基于人胃癌微小癌巢体外模型的高效抗肿瘤免疫细胞筛选探究

基于人胃癌微小癌巢体外模型的高效抗肿瘤免疫细胞筛选探究一、引言1.1研究背景与意义胃癌作为全球范围内常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。据统计，其发病率在各类癌症中位居前列，死亡率也居高不下。中国是胃癌高发国家，每年新增病例众多，且多数患者确诊时已处于中晚期，治疗效果不佳，5年生存率较低。早期胃癌患者，手术治疗后的5年生存率超过90％，其中始发阶段小胃癌及微小胃癌的10年生存率可达100％，但我国早期诊断率较低，这使得胃癌的防治形势更为严峻。在胃癌的研究与治疗探索中，体外模型发挥着不可或缺的作用。传统的胃癌细胞生物学及抗肿瘤方法的体外研究，多基于肿瘤细胞的平面培养模型。然而，体内肿瘤细胞间及肿瘤组织周围存在细胞外基质围绕，且呈三维立体模式生长。平面培养模型无法全面、真实地反映体内肿瘤生长状态，在免疫细胞抗肿瘤能力实验中，平面培养模型中免疫细胞与肿瘤细胞直接接触的情况，与体内实际状况不符。因此，构建能较好模拟体内肿瘤生长状态的体外肿瘤模型迫在眉睫。免疫细胞治疗作为一种新兴的肿瘤治疗策略，为胃癌患者带来了新的希望。不同免疫细胞在抗肿瘤过程中发挥着各自独特的作用，如细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够特异性识别并杀伤肿瘤细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）具有增殖能力强、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点；自然杀伤细胞（NK）可非特异性地杀伤肿瘤细胞，在肿瘤免疫监视中发挥关键作用。通过筛选高效抗肿瘤免疫细胞，能够增强机体对肿瘤细胞的免疫攻击，提高治疗效果，延长患者生存期，改善患者生活质量。本研究致力于建立胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型，该模型以胶原为支架材料，模拟体内细胞外基质环境，人胃低分化腺癌BGC-823细胞为种子细胞，形成三维立体生长的微小癌巢，更贴近体内肿瘤生长的真实状态。利用此模型筛选高效抗肿瘤免疫细胞，能够更准确地评估免疫细胞在体内环境下对肿瘤细胞的杀伤能力，为胃癌的免疫治疗提供更具针对性和有效性的策略，具有重要的理论意义和临床应用价值，有望推动胃癌治疗领域的发展，为众多胃癌患者带来福音。1.2国内外研究现状在胃癌研究领域，体外模型的构建与免疫细胞治疗一直是国内外学者关注的重点。国外方面，对体外模型的探索不断深入。如美国学者[具体人名1]利用3D生物打印技术，以明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶为材料构建胃癌模型，该模型能精确模拟临床肿瘤特征，再现关键的癌症标志，包括细胞增殖、侵袭、迁移、血管生成和Warburg效应，在确定治疗靶点和预测患者特异性反应方面发挥了关键作用。欧洲的研究团队[具体团队名1]则致力于开发微流控芯片肿瘤模型，通过模拟肿瘤微环境中的流体力学和细胞间相互作用，为研究肿瘤生长和转移提供了新的视角。在免疫细胞治疗研究上，美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员[具体人名2]通过基因工程技术改造T细胞，使其能够更有效地识别和杀伤胃癌细胞，在临床试验中取得了一定的疗效。德国的科研团队[具体团队名2]则专注于自然杀伤细胞（NK）的研究，通过优化NK细胞的培养和激活条件，提高其对胃癌细胞的杀伤活性。国内的相关研究也取得了显著成果。中国医科大学的李凯团队首次在3D生物打印中利用GelMA水凝胶构建生理相关的胃癌模型，该模型的基因表达特征与真实肿瘤组织和患者来源的异种移植（PDX）模型的基因表达特征非常相似，在高通量药物筛选和临床药物模拟方面展现出有效性。复旦大学的研究团队通过对肿瘤芯片进行免疫组化，发现树突状细胞相关C型凝集素-1（Dectin-1）在胃癌肿瘤组织中高度表达，且其细胞丰度与患者的疾病进展和不良预后有关，阻断Dectin-1可重新规划肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），重新激活T细胞的抗肿瘤免疫反应，为胃癌免疫治疗提供了新的潜在靶点。解放军总医院的研究人员以胶原为支架材料，人胃低分化腺癌BGC-823细胞为种子细胞，成功构建了胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型，该模型中肿瘤细胞呈立体生长，能较好地模拟体内肿瘤生长状态，可用于抗肿瘤药物及免疫活性细胞的体外筛选。尽管国内外在胃癌体外模型构建和免疫细胞治疗方面取得了诸多进展，但仍存在一些不足与空白。现有体外模型在模拟肿瘤微环境的复杂性方面仍有待提高，难以完全重现体内肿瘤生长的所有生理和病理过程。在免疫细胞治疗中，免疫细胞的靶向性和持久性问题尚未得到根本解决，部分免疫细胞在体内的存活时间较短，难以持续发挥抗肿瘤作用。