2025年大学《分子科学与工程》专业题库- 分子实验与实验技术

2025年大学《分子科学与工程》专业题库——分子实验与实验技术考试时间：______分钟总分：______分姓名：______一、选择题（每题2分，共20分。请将正确选项的字母填在题干后的括号内）1.在PCR反应体系中，下列哪一项通常是需要添加的变性与退火引物？A.DNA聚合酶B.dNTPsC.模板DNAD.Mg²⁺2.琼脂糖凝胶电泳主要用于分离下列哪种物质？A.蛋白质B.脂质C.核酸（DNA或RNA）D.糖类3.下列哪种层析技术主要利用蛋白质分子量的大小进行分离？A.离子交换层析B.亲和层析C.凝胶过滤层析D.凝胶电泳4.在进行WesternBlotting实验时，将蛋白质转移到固相载体后，首先需要进行的步骤是？A.用抗体孵育B.用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育C.进行化学发光检测D.用封闭液封闭非特异性结合位点5.PCR技术的核心酶是？A.DNA连接酶B.DNA聚合酶C.限制性内切酶D.RNA聚合酶6.下列哪种试剂常用于DNA的变性？A.氯化钠B.乙醇C.Tris-HClD.SDS7.细胞培养过程中，维持无菌环境的主要目的是为了？A.促进细胞快速生长B.防止微生物污染影响实验结果C.提高培养基的营养成分D.降低细胞代谢速率8.在进行基因克隆时，将外源DNA片段插入到载体DNA（如质粒）中，通常需要使用？A.DNA连接酶B.DNA聚合酶C.限制性内切酶D.DNA变性剂9.下列哪项不属于实验室生物安全等级分类？A.生物安全水平1(BSL-1)B.生物安全水平3(BSL-3)C.化学安全等级1(CSL-1)D.生物安全水平4(BSL-4)10.在记录实验数据时，对于重复测量的数值，应记录为？A.任意一个读数B.所有读数的平均值C.最接近预期值的读数D.最大和最小读数范围二、填空题（每空1分，共15分。请将答案填在横线上）1.分子杂交技术利用了核酸分子之间碱基互补配对的原理，常用的杂交形式包括______杂交和______杂交。2.在蛋白质的SDS电泳中，SDS的作用是使蛋白质变性并带有负电荷，从而实现按______的分离。3.常用的PCR反应缓冲液通常包含Tris-HCl（提供pH）、______（提供Mg²⁺）和KCl等。4.实验室常用的消毒方法有______和______，而灭菌方法则常用______、______或______。5.细胞培养常用的培养基类型包括______培养基和______培养基。6.核酸测序技术的主要目的是确定DNA或RNA分子中碱基的______。三、简答题（每题5分，共20分）1.简述PCR技术的基本原理及其主要步骤。2.简述凝胶电泳在分子生物学实验中至少两种不同的应用。3.简述蛋白质层析分离的基本原理，并列举三种不同的层析类型及其主要区别。4.简述设置实验对照组的意义。四、论述/计算题（每题12分，共24分）1.假设你需要从含有多种蛋白质的细胞裂解物中分离纯化一种特定的酶。请简述你会选择哪些层析技术（至少三种），并说明选择这些技术的理由以及大致的分离流程。2.某学生在进行PCR实验时，发现扩增产物大小不正确（偏大或偏小），请分析可能的原因有哪些？（至少列出三种）五、实验设计题（共16分）你想要验证某种限制性内切酶EcoRI是否能够识别并切割你所获取的某生物样本（如细菌基因组DNA或质粒DNA）中的特定目标片段。请设计一个简单的实验方案，包括所需的试剂、主要步骤和预期结果观察。试卷答案一、选择题1.C2.C3.C4.D5.B6.B7.B8.A9.C10.B二、填空题1.DNARNA2.分子量（或相对分子质量）3.dNTPs4.高温高压灭菌法（或高压蒸汽灭菌法）煮沸法干热灭菌法5.培养基培养基6.序列三、简答题1.原理：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA聚合酶在体外模拟体内DNA复制过程，特异性地扩增特定DNA片段的技术。其原理基于DNA双链解开后，每个单链都可以作为模板，根据碱基互补配对原则合成新的互补链。步骤：（1）变性：加热使双链DNA解开成为单链；（2）退火：降温使引物与两条单链DNA的互补序列结合；（3）延伸：在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，沿模板链合成新的互补链。重复变性、退火、延伸循环，使目标DNA片段呈指数级扩增。2.应用：（1）DNA片段的分离与鉴定：按分子大小（片段长短）对DNA片段进行分离，可用于分析DNA片段的大小、鉴定未知DNA片段（如通过基因测序电泳图）、进行DNA指纹图谱分析等。