《猪瘟荧光 PCR 快速检测技术规范》

T/CSHB

河北省版权协会团体标准

T/CSHB0002—2024

猪瘟荧光PCR快速检测技术规范

TechnicalspecificationsforrapiddetectionofswinefeverusingPCR

2024--发布2024--实施

河北省版权协会发布

I

猪瘟荧光PCR快速检测技术规范

1范围

本文件规定了猪瘟荧光PCR快速检测技术的试剂和材料、仪器设备、样品的采集与处理、操作方法、

结果判定和存储。

本文件适用于猪瘟快速检测，适用于对临床样本中的猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）

RNA进行定性检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

农牧发[2019]2号生猪屠宰检疫规程

NY/T541兽医诊断样品采集、保存于运输技术规范

GB/T27540-2011猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1扩增

指基因扩增，细胞内染色体上的某一个基因选择性地拷贝数大量增加的现象。

3.2扩增曲线

指在分子生物学实验中，通过连续监测反应体系内生物分子的浓度变化，得到的曲线图。

4缩略语

荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxfluorescein）

CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）

DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethlpyrocarbonate）

5试剂和材料

5.1试剂

除另有说明，所有试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶的容器分装。

5.1.1PCR反应液

5.1.2阳性对照品

5.1.3阴性对照品

1

5.1.4酶混合液

5.1.475%乙醇

用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20°C预冷。

5.1.5DEPC水

去离子水中加入0.1%DEPC，37°C作用1h，（121±2）°C，高压灭菌15min。

5.2材料

放血工具、离心管、一次性手套、一次性注射器、抗凝剂（柠檬酸钠：水=1：10）、消毒剂、搅

拌棒、编号笔、消毒液容器、拭子等。

6仪器与设备

6.1核酸提取仪

6.2高速台式冷冻离心机

6.3冰箱：2~8°C和-20°C以下

6.4适用仪器

试剂盒适用于ABI7000/7300/7500/7900、ABIStepOnePlus、宏石SLAN-48P/96S、RochelightCycler480、

RochelightCycler96、AglientMX3000P/3005P、iCycleriQ、Bio-RadCFX96等荧光定量PCR仪。

7样品采集与处理

7.1总则

样品采集、保存与运输按照NY/T541执行，样本类型为RNA病毒，且需在提取后尽快检测。

7.2采样人员

采样人员需经过专业技术机构培训、掌握采样技术的人员实施。

7.3样品采集

7.3.1全血样品采集

生猪样品采集部位为猪耳缘静脉或前腔静脉血液，生猪采集2mL~5mL血液置于采血管（含EDTA

抗凝剂）中，密封后冷藏或冷冻保存。

7.3.2拭子样品采集

用无菌拭子在鼻腔内或口腔内轻轻擦拭并缓慢旋转至少3周，或用无菌拭子轻轻擦拭眼分泌物后，

将拭子置于DEPC水中，密封后冷藏或冷冻保存。

7.3.3内脏组织样品采集

采集适量肝、脾、肺组织样品，并按1：5倍体积加入DEPC水，研磨匀浆，密封后冷藏或冷冻保存。

2

7.3.4粪便样品采集

称取适量粪便样品置入无菌保存管中，密封后冷藏或冷冻保存。

7.3.5活体样品采集

固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭活牙签挑至无菌管中，密封

后冷藏或冷冻保存。

7.4样品处理

7.4.1全血样品处理

血液混匀后，转入1.5mL灭菌离心管中，直接用于核酸提取。

7.4.2拭子样品处理

将含有鼻咽拭子或口腔拭子或眼分泌物拭子样品，摇匀，保存管在涡旋震荡仪上充分混合，在4°C

下3000rpm离心5min，取上清液，转入1.5mL灭菌离心管中。

7.4.3内脏组织和粪便样品处理

将含有组织或粪便匀浆液无菌保存管在涡旋振荡仪上充分混合后，在4°C下3000rpm离心15min，取

上清液。

7.4.4活体组织样品处理

取适量样本于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000rpm15min，取上清液。

8检测

8.1检测方法

8.1.1核酸提取

在样本制备区进行。按照GB/T27540-2011执行。

8.1.2扩增试剂准备

在试剂存储和准备区进行。

将试剂盒从-20°C冰箱取出，冰浴条件下融化，待其融化完全后，振荡混匀，瞬时离心，并按表1

体系，在0.2mLPCR管中配制反应液。

表1扩增试剂配制

成分体积

CSFV-PCR反应液19μL

酶混合液1μL

总体积20μL

8.1.3荧光PCR扩增体系

将提取的样本RNA，取5μL上样。

8.1.4PCR扩增

按如下步骤设置荧光定量PCR仪的程序：

表2操作步骤

步骤温度时间循环数

150°C5min1cycle

295°C1min1cycle

3

95°C5s

340cycle

62°C30s（采集荧光步骤）

仪器检测通道选择：选择FAM通道（Reporter：FAM）检测CSFV；具体检测通道设置可参照各仪

器使用说明。

8.2检测结果说明

通过检测样本扩增曲线和Ct值组合判定，阳性/阴性，具体数值如下：

1、检测质控标准：如果阳性对照品有扩增曲线且Ct值≤30，空白对照的无扩增曲线，则本次试验有

效，否则试验无效。

2、结果判断：

a）如果检测样本有扩增曲线且Ct值≤35，报告为CSFV检测阳性。

b）如果检测样本有扩增曲线且35<Ct值<40时，需重新对样本进行检测。若重复检测结果显示有扩

增曲线且Ct