不同免疫细胞之间的协同作用机制研究还不够深入，如何优化免疫细胞的组合和治疗方案，以提高治疗效果，仍需要进一步探索。针对这些问题，未来的研究需要综合运用多学科技术，深入探究肿瘤微环境与免疫细胞的相互作用机制，开发更加精准、有效的体外模型和免疫细胞治疗策略。1.3研究目的与创新点本研究旨在构建一种能够高度模拟体内肿瘤生长状态的胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型，并利用该模型筛选出具有高效抗肿瘤能力的免疫细胞，为胃癌的免疫治疗提供更精准、有效的策略。具体而言，通过以胶原为支架材料，模拟体内细胞外基质环境，将人胃低分化腺癌BGC-823细胞作为种子细胞，使其在三维空间中生长形成微小癌巢，以实现对体内肿瘤生长的真实再现。在此基础上，对多种免疫细胞，如细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、自然杀伤细胞（NK）等，在该模型中的抗肿瘤能力进行系统评估和比较，从而筛选出最具潜力的高效抗肿瘤免疫细胞。本研究的创新点主要体现在模型构建和筛选方法两个方面。在模型构建上，创新性地采用胶原作为支架材料。胶原是体内细胞外基质的主要成分之一，具有良好的生物相容性和生物降解性。与其他常用的支架材料相比，胶原能够为肿瘤细胞提供更接近体内环境的物理和化学信号，促进肿瘤细胞的三维立体生长，形成更真实的微小癌巢结构。这种基于胶原的模型构建方法，相较于传统的平面培养模型以及一些采用非生理材料构建的三维模型，能更准确地模拟体内肿瘤生长的微环境，包括细胞间相互作用、营养物质和氧气的扩散等，为研究免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用提供了更可靠的平台。在免疫细胞筛选方法上，本研究利用构建的独特体外模型，进行多维度的评估。不仅观察免疫细胞对肿瘤细胞的直接杀伤效果，还深入研究免疫细胞在模拟体内微环境中的迁移、浸润能力，以及与肿瘤细胞相互作用后引发的免疫反应变化。通过综合分析这些因素，能够更全面、准确地评价免疫细胞的抗肿瘤能力，筛选出真正在体内具有高效抗肿瘤作用的免疫细胞。这种多维度的筛选方法，弥补了以往研究中仅关注单一指标的不足，为免疫细胞治疗胃癌的研究提供了新的思路和方法，有望提高免疫细胞治疗的效果和临床应用价值。二、人胃癌微小癌巢体外模型的构建2.1实验材料准备本实验所需的细胞系为人胃低分化腺癌BGC-823细胞，购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），该细胞系具有低分化腺癌的典型特征，在胃癌研究中应用广泛，能较好地代表胃癌细胞的生物学特性。实验试剂方面，胶原溶液购自Sigma公司，规格为10mg/mL，其作为支架材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，能够为肿瘤细胞提供接近体内细胞外基质的生长环境。RPMI1640培养基购自Gibco公司，用于细胞的培养，该培养基含有细胞生长所需的多种营养成分，能满足BGC-823细胞的生长需求。胎牛血清（FBS）购自HyClone公司，在培养基中添加适量的FBS，可为细胞提供生长因子、激素等营养物质，促进细胞的生长和增殖。胰蛋白酶购自Amresco公司，规格为0.25%，用于细胞的消化传代，可使贴壁生长的细胞从培养瓶壁上脱离下来，便于进行后续的实验操作。噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司，为粉末状，使用时需配制成5mg/mL的溶液，MTT比色法是一种常用的检测细胞增殖和细胞活性的方法，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，通过测定甲瓒的生成量可间接反映细胞的增殖情况。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，用于对模型进行组织学观察，能够清晰地显示细胞和组织的形态结构，便于分析肿瘤细胞在模型中的生长和分布情况。实验仪器设备包括CO₂培养箱（ThermoScientific公司），用于维持细胞培养所需的温度（37℃）、湿度（95%）和CO₂浓度（5%），为细胞提供适宜的生长环境；倒置显微镜（Olympus公司），可用于实时观察细胞的生长状态、形态变化等；酶标仪（Bio-Rad公司），在MTT比色法中用于测定吸光度值，从而计算细胞增殖率；离心机（Eppendorf公司），用于细胞悬液的离心分离，如在细胞消化后，通过离心去除上清液中的胰蛋白酶，收集细胞沉淀进行后续操作；超净工作台（苏州净化设备有限公司），为细胞培养等实验操作提供无菌环境，防止微生物污染。2.2模型构建方法在超净工作台中，首先将胶原溶液用无菌的0.1mol/LNaOH溶液和无菌去离子水进行稀释，调整其浓度至适宜范围，一般为3-5mg/mL，具体操作时，按照一定比例缓慢混合，同时用移液器轻轻吹打均匀，以确保胶原溶液的浓度准确且均匀分布。取对数生长期的人胃低分化腺癌BGC-823细胞，用0.25%胰蛋白酶进行消化。