（2）蛋白质的鉴定与分析：如在SDS后，可通过凝胶电泳分离蛋白质，然后进行染色或转移到膜上进行WesternBlotting等后续分析。（3）核酸纯化：琼脂糖凝胶电泳可用于从混合物中回收纯化特定大小的核酸片段。3.原理：蛋白质层析分离利用蛋白质分子与层析介质之间的相互作用（如电荷、大小、形状、疏水性等）的差异，通过洗脱液将蛋白质分步洗脱下来，实现分离。层析类型及区别：（1）离子交换层析：基于蛋白质表面电荷与层析介质上带电基团的相互作用。带电荷相反的蛋白质被吸附，通过改变洗脱液离子强度或pH改变电荷状态或竞争性结合来洗脱。（2）凝胶过滤（分子排阻）层析：基于蛋白质分子大小。层析介质内部有多孔网状结构，大分子不能进入孔内而被先洗脱下来，小分子可以进入孔内并在柱内停留时间更长，从而按分子大小分离。（3）亲和层析：基于蛋白质与层析介质上固定化的配体之间的高度特异性结合。只有目标蛋白质能与配体结合被吸附，通过加入特异性解离剂或改变条件洗脱下来。亲和层析选择性最高。4.意义：设置对照组是为了提供一个参照，通过与实验组的比较，可以排除其他因素的干扰，确认实验结果是否由实验处理或自变量引起，从而提高实验结果的可信度和说服力。对照组有助于判断实验设计的合理性和结果的可靠性。四、论述/计算题1.选择的层析技术及理由：*凝胶过滤层析（分子排阻层析）：理由：首先需要根据目标酶的分子量初步分离，去除细胞裂解物中的其他大分子蛋白质（如膜蛋白、核蛋白）和小分子物质（如盐离子、ATP等）。凝胶过滤层析能有效分离不同分子量的物质，使目标酶得到初步纯化并除去杂质。*离子交换层析：理由：在凝胶过滤分离后，目标酶与杂蛋白的分子量可能相近，此时需要利用它们电荷或pI的差异进行进一步分离。离子交换层析可以根据蛋白质等电点与层析介质电荷的关系进行选择性的吸附和洗脱，实现较好的纯度提升。*亲和层析：理由：如果目标酶具有已知的特定结合位点（如金属离子结合域、小分子底物结合域等），亲和层析可以利用这种特异性结合，实现高度纯化，选择性非常好。大致流程：（1）细胞裂解，获取粗提液；（2）通过凝胶过滤层析，去除分子量差异较大的杂质；（3）将流出液（含有目标酶）上样到离子交换层析柱，调节条件（如pH、盐浓度）使目标酶被吸附，然后用梯度洗脱或等度洗脱，收集目标酶纯化组分；（4）将纯化组分上样到亲和层析柱，利用特异性结合洗脱目标酶，得到高度纯化的酶。每步后可进行活性检测或SDS分析纯度。2.可能原因：*引物设计问题：引物与模板结合位点设计不当，如引物二聚体形成、引物非特异性结合、引物延伸超出预期末端等，导致非特异性扩增或片段大小异常。*PCR条件优化不足：如退火温度不合适、循环数过多或过少、酶浓度、dNTP浓度、Mg²⁺浓度等反应体系条件未优化的，可能导致扩增效率低或非特异性产物增多，影响主产物大小。*模板质量或量问题：模板DNA/RNA降解、纯度差（含有抑制物）、模板量过高或过低，都会影响PCR扩增的效率和产物大小。五、实验设计题实验方案：目的：验证限制性内切酶EcoRI是否能够识别并切割样本DNA中的特定目标片段。所需试剂：样本DNA（细菌基因组DNA或质粒DNA）、EcoRI限制性内切酶、EcoRI缓冲液（与酶配套）、PCR产物（如果目标片段来自PCR）或直接用样本DNA、琼脂糖凝胶电泳试剂（琼脂糖粉末、电泳缓冲液如TAE或TBE、DNA上样染料）、载样缓冲液、DNA分子量标准（Marker）。主要步骤：（1）（如果需要）DNA准备：如果目标片段不在质粒上或不在基因组特定位点，可能需要先通过PCR扩增获得目标片段。如果使用质粒或基因组DNA，确保其浓度合适。如果使用PCR产物，确保产物纯化。（2）酶切反应体系设置：设置反应管，每管包含：样本DNA（例如1-5µg，根据浓度调整）、EcoRI限制性内切酶（例如10units）、EcoRI缓冲液（根据说明书添加，确保酶活性所需离子强度和pH）、无菌水或TE缓冲液（补足总体积至例如20-50µL）。设置阴性对照管：除不加EcoRI酶外，其他成分与酶切反应管完全相同。（3）酶切反应：将反应管置于适宜温度（通常是37°C）的水浴锅中孵育，例如1小时或过夜（根据说明书和实验目的确定）。（4）终止反应：加入少量无酶水或加入热稳定酶（如热激蛋白）并加热（如65-70°C）10分钟，使酶失活。（5）琼脂糖凝胶电泳：配制琼脂糖凝胶（例如1-1.5%），加入DNA分子量标准。将酶切反应产物、阴性对照样本DNA（未经酶切）以及DNA分子量标准一起用上样缓冲液混匀后上样到凝胶孔中。（6）电泳：连接电源