酶促反应动力学课件

酶促反应动力学

KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

酶促反应动力学研究酶促反应的速度规律及各种因素对酶促反应速度的影响。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。

※初速度(v)：在酶促反应过程中，初始底物浓度消耗在5%以内的速度一、酶浓度的影响酶最适反应适条件下

当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K[E]0V[E]二、底物浓度对反应速度的影响1.单底物酶促反应动力学中间复合物学说

E：enzyme；S：substrate；P：product1903年，Henri以蔗糖酶研究底物与反应速率关系，与Wurtz提出酶底物中间络合物学说E+Sk1k2k3ESE+P[S]VVmax当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。

vVmax[S]Km+[S]＝──1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

米氏方程的推导前提:中间复合物学说:E+SES→E+P反应方程式:假设：产物浓度很底时，忽略E+P→EPE+Sk1k2k3ESE+PTotalenzyme：[Et]=[E]+[ES]，[E]=[Et]-[ES]∵[S]>>[E] ∴[St]－[ES]≈[S]K1[E][S]＝K2[ES]+K3[ES]，即：K1([Et]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]＝([Et]－[ES])[S]K2+K3[ES]

K1整理得：K2+K3＝

KmK1令：＝Km([Et]－[ES])[S][ES]

则：[ES]＝───[Et][S]Km+[S]整理得:∵ES分解为限速步骤，∴v=K3[ES]即：K3[Et][S]Km+[S]v＝────当底物浓度↑，酶活性中心全部饱和，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度：Vmax＝K3[ES]＝K3[Et]Vmax[S]

Km+[S]

v＝────

米氏常数

：Km

当：v=1/2Vmax

[S]=Km(摩尔/升)

K2+K3＝

KmK1Vmax[S]

Km+[S]

v＝────

VmaxV[S]KmVmax/2米氏常数的意义

Km值是酶的特征常数，只与酶性质反应环境有关，与酶的浓度无关。（鉴定酶）判断酶的最适底物，如蔗糖酶：水解蔗糖Km=28；水解绵子糖Km=350可近似地表示酶对底物亲和力的大小Km值可用来表示酶对底物的亲和力K2+K3＝

Km

，当K2＞＞K3

时，K1＝[E][S]

K2[ES]

K1Km

＝＝Ks（解离常数）Km和酶与底物的亲和力成反比

E+Sk1k2k3ESE+P米氏常数的求法v—[S]作图法

双倒数作图法(doublereciprocalplot)，

又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法

Y=aX+b2.双底物酶促反应机制

双底物反应

序列反应乒乓反应有序顺序反应

随机顺序反应①有序顺序机制（compulsoryorderreactions）

（1）顺序(序列)机制（sequentialreactions）Leadingsubstrate乙醇脱氢酶的作用

②随机顺序机制（randomorderreactions）肌酸激酶催化的反应

Cr：creatine肌酸；CrP：creatinephosphate磷酸肌酸可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应

（2）乒乓机制（pingpongreactions）

修饰酶形式氨基转移酶催化的反应磷酸吡哆醛磷酸吡哆胺草酰乙酸α-酮戊二酸三、温度对酶促反应的影响双重影响

最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的境温度。植物酶：40-50˚C

动物酶：35-40˚C非固定常数←底物的种类、浓度,溶液的离子强度,pH,反应时间等四、pH对酶促反应的影响最适pH：植物、微生物酶：pH4.5-6.5动物酶:pH6.5-8.0非固定常数胆碱酯酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶过氧化氢酶延胡索酸酶RNase精氨酸酶pH影响反应速度的原因

pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。过高、过低的pH导致酶蛋白变性。五、激活剂的影响激活剂(activator)

凡能提高酶活性，加速酶促反应速度的物质都称为该酶的激活剂。主要激活剂

金属离子：K+、Na+

、Mg2+

、Zn2+

、Fe2+

、Ca2+

、Mn2+

无机阴离子：Cl-

、Br-、I-、CN-,PO43-小分子有机物：抗坏血酸、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸等生物大分子：蛋白酶、钙调素等六、抑制剂的影响抑制作用：某些物质与酶分子上特定基团，主要是活性中心的某些基团结合，使酶活性中心的结构和性质发生改变，从而引起酶活力的下降或丧失，这种作用称为酶的抑制作用。酶的抑制剂(inhibitor)：能对酶产生抑制作用的物质即为酶的抑制剂。

抑制剂与变性剂：抑制剂对酶有一定选择性——必需基团；引起变性的因素对酶没有选择性。

抑制作用的类型

不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)1.不可逆性抑制作用（irreversibleinhibition）

概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。抑制剂不能用透析、超滤等方法除去。

抑制剂重金属:汞、铅、砷有机磷化合物：农药（敌敌畏、敌百虫）细胞呼吸抑制剂：氰化物、一氧化碳等

有机磷化合物羟基酶(胆碱酯酶)磷酰化酶(失活酶)酸羟基酶抑制剂

有机磷化合物，R、R’:烷基;X:-F,-CN等解磷定(PAM,碘化醛胯甲基吡啶)或氯磷定巯基酶抑制剂烷化剂：例ICH2COOH，ICH2CONH2等E-SH+ICH2COOHE-S-CH2COOH+HI有机汞、有机砷化合物(对氯汞苯甲酸,路易士气)路易士气巯基酶失活酶酸路易士气的解毒失活酶BAL(二巯基丙醇)巯基酶BAL与砷剂结合物2.可逆性抑制作用(reversibleinhibition)*概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制*类型（１）竞争性抑制作用（competitiveinhibition）