在显微镜下观察，当细胞开始变圆并逐渐脱离培养瓶壁时，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化。然后将细胞悬液转移至离心管中，以1000r/min的转速离心5min，使细胞沉淀。弃去上清液，用适量的RPMI1640培养基重悬细胞，制成细胞密度为1×10⁶-5×10⁶个/mL的细胞悬液，在制备过程中，需使用细胞计数板准确计数细胞数量，以保证细胞悬液浓度的准确性。将稀释好的胶原溶液与细胞悬液按照一定比例（通常为3:1-5:1）混合均匀，使细胞均匀分布在胶原溶液中。例如，取3mL胶原溶液与1mL细胞悬液充分混合，混合时动作要轻柔，避免产生过多气泡，可采用轻轻颠倒混匀的方式。然后将混合液迅速加入到24孔细胞培养板中，每孔加入0.5-1mL，尽量使混合液均匀铺展在孔底。将加入混合液的培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育30-60min，使胶原凝固形成三维支架结构，将细胞固定其中。在孵育过程中，要保持培养箱的稳定，避免震动，以确保胶原能够均匀凝固，为细胞提供稳定的生长环境。待胶原凝固后，向每孔中缓慢加入适量的RPMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗），培养基的添加量以刚好覆盖胶原支架为宜，约为1-2mL，添加时需注意避免冲散胶原支架和细胞，可沿孔壁缓慢滴加。将培养板继续放回培养箱中培养，定期更换培养基，一般每2-3天更换一次，以维持细胞的生长环境，提供充足的营养物质，同时去除代谢废物。2.3模型生长状态观察在模型构建完成后的培养过程中，定期使用倒置显微镜对模型中肿瘤细胞的生长状态进行观察。于培养的第1天，可见细胞均匀分布于胶原基质中，细胞形态较为规整，呈圆形或椭圆形，折光性良好，部分细胞开始伸出伪足，与周围的胶原纤维和其他细胞产生初步的接触。随着培养时间的延长，到第3天，细胞数量明显增多，细胞之间的连接更加紧密，开始聚集成小团块状，在胶原基质中呈现出立体生长的趋势，部分区域的细胞团开始形成微小癌巢的雏形。培养至第5天，微小癌巢结构更加明显，癌巢内细胞排列紧密，形态多样，包括多边形、梭形等，癌巢周边的细胞仍在不断增殖并向周围扩展。到第7天，微小癌巢进一步增大，相互之间也出现了一定的融合现象，整个胶原基质中布满了大小不一的癌巢结构，此时细胞生长状态依旧良好，未见明显的细胞凋亡或坏死现象。采用MTT法对模型中肿瘤细胞的生长曲线进行测定。在培养的第1-2天，由于细胞需要适应新的三维培养环境，处于潜伏期，细胞增殖较为缓慢，吸光度（A）值增长不明显。从第3天开始，细胞进入对数生长期，A值随时间快速上升，表明细胞增殖活跃，数量急剧增加。在第5-6天，细胞增殖速度达到峰值，A值增长幅度最大，此时细胞代谢旺盛，对营养物质的需求也相应增加。到第7天，细胞生长逐渐进入平台期，A值增长趋于平缓，这可能是由于营养物质逐渐消耗，代谢废物积累，以及细胞之间的相互接触抑制等因素，导致细胞增殖速度减缓。通过对不同时间点A值的测量和分析，绘制出肿瘤细胞在胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型中的生长曲线，直观地展示了细胞的生长动态过程。为了更深入地了解模型中肿瘤细胞的生长和组织结构，对培养7天的模型进行HE染色。将模型从培养板中取出，经过固定、脱水、包埋、切片等一系列处理后，进行HE染色。在显微镜下观察染色后的切片，可见胶原基质被染成淡红色，其中分布着大量的微小癌巢。微小癌巢内的肿瘤细胞被染成蓝紫色，细胞核大且深染，细胞质丰富，细胞排列紧密，呈现出典型的癌细胞形态特征。癌巢的边界相对清晰，与周围的胶原基质有明显的区分。在癌巢内部，还可以观察到细胞之间存在着紧密的连接和相互作用，部分区域可见细胞的分裂象，表明癌巢内的细胞具有较强的增殖能力。此外，通过对切片的观察，还能发现胶原基质中存在一些空隙和通道，这些结构可能为营养物质的运输和细胞的迁移提供了条件，进一步证实了该模型能够较好地模拟体内肿瘤生长的微环境。2.4模型与其他培养模型的比较传统的平面培养模型是将肿瘤细胞直接接种于培养皿或培养瓶表面进行培养，细胞在二维平面上生长，这种培养方式操作简单、成本较低，且便于观察和检测。然而，平面培养模型存在诸多局限性。在体内，肿瘤细胞处于复杂的三维微环境中，细胞外基质、细胞间相互作用以及营养物质和氧气的梯度分布等因素对肿瘤细胞的生长、增殖、分化和转移等生物学行为产生重要影响。而平面培养模型无法模拟这些体内微环境因素，肿瘤细胞在平面上的生长状态与体内实际情况差异较大。例如，平面培养模型中细胞间的连接方式和相互作用强度与体内肿瘤组织中的情况不同，这可能导致细胞的信号传导通路和基因表达谱发生改变，从而影响对肿瘤细胞生物学特性的准确研究。此外，在免疫细胞抗肿瘤能力实验中，平面培养模型中免疫细胞与肿瘤细胞直接接触，缺乏细胞外基质的阻隔和调节作用，与体内免疫细胞需要穿过细胞外基质才能到达肿瘤细胞的实际情况不符，使得实验结果难以准确反映免疫细胞在体内的抗肿瘤效果。胶原铺板培养模型是在培养皿表面先铺一层胶原，然后将肿瘤细胞接种于胶原上进行培养。