出物要有经济核实及易于处理等技术。第6页最正确反应条件确实立一旦得到了优良菌株。为了最高生长量和酶产量，微生物生长参数必须最优化。包含：温度、pH、氧传递、微生物营养、无机盐起源、表面活性剂（尤其对胞外酶而言）使用等等第7页对优良转化菌株其它要求不论从自然界选种，还是从生产中选种，提升菌种生产能力并非唯一指标，除此之外还要求：1.应有较稳定遗传性。2.含有抗噬菌体能力。3.转化菌转化时，希望泡沫少。4.转化菌需氧量较低很好。5.转化菌应该有较高底物转化效率。6.转化菌应对培养基组分及前体有较高耐受性。7.生产菌株应该生长旺盛，产孢子菌株应有较强产孢子能力。8.菌株在发生转化时不产生或少产生副产品。第8页影响生物转化主要原因识别生长周期高峰酶合成调整诱导作用调整诱变防止代谢物阻遏作用渗透性辅代谢作用防止产物抑制作用第9页识别生长周期高峰

假如反应是按分批反应进行，必须确定酶含量最高生长阶段。普通在酶含量到达最高峰后，酶会快速地消失。第10页酶合成调整

为了培育用于某一生物转化优质细胞，在这种细胞内必须含有最高量适宜酶，所以酶合成调整是很主要。

诱导作用调整诱变第11页诱导作用

许多编码酶结构基因在酶作用基质不存在时，普通是无活性，酶生产正常地被阻遏。但当加入基质时，结构基因被开放，从而产生了酶。这么过程叫做诱导作用或脱阻遏作用，这种酶叫做可诱导酶。第12页诱导作用示意图第13页诱导物种类基质基质类似物产物第14页基质

尿素酶诱导物是尿素第15页基质类似物顺丁烯二酸顺反异构酶

基质：顺丁烯二酸诱导物：丙二酸第16页产物苄青霉素－6-氨基青霉烷酸如：加入苯醋酸转化作用增强。这里苯醋酸是反应产物之一，该反应是可逆。第17页调整诱变诱变作用可用来消除酶形成时对加入诱导物依赖性－调整诱变第18页突变位置与效果突变位置不一样，效果也不一样。突变位置：调整基因消除活性阻遏物合成操纵基因失去结合阻遏物能力此时，诱导物就不被需要。没有诱导物时，正常产生诱导酶突变体被称为组成突变体。

第19页组成突变体选择方法将经受诱变细胞群体接种在含有非诱导物基质作为唯一碳源琼脂培养基中，只有组成突变体能够生长。在恒化器中，用含有限量浓度基质诱导物，可选择出不再需要－半乳糖苷诱导物而且能产生高浓度－半乳糖苷酶大肠杆菌突变体第20页防止代谢物阻遏作用例一苄青霉素转化为6-氨基青霉烷酸该过程受葡萄糖、果糖或甘油阻遏。例二顺丁烯二酸转化为反丁烯二酸过程草酰乙酸、苹果酸、反丁烯二酸有阻遏作用第21页渗透性一些生物转化进行依赖于细胞渗透性改变，主要表现在不易渗透基质产物被磷酸化化合物第22页渗透性改变渗透性可借助诱变作用或改变环境而增强或减弱，主要包含限制性生物素加入或Mn2+第23页产物被磷酸化化合物比如嘧啶（或嘌呤）合成对应核苷酸，在此过程中，极难用正常细胞来完成。以Mn2+一个限速生长浓度生长时，则细胞膜组分发生改变，结果所需酶及隶属基质（磷酸核糖焦磷酸），从细胞内漏出，所以，对催化生物转化过程有效。用这么细胞可进行以下转化作用第24页渗透性改变转化实例次黄嘌呤－次黄苷－5'－单磷酸烟酸－烟酸单核苷酸腺嘌呤－腺苷－5'－单磷酸鸟嘌呤－鸟苷－5'－单磷酸当然这种方法也可用来生产核苷－5‘－二磷酸、核苷－5’－三磷酸第25页不易渗透基质转化一些基质不溶性，显然在生物转化中带来困难。第26页改变基质不溶性方法将不溶性基质变成可利用基质惯用方法普通有：加入精细分散悬浮液加入Tween80加入可溶性络合物与酯类等。比如：在转化甾体化合物时，加入环硼酸盐络合物，可使甾类化合物溶解度增加20,000倍。第27页辅代谢作用在许多生物转化中经常存在两种基质1.用于微生物生长－基质12.被转化为所需产物－基质2比如pseudomonas在含有正十六烷培养基中，能将正－戊基苯转化为苯丙烯酸。其中正十六烷能促进pseudomonas生长。辅代谢技术在生物转化用昂贵基质时，是很经济。而且还能转化不能支持微生物生长物质。第28页防止产物抑制作用有时生物转化受产物抑制是一个主要问题。末端产物阻遏作用亦称之为反馈阻遏。