+IEIE+SE+PES反应模式抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶反应速度降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。

+++EESIESEIEP抑制剂是底物的结构类似物

竞争性抑制作用动力学Vmax不变；Km（Km’）变大，随[I]增加而增加（2）非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）

抑制剂与酶活性中心外的基团结合，不影响酶与底物的结合，酶和底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合。但酶-底物-抑制剂复合物不能进一步释放出产物。*反应模式E+SESE+P+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP+IEI+SEIS+I非竞争性抑制作用动力学Km=Km’（不变）；Vmax变小，Vmax’随[I]增加减小(３)反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）

抑制剂只与酶和底物形成的中间产物结合，既减少从中间产物转化为产物的量，也减少从中间产物解离出游离酶和底物的量。*反应模式

E+SE+PES+IESI++ESESESIEP反竞争性抑制作用动力学Vmax、Km变小；Vmax、Km随[I]增加减小可逆性抑制作用比较第六节

重要酶类及其活性调节

一、多酶体系与反馈调节多酶体系反馈调节苏氨酸异亮氨酸二、别构酶和别构调节1．基本概念

（1）别构调节（allostericregulation）某些化合物与酶特定部位结合（可逆非共价结合），引起酶的构象变化，从而导致酶活性变化，这种调节方式称为别构调节。

（2）效应物（effector）能使酶分子发生别构作用的物质（常为小分子代谢物或辅因子）称为效应物或别构剂。

正效应物（positiveeffetor）

效应物与酶的结合使酶活性升高者，称为正效应物或别构激活剂。

负效应物（negativeeffetor）

效应物与酶的结合使酶活性降低者，称为负效应物或别构抑制剂。

（3）别构酶（allostericenzyme）

能进行别构调节的酶为别构酶。别构酶除活性中心外还有别构中心（与别构剂结合的部位）。别构酶一般为寡聚体，别构中心可位于同一亚基的不同部位或不同亚基上。存在别构中心的亚基称调节亚基。存在活性中心的亚基称催化亚基。

活性中心负责对底物的结合与催化，别构中心负责调节酶促反应速度。（4）别构效应（allostericeffect）：效应物与别构中心结合，使活性中心与底物的结合和催化活性受到影响，进而调节酶反应速度，此效应称为别构效应。

（5）同促效应（homotropiceffect）：

底物分子本身对别构酶的调节。当第一个效应分子与酶别构中心结合后，有利于同种后续分子的结合。（活性部位和调节部位是相同的。）（6）异促效应（heterotropiceffect）：

非底物分子调节物对别构酶的调节。当第一个效应分子与酶别构中心结合后，有利于不同后续分子（底物）与酶的结合。

（7）协同效应（cooperativeeffect）

：

调节部位和活性部位虽然在空间上是分开的，但这两个部位通过构象的变化可相互影响，这种影响统称为协同效应。酶结合一分子调节物（或底物），构象变化，有利于后续分子与酶结合——正协同效应（positivecooperativety）；新构象不利于后续分子与酶结合——负协同效应（negativecooperativety）。三、酶的可逆共价调节（共价修饰covalentlymodulatedenzymes

）

在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。共价调节的逆反应需在另一种酶的催化下进行。

共价修饰的类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化－SH与－S－S互变

-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白酶的磷酸化与脱磷酸化糖原磷酸化酶活性的调节

磷酸化/脱磷酸化调节（磷酸化位点：Ser14）四、同工酶（isoenzymeorisozyme）

概念同工酶是指由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂合体，催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。举例：乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenaseLDH）

催化的反应

乳酸丙酮酸

LDH5骨骼肌:乳酸丙酮酸心肌:LDH1HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脱氢酶的同工酶结构特征（2种亚基4聚体，5种同工酶）

H：heart；M：muscle电泳行为乳酸脱氢酶同工酶在不同组织中

的分布（%）生理意义

心肌：LDH1（H4）对NADKm值小，氧化供能骨骼肌：LDH5(M4)对丙酮酸Km值小同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345*肌酸激酶（creatinephosphatekinaseCPK）催化的反应：肌酸+ATP=肌酸磷酸+ADP结构：2种亚基2聚体，三种同工酶MM,MB,BB肌酸激酶同工酶在人体组织中的分布肌酸激酶（CPK）骨骼肌心脏脑肝胃肾总活力（IU/g）1900-3000380160412518MM10076-90310MB-22-6210BB-110049590***第七节

酶的分离纯化

和活力测定一、酶分离纯化的一般原则材料选择：新鲜、酶含量丰富所有蛋白质分离纯化的方法都适合酶特别注意酶活性的保护，避免一切能引起蛋白变性的因素每一步都要进行酶活力的测定，跟踪酶的去向，评价纯化方法。

二、酶活力与测定

1.酶活力

（enzymeactivity）

一定条件下，酶催化某一化学反应的能力，以反应速度表示。酶活力与反应速度呈正比。

*反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的生成量。由于底物是过量的，减少量不易测准，所以通常以测定产物的生成量为准。2.酶活力单位

（unit,U）

国际单位（IU,1961

）：一个国际单位指在最适条件下，每分钟催化1微摩尔(μmol)底物减少或1微摩尔产物生成所需要的酶量（25˚C）。Katal（Kat

，1972）：在最适条件下，每秒钟能催化1摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量定为1Kat。Kat与国际单位的换算如下：1Kat=