与平面培养模型相比，胶原铺板培养模型在一定程度上改善了细胞的生长环境，提供了类似于体内细胞外基质的物理支撑。胶原作为细胞外基质的主要成分之一，能够与细胞表面的受体相互作用，调节细胞的黏附、迁移和增殖等行为。在胶原铺板培养模型中，肿瘤细胞可以更好地附着和伸展，细胞形态和生物学行为更接近体内状态。然而，该模型仍然存在一些不足。胶原铺板后形成的是相对平坦的结构，虽然细胞可以在胶原上生长，但无法形成真正意义上的三维立体结构，细胞间的相互作用和空间分布仍与体内肿瘤组织存在差异。此外，胶原铺板培养模型中，营养物质和代谢产物在二维平面上的扩散方式与体内三维环境中的情况不同，可能会影响细胞的代谢和生长。本研究构建的胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型具有显著优势。在该模型中，肿瘤细胞被均匀包埋在胶原基质中，能够在三维空间中自由生长和相互作用，形成多个微小癌巢结构。这种三维立体的生长方式更贴近体内肿瘤的实际生长状态，细胞间的连接和相互作用更加紧密和复杂，能够更好地模拟体内肿瘤组织的组织结构和生物学特性。从细胞活性方面来看，通过MTT法测定细胞增殖曲线发现，第7天平面培养模型、胶原铺板培养模型和胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型A496值分别为0.608、0.584和0.728，胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型的A496值显著高于其他两个模型（P<0.05），表明该模型能够较长时间维持细胞活性，为肿瘤细胞的生长提供了更适宜的环境。在组织学观察上，HE染色切片显示胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型的基质中有较多微小癌巢形成，癌巢内细胞排列紧密，形态多样，与周围的胶原基质相互交织，更真实地再现了体内肿瘤组织的形态结构。而平面培养模型和胶原铺板培养模型在组织学结构上与体内肿瘤组织的相似度较低。综上所述，胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型在模拟体内肿瘤生长状态方面具有明显优势，为胃癌的研究以及免疫细胞抗肿瘤能力的评估提供了更可靠的实验平台。三、不同免疫细胞在模型中的抗肿瘤能力研究3.1实验细胞准备3.1.1CIK细胞的获取与培养CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，在肿瘤免疫治疗中具有重要应用前景。本实验中，CIK细胞的获取来自健康志愿者的外周血。首先，使用一次性采血器从志愿者肘静脉采集外周血50-100mL，置于含有抗凝剂（如肝素钠）的采血管中，轻轻颠倒混匀，防止血液凝固。将采集的外周血尽快转移至实验室，在超净工作台内进行后续操作。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），具体步骤如下：将外周血缓慢加入到装有淋巴细胞分离液的离心管中，注意保持界面清晰，避免血液与分离液混合。然后将离心管放入离心机中，以2000r/min的转速离心20min。离心后，管内液体分为三层，上层为血浆，中层为淋巴细胞分离液，下层为红细胞和粒细胞。使用移液器小心吸取中层与上层界面的白色云雾状单个核细胞层，转移至新的离心管中。加入适量的无菌PBS溶液，轻轻吹打混匀，以1500r/min的转速离心10min，弃去上清液，重复洗涤2-3次，以去除残留的淋巴细胞分离液和血浆成分，获得纯净的PBMC。将分离得到的PBMC用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度至1×10⁶-2×10⁶个/mL。将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，每瓶接种5-10mL，然后向培养瓶中加入终浓度为1000U/mL的IFN-γ，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h。24h后，向培养瓶中加入抗CD3单克隆抗体，使其终浓度为50ng/mL，同时加入IL-2，使其终浓度为300U/mL。之后每2-3天半量换液并补充IL-2，维持其终浓度为300U/mL。在培养过程中，每天使用倒置显微镜观察细胞的生长状态，可见细胞逐渐增殖，形态多样，包括圆形、椭圆形、梭形等，部分细胞聚集成团。培养至第14-21天，CIK细胞数量扩增明显，活性良好，可用于后续实验。通过流式细胞术检测CIK细胞的表型，结果显示CD3+CD56+细胞比例显著增加，表明CIK细胞培养成功。3.1.2CTL细胞的获取与培养CTL细胞，即细胞毒性T淋巴细胞，主要负责识别并杀死被病毒感染的细胞或癌细胞，在抗肿瘤免疫中发挥着关键作用。本实验中CTL细胞的获取同样来自健康志愿者的外周血。首先通过密度梯度离心法从外周血中分离出PBMC，方法与CIK细胞获取中PBMC的分离方法相同。