细胞内物质代谢反应链中，一些中间代谢物或末端产物过量累积，阻遏了代谢路径中一些酶合成现象。第29页产物抑制作用实例细菌合成色氨酸当菌体内有少许色氨酸时，调整蛋白为非活性，不能与操纵基因结合，当环境中有大量色氨酸时，无活性阻遏蛋白与色氨酸结合，形成活性阻遏蛋白，使转录进行不能，从而抑制色氨酸合成。AEⅠBCDE色氨酸第30页第三章介绍生物转化常见反应类型以甾体化合物生物转化为例进行阐述甾体化合物和甾体药品介绍甾体化合物结构

甾类化合物常见种类第31页甾体化合物和甾体药品介绍1952年，美国普强药厂Morray和Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为11

黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药品生产中主要性。微生物几乎对甾体每个位置都能进行转化。几个主要甾体微生物转化发应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物主要伎俩第32页甾体化合物一类含有环戊烷多菲核化合物在甾核第10，13位经常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部分双键；17位有不一样测链。第33页当前甾体微生物转化中受到人们广泛关注领域将微生物基因工程新技术应用于甾体微生物转化提升水不容性底物溶解度细胞和酶固定化以利于酶重复经济利用发展经济有效产物连续回收方式将环糊精等应用于培养基以提升产量第34页甾体化合物结构第35页甾体化合物编号第36页甾类化合物常见种类

动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可松）、皮脂酮等睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。

植物中：薯芋皂豆甾醇

酵母细胞：麦角固醇第37页甾体类激素药肾上腺皮脂激素类可松、强松、氢化可松

功效：抗炎、抗毒、抗过敏对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗作用。生殖腺激素孕酮、雌酮

功效：调整内分泌人工合成避孕药长期有效孕酮等第38页微生物在甾体药品生产中应用

主要分为两大类将天然原料转化为生产甾体化合物普通中间体。如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基降解甾醇边链生成有用甾体化合物中间体，雄甾－4－烯－3，17－二酮；雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮。转化成特殊甾体化合物中间体，以生产我们所需要产物。如：甾体11

，11

及16

羟化，∆1脱氢甾体边链降解第39页微生物对甾体化合物转化微生物对甾体化合物转化各种多样它们对甾体每一位置上原子或基团都有可能进行生物转化。其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。包含甾体母核上和测链上某个位置羟基化、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、形成内酯、侧链断裂、降解。第40页羟基化反应是甾体微生物转化中最主要反应。化学法除了较轻易在C17引入羟基外，在其它位置都极难引入羟基。第41页微生物对甾体羟基化作用微生物能在甾体任何位置进行羟基化发应，也可在非甾类有机分子上羟基化。简单羟基化作用是在甾体某个位置上引入O原子。在甾核上最少有21个位置能够发生。11位羟基化作用最主要，11位C氧化对可松药品疗效是不可缺乏，11，11。除11位C进行羟基化反应外，9

，14

，16

羟基化，在制备甾体药品时，生产皮质甾类化合物及其类似物。第42页进行甾体羟基化作用微生物转化物质作用位置微生物代表孕酮11

11

黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等弯曲孢霉化合物S11

11

黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲霉假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头霉11脱氧皮脂酮11

弯月弯孢霉雌二醇16

巨大芽孢杆菌第43页羟基化反应机理第44页羟基化反应因为这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，所以被定义位单氧化酶。这种细胞色素p450依赖单氧化酶存在于几乎全部形式生命体中，以游离或膜结合形式存在。第45页同位素试验证实第46页甾体羟基化中存在问题第47页其它主要羟基化反应地索高诺酮（destogestrel）新型避孕药（荷兰Organon企业推出）作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠我国研究：上海医科大学史纪平19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－双酮―――11

羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键中间体简化合成路线，降低副反应。底物：0.2%转化率：36％第48页甾体边链降解第49页甾体边链降解甾体母核降解第50页第51页3

－羟基－∆5甾醇

9

羟基化，∆1，2脱氢3－酮－∆4化合物微生物种类不一样∆1，2脱氢，9

羟基化第52页

甾体边链降解采取类似脂肪酸氧化氧化过程，最终形成C17酮甾体。第53页第54页选择性甾体边链降解办法1对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核降解

比如：1965Sih等将胆固醇先行改造为19羟基衍生物再经一步微生物转化为A环芳香化雌酚酮。

第55页选择性甾体边链降解办法2加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C1，2脱氢酶和9

羟化酶。如：NiCoPbSe8－羟基喹啉应用于各种分枝杆菌对胆固醇选性边链降解金属鳌合剂2，2－双联吡啶抑制母核降解第56页选择性甾体边链降解办法3（3）对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链突变株比如：原始菌株经诱变为诱变菌株Mycobacteriumsp，NRRL-B3683不加抑制剂，便产生雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）再诱变得Mycobacteriumsp，NRRL-B3805，无C1，2脱氢酶能产生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD）第57页基因工程新技术应用专利：Pseudomonas菌株无降解甾体能力将MycobacteriumspNRRL-3683DNA导入Pseudomonas菌株中取得重组菌。重组菌可在水相，一个或几个有机相中进行转化反应。Pseudomonas菌株比MycobacteriumspNRRL-3683生长输率快结果加紧转化进程，降低成本。第58页方法分离纯化MycobacteriumspNRRL-3683DNA整合到特定质粒载体中导入

噬菌体中用入

噬菌体感染E。coliHB101，得E。coli重组子三亲杂交实现MycobacteriumspNRRL-3683DNA到P