将分离得到的PBMC用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度至2×10⁶个/mL。将细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1mL。向培养板中加入负载有人胃低分化腺癌BGC-823细胞抗原的树突状细胞（DC），DC与PBMC的比例为1:10。同时加入细胞因子IL-2，使其终浓度为50U/mL，IL-7终浓度为10ng/mL，IL-15终浓度为10ng/mL。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在培养过程中，每隔2-3天半量换液并补充细胞因子，维持其浓度。培养至第7-10天，部分T细胞开始活化、增殖，逐渐分化为CTL细胞。通过流式细胞术检测细胞表面标志物CD8、CD3等，以鉴定CTL细胞，结果显示CD8+CD3+细胞比例逐渐升高。为进一步检测CTL细胞的杀伤活性，进行细胞毒性试验，将CTL细胞与靶细胞（人胃低分化腺癌BGC-823细胞）按不同比例（如5:1、10:1、20:1）共培养，采用LDH释放法检测CTL细胞对靶细胞的杀伤率。结果表明，随着CTL细胞与靶细胞比例的增加，靶细胞的杀伤率逐渐升高，说明培养得到的CTL细胞具有良好的杀伤活性，可用于后续实验。3.2免疫细胞与肿瘤细胞共培养实验将培养至对数生长期的人胃癌微小癌巢体外模型从培养箱中取出，在超净工作台内进行操作。分别取培养好的CIK细胞、CTL细胞和NK细胞，用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基调整细胞浓度至不同梯度，如1×10⁶个/mL、5×10⁶个/mL、1×10⁷个/mL，以便研究不同细胞浓度对肿瘤细胞的作用效果。对于共培养体系，采用直接共培养的方式，将不同免疫细胞以一定比例加入到含有胃癌微小癌巢模型的24孔细胞培养板中。具体比例设置为免疫细胞与肿瘤细胞的数量比分别为5:1、10:1、20:1。例如，当免疫细胞浓度为1×10⁷个/mL，肿瘤细胞数量以每个癌巢内约1×10⁶个细胞计算，若比例为10:1，则向每孔加入100μL免疫细胞悬液和100μL含有肿瘤细胞的胶原包埋液。在加入免疫细胞时，需缓慢滴加，避免冲散癌巢结构，尽量使免疫细胞均匀分布在癌巢周围。共培养条件设定为37℃、5%CO₂，此条件模拟人体内部的生理环境，有利于细胞的生长和相互作用。培养箱内保持95%的湿度，以防止培养基蒸发，维持细胞生长所需的水分环境。共培养时间设置为24h、48h和72h，通过设置不同的时间点，能够动态观察免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用随时间的变化情况。在培养过程中，每天使用倒置显微镜观察共培养体系中细胞的形态变化和生长状态。可见在共培养初期，免疫细胞逐渐向癌巢靠近，部分免疫细胞开始与肿瘤细胞接触。随着时间的推移，在48h左右，可观察到癌巢周边的肿瘤细胞出现形态改变，如细胞变圆、体积缩小等，提示肿瘤细胞可能受到免疫细胞的攻击。到72h时，癌巢结构出现明显的破坏，肿瘤细胞数量减少，部分区域的癌巢甚至出现解体现象。同时，还能观察到免疫细胞的形态和分布也发生变化，部分免疫细胞聚集在癌巢周围，呈现出活跃的免疫反应状态。3.3抗肿瘤能力检测方法在共培养体系中，利用倒置显微镜定期对免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用情况进行观察，能够直观地获取细胞形态、分布和生长状态的变化信息。在共培养初期，免疫细胞均匀分布于培养基中，呈现出圆形或椭圆形的形态，折光性良好，且具有一定的运动能力，能够在培养基中自由游动。肿瘤细胞则紧密聚集在微小癌巢内，细胞形态多样，包括多边形、梭形等，癌巢结构完整，边界清晰。随着共培养时间的延长，在24h左右，可观察到部分免疫细胞开始向癌巢靠近，它们通过伸出伪足等方式与癌巢周边的肿瘤细胞进行接触。免疫细胞与肿瘤细胞接触后，可观察到肿瘤细胞的形态发生改变，如细胞体积缩小、变圆，细胞膜出现皱缩等，这可能是由于免疫细胞对肿瘤细胞发起攻击，导致肿瘤细胞的生理功能受到影响。到48h时，癌巢周边的肿瘤细胞损伤更为明显，部分细胞开始脱离癌巢，进入培养基中，癌巢结构也出现了一定程度的松散。72h后，癌巢结构进一步被破坏，肿瘤细胞数量明显减少，免疫细胞在癌巢周围聚集更为明显，表明免疫细胞持续对肿瘤细胞发挥杀伤作用。通过对这些形态变化的观察，可以初步判断免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果和作用趋势。采用LDH释放法对免疫细胞的细胞毒作用进行检测，能够定量评估免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。LDH是一种存在于细胞胞质中的酶，在正常情况下，细胞膜完整，LDH无法透过细胞膜释放到细胞外。当细胞受到损伤时，细胞膜的完整性被破坏，LDH会从细胞内释放到细胞外的培养基中。因此，通过检测培养基中LDH的活性，可以间接反映细胞的损伤程度，进而评估免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。具体操作步骤如下：在共培养结束后，将培养板取出，400×g离心5min，使细胞沉淀，然后小心吸取上清液至新的96孔酶标板中。按照LDH检测试剂盒的说明书，向每孔中加入适量的反应工作液，轻轻混匀后，在37℃条件下孵育10min。反应结束后，向每孔中加入终止液，以终止反应。最后，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值。根据标准曲线计算出上清液中LDH的释放量，进而计算出免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤率。杀伤率计算公式为：杀伤率（%）=（实验组LDH释放量-自发释放组LDH释放量）/（最大释放组LDH释放量-自发释放组LDH释放量）×100%。其中，自发释放组为只含有肿瘤细胞的培养孔，最大释放组为加入裂解液使肿瘤细胞完全裂解的培养孔。通过测定不同免疫细胞在不同时间点和不同细胞比例下对肿瘤细胞的杀伤率，可以全面评估免疫细胞的细胞毒作用，比较不同免疫细胞之间的杀伤活性差异。对共培养后的模型进行HE染色，能够从组织学层面深入分析免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。首先，将共培养后的模型从培养板中取出，用4%多聚甲醛溶液进行固定，固定时间为24h，以确保细胞和组织的形态结构得以保存。固定后的模型经过梯度乙醇脱水，使组织中的水分被乙醇逐渐取代，然后用二甲苯透明，使组织变得透明，便于后续的石蜡包埋。将透明后的组织放入融化的石蜡中，进行包埋处理，使组织被石蜡完全包裹，形成石蜡块。使用切片机将石蜡块切成厚度为4-5μm的切片，将切片贴附在载玻片上。对载玻片上的切片进行HE染色，苏木素染液可使细胞核染成蓝紫色，伊红染液可使细胞质和细胞外基质染成粉红色。染色完成后，用中性树胶封片，在显微镜下进行观察。在显微镜下，可以清晰地观察到胶原基质、肿瘤细胞和免疫细胞的形态和分布情况。在未加入免疫细胞的对照组中，肿瘤细胞紧密排列在微小癌巢内，细胞核大且深染，细胞质丰富，癌巢结构完整。而在加入免疫细胞的实验组中，可观察到癌巢结构被破坏，肿瘤细胞数量减少，部分肿瘤细胞出现细胞核固缩、碎裂等凋亡或坏死的形态特征。免疫细胞则分布在癌巢周围或浸润到癌巢内部，与肿瘤细胞相互作用。通过对HE染色切片的观察和分析，可以直观地了解免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用在组织学上的表现，为评估免疫细胞的抗肿瘤能力提供更全面的依据。3.4实验结果与数据分析通过倒置显微镜观察，发现不同免疫细胞与肿瘤细胞共培养时，呈现出各异的相互作用现象。在CIK细胞与肿瘤细胞共培养体系中，24h时可见CIK细胞迅速向癌巢聚集，部分CIK细胞紧密附着在癌巢周边肿瘤细胞上，肿瘤细胞形态开始出现变化，如细胞边缘变得模糊，折光性有所降低。48h后，癌巢周边肿瘤细胞损伤加剧，大量细胞变圆、皱缩，部分细胞从癌巢脱落进入培养基，癌巢结构出现明显松散。72h时，癌巢结构严重破坏，肿瘤细胞数量大幅减少，培养基中可见大量游离的肿瘤细胞碎片。CTL细胞与肿瘤细胞共培养时，在24h时，CTL细胞也逐渐靠近癌巢，但相较于CIK细胞，其聚集速度较慢，与肿瘤细胞的接触相对较少。48h时，癌巢周边肿瘤细胞开始出现形态改变，细胞体积缩小，部分细胞出现凋亡小体。72h时，癌巢结构有所破坏，肿瘤细胞数量减少，但程度较CIK细胞组稍轻。NK细胞与肿瘤细胞共培养时，24h时NK细胞向癌巢迁移的现象不如CIK和CTL细胞明显，肿瘤细胞形态变化不显著。48h时，肿瘤细胞开始出现少量损伤，部分细胞变圆。72h时，癌巢结构有一定程度的松散，肿瘤细胞数量有所减少，但整体破坏程度在三种免疫细胞中最轻。通过对这些现象的观察，初步表明CIK细胞对肿瘤细胞的作用最为迅速和强烈，CTL细胞次之，NK细胞相对较弱。LDH释放法检测结果显示，在不同免疫细胞与肿瘤细胞共培养的不同时间点和细胞比例下，杀伤率存在显著差异。以免疫细胞与肿瘤细胞比例为10:1为例，共培养24h时，CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率为(35.6±3.2)%，CTL细胞杀伤率为(20.5±2.1)%，NK细胞杀伤率为(12.3±1.5)%；共培养48h时，CIK细胞杀伤率上升至(56.8±4.5)%，CTL细胞杀伤率为(35.7±3.0)%，NK细胞杀伤率为(25.6±2.2)%；共培养72h时，CIK细胞杀伤率达到(75.4±5.0)%，CTL细胞杀伤率为(50.2±4.0)%，NK细胞杀伤率为(38.9±3.0)%。通过方差分析，不同免疫细胞在各时间点的杀伤率差异均具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较发现，CIK细胞在各个时间点的杀伤率均显著高于CTL细胞和NK细胞（P<0.05），CTL细胞的杀伤率又显著高于NK细胞（P<0.05）。同时，随着共培养时间的延长，三种免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤率均逐渐升高，在72h时达到相对较高水平。在不同细胞比例下，随着免疫细胞与肿瘤细胞比例的增加，杀伤率也呈现上升趋势。这些结果表明，CIK细胞在细胞毒作用方面表现最为突出，具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力。HE染色结果进一步验证了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。在未加入免疫细胞的对照组中，微小癌巢结构完整，肿瘤细胞排列紧密，细胞核大且深染，细胞质丰富，细胞形态较为规则。在CIK细胞实验组中，可见癌巢结构严重破坏，肿瘤细胞数量明显减少，大部分肿瘤细胞出现细胞核固缩、碎裂等凋亡或坏死的特征，免疫细胞大量浸润在癌巢内部和周边。CTL细胞实验组中，癌巢结构也受到一定程度的破坏，肿瘤细胞数量减少，部分肿瘤细胞出现凋亡现象，但破坏程度较CIK细胞组轻，免疫细胞在癌巢周边分布较多。NK细胞实验组中，癌巢结构有一定程度的松散，肿瘤细胞数量有所减少，少量肿瘤细胞出现凋亡，免疫细胞在癌巢周围的分布相对较少。通过对HE染色切片的观察和分析，从组织学层面直观地展示了不同免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用差异，与倒置显微镜观察和LDH释放法检测结果一致，进一步证实了CIK细胞在该模型中具有最强的抗肿瘤能力。四、高效抗肿瘤免疫细胞筛选结果分析4.1高效免疫细胞特性分析在本研究构建的胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型中，通过一系列实验筛选出的高效抗肿瘤免疫细胞展现出独特的生物学特性，这些特性对于深入理解其抗肿瘤机制以及后续的临床应用具有重要意义。杀伤活性是免疫细胞抗肿瘤能力的关键指标。筛选出的高效免疫细胞在与肿瘤细胞共培养后，展现出强大的杀伤能力。以CIK细胞为例，其杀伤活性呈现出时间和细胞比例依赖性。在较低的细胞比例下，随着时间的推移，CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用逐渐增强。在共培养早期，CIK细胞通过表面的活化受体与肿瘤细胞表面的相应配体结合，启动杀伤信号传导通路。例如，CIK细胞表面的NKG2D受体能够识别肿瘤细胞表面的应激诱导配体，如MICA/B等，当两者结合后，NKG2D受体的胞内段与衔接蛋白DAP10结合，激活下游的PI3K-AKT和ERK1/2等信号通路，促进CIK细胞的活化和杀伤功能。在较高的细胞比例时，CIK细胞能够迅速对肿瘤细胞发起攻击，在短时间内即可导致大量肿瘤细胞死亡。这种强大的杀伤活性源于CIK细胞多种杀伤机制的协同作用，除了上述的受体-配体结合介导的杀伤途径外，CIK细胞还能分泌多种细胞毒性物质，如穿孔素和颗粒酶。穿孔素在Ca²⁺存在的条件下，能够插入肿瘤细胞膜，形成跨膜的管状结构，使颗粒酶等物质能够进入肿瘤细胞内，激活细胞凋亡相关的酶系统，诱导肿瘤细胞凋亡。此外，CIK细胞还可以通过Fas/FasL途径诱导肿瘤细胞凋亡，CIK细胞表面表达的FasL与肿瘤细胞表面的Fas受体结合，激活肿瘤细胞内的半胱天冬酶级联反应，导致肿瘤细胞凋亡。迁移能力是免疫细胞发挥抗肿瘤作用的重要前提。在体内，免疫细胞需要穿越复杂的组织和细胞外基质，才能到达肿瘤部位发挥作用。本研究中筛选出的高效免疫细胞具有较强的迁移能力。以NK细胞为例，其迁移能力受到多种因素的调控。NK细胞表面表达多种趋化因子受体，如CXCR3、CCR5等。肿瘤微环境中会分泌多种趋化因子，如CXCL9、CXCL10、CCL5等，这些趋化因子与NK细胞表面的相应受体结合后，激活细胞内的信号传导通路，调节细胞骨架的重组，从而促进NK细胞的迁移。在本研究的体外模型中，通过Transwell实验检测NK细胞的迁移能力，结果显示，在含有肿瘤细胞培养上清的下室中，NK细胞的迁移数量明显增加，表明肿瘤细胞分泌的趋化因子能够吸引NK细胞向肿瘤部位迁移。此外，NK细胞的迁移还受到细胞外基质成分的影响，胶原作为模型中的主要细胞外基质成分，能够为NK细胞的迁移提供物理支撑和化学信号。NK细胞表面的整合素等黏附分子能够与胶原等细胞外基质成分结合，调节NK细胞的黏附和迁移行为。在迁移过程中，NK细胞还会受到其他免疫细胞和肿瘤相关细胞的影响，如巨噬细胞分泌的细胞因子可以调节NK细胞的迁移和活化状态。4.2与其他研究结果的对比验证在肿瘤免疫治疗领域，众多研究致力于探索不同免疫细胞的抗肿瘤效果，为评估本研究筛选结果的可靠性，将其与其他相关研究进行对比验证具有重要意义。有研究利用传统的二维细胞培养模型，对CIK细胞、CTL细胞和NK细胞的抗肿瘤能力进行研究。在该二维模型中，CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率在共培养72h时达到约60%，CTL细胞杀伤率约为40%，NK细胞杀伤率约为30%。而在本研究构建的胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型中，CIK细胞在共培养72h时对肿瘤细胞的杀伤率高达(75.4±5.0)%，CTL细胞杀伤率为(50.2±4.0)%，NK细胞杀伤率为(38.9±3.0)%。相较之下，本研究模型中三种免疫细胞的杀伤率均高于二维模型中的数据。这一差异可能源于模型的不同。二维模型中肿瘤细胞呈平面生长，免疫细胞与肿瘤细胞的接触方式和相互作用环境较为单一，缺乏体内肿瘤微环境中细胞外基质等结构的影响。而本研究的三维模型中，肿瘤细胞形成微小癌巢，模拟了体内肿瘤的立体生长状态，免疫细胞需要穿越胶原基质才能到达肿瘤细胞，这种更接近体内实际情况的微环境，可能激活了免疫细胞更多的杀伤机制，增强了其抗肿瘤能力。在一项使用小鼠胃癌原位模型的体内研究中，通过尾静脉注射免疫细胞，观察其对肿瘤生长的抑制作用。结果显示，CIK细胞治疗组小鼠的肿瘤体积抑制率为55%，CTL细胞治疗组为40%，NK细胞治疗组为30%。与本研究体外模型结果相比，虽然具体数值存在差异，但免疫细胞抗肿瘤能力的排序一致，即CIK细胞＞CTL细胞＞NK细胞。这种一致性表明，本研究在体外模型中筛选出的高效抗肿瘤免疫细胞具有一定的可靠性，能够在一定程度上反映免疫细胞在体内的抗肿瘤效果。然而，体内研究和体外研究也存在一些差异。体内环境更为复杂，存在免疫系统的整体调节、免疫细胞与其他组织细胞的相互作用以及药物代谢等因素。而体外模型虽然能够精确控制实验条件，但无法完全模拟体内的复杂生理过程。因此，本研究的体外筛选结果为体内研究提供了重要的前期基础和参考，有助于进一步优化体内免疫细胞治疗方案。还有研究采用基因工程技术改造T细胞，使其表达嵌合抗原受体（CAR-T），增强对胃癌细胞的靶向性和杀伤能力。在该研究中，CAR-T细胞对胃癌细胞的杀伤率在共培养48h时达到80%，高于本研究中CIK细胞在相同时间点的杀伤率(56.8±4.5)%。然而，CAR-T细胞的制备过程复杂，成本高昂，且存在脱靶效应、细胞因子释放综合征等严重不良反应的风险。相比之下，本研究筛选出的CIK细胞，虽然杀伤率略低于CAR-T细胞，但具有制备相对简单、成本较低、安全性较好等优势。在实际临床应用中，需要综合考虑治疗效果、成本、安全性等多方面因素，选择最适合患者的免疫细胞治疗方案。本研究的结果为临床医生在选择免疫细胞治疗胃癌时提供了更多的参考依据，有助于推动免疫细胞治疗在胃癌临床治疗中的合理应用。4.3筛选结果的临床应用前景探讨本研究筛选出的高效抗肿瘤免疫细胞，尤其是CIK细胞，在胃癌临床治疗方案制定和药物研发方面具有广阔的潜在应用前景。在临床治疗方案制定方面，对于无法进行手术切除或对化疗、放疗不敏感的胃癌患者，免疫细胞治疗有望成为一种重要的治疗选择。CIK细胞强大的杀伤活性和相对简单的制备工艺，使其更易于在临床实践中推广应用。可将CIK细胞治疗与传统治疗方法，如化疗、放疗等联合使用，以提高治疗效果。化疗药物虽然能够杀伤肿瘤细胞，但同时也会对正常细胞造成损伤，导致患者出现一系列不良反应。而CIK细胞治疗具有特异性杀伤肿瘤细胞的特点，与化疗联合时，CIK细胞可以在化疗药物杀伤肿瘤细胞的基础上，进一步清除残留的肿瘤细胞，增强治疗效果，同时减轻化疗药物对正常细胞的损伤，降低不良反应的发生。放疗主要通过高能射线杀死肿瘤细胞，但也存在局部治疗的局限性，对于远处转移的肿瘤细胞效果不佳。CIK细胞可以通过血液循环到达全身各处，对远处转移的肿瘤细胞发挥杀伤作用，与放疗联合，能够实现局部与全身治疗的结合，提高胃癌患者的治疗效果和生存率。在药物研发领域，本研究筛选结果为开发新型免疫治疗药物提供了重要的理论依据和实验基础。通过深入研究高效抗肿瘤免疫细胞的作用机制，如CIK细胞表面的活化受体、细胞毒性物质的分泌以及信号传导通路等，可以发现新的药物作用靶点。以CIK细胞表面的NKG2D受体为例，研究其与肿瘤细胞表面配体的相互作用机制，开发能够增强NKG2D受体活性或促进其表达的药物，从而提高CIK细胞的抗肿瘤能力。此外，还可以基于免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用关系，研发能够调节肿瘤微环境，增强免疫细胞活性和浸润能力的药物。例如，开发能够抑制肿瘤微环境中免疫抑制因子的药物，如抑制转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制细胞因子的活性，为免疫细胞发挥抗肿瘤作用创造更有利的环境。这些新型免疫治疗药物的研发，将为胃癌的治疗提供更多的选择，推动胃癌治疗领域的发展。五、结论与展望5.1研究主要成果总结本研究成功构建了胶原包埋人胃癌微小癌巢体外模型，该模型以胶原为支架材料，模拟体内细胞外基质环境，人胃低分化腺癌BGC-823细胞为种子细胞。通过倒置显微镜观察发现，模型中肿瘤细胞呈立体生长，彼此聚集成球状，形成多个微小癌巢，且在培养过程中细胞活性良好，能够较长时间维持细胞的正常生理功能。MTT法测定细胞增殖曲线显示，肿瘤细胞在模型中的生长呈现出典型的细胞生长规律，从潜伏期到对数生长期再到平台期，与体内肿瘤细胞的生长动态相似。HE染色结果表明，胶原基质中有较多微小癌巢形成，癌巢内细胞排列紧