DB35∕T 2034-2021 鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断技术

ICS65.020.30

CCSB41

35

福建省地方标准

DB35/T2034—2021

鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断技术

Quarantineprotocolforvirulentandattenuatedstrainsofduckplaguevirusinfection

2021-12-29发布2022-03-29实施

福建省市场监督管理局发布

DB35/T2034—2021

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4缩略语.............................................................................1

5疫病概述...........................................................................1

6聚合酶链反应.......................................................................2

7结果判定...........................................................................3

附录A（规范性）试剂的配制...........................................................4

附录B（资料性）电泳图...............................................................6

附录C（资料性）参考序列.............................................................7

I

DB35/T2034—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由福建省农业科学院提出。

本文件由福建省农业农村厅归口。

本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、龙岩市动物

疫病预防控制中心、福州市动物疫病预防控制中心、三明市动物疫病预防控制中心。

本文件主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、陈长福、刘道泉、陈小丽、程龙飞、刘荣昌、施少华、

陈红梅、傅秋玲、江南松、李中华。

II

DB35/T2034—2021

鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断技术

1范围

本文件规定了鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断的聚合酶链反应（PCR）的操作技术。

本文件适用于鸭瘟强弱毒核酸实验室鉴别诊断和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleosidetriphosphate）

PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）

TAE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethylaminomethane-boricacid-

ethylenediaminetetraaceticacid）

5疫病概述

5.1鸭瘟

鸭瘟，又称为鸭病毒性肠炎，最早于1923年在荷兰发生和流行，随后在世界多国均有报道，几乎所

有的雁形目禽类（如多品种鸭、鹅和天鹅）均可发生鸭瘟。黄引贤等于1957年在广州发现鸭瘟后，在我

国南方主要养鸭区广泛流行，给养鸭业曾造成巨大的直接经济损失。

5.2UL2基因特点

鸭瘟病毒，又称为鸭肠炎病毒或鸭疱疹病毒1型，是引起雁形目禽类发生鸭瘟的病原。鸭瘟弱毒，

即鸭瘟活疫苗毒，自1960年以来一直用于防控鸭瘟。鸭瘟病毒UL2基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，是一个

非必需基因，在DNA复制过程中可将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸错误插入或是胞嘧啶的脱氨基造成的尿嘧啶

残基切除，保证DNA复制的正确性和顺利进行。对GenBank中登录的鸭瘟病毒（强毒株和弱毒株）的UL2

1

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基因进行分析比较发现，强毒株UL2基因长度为1002bp，而弱毒株UL2基因长度为474bp，且与强毒株

UL2基因相比具有528bp核苷酸序列缺失。

6聚合酶链反应

6.1主要仪器设备

6.1.1PCR仪。

6.1.2高速台式冷冻离心机。

6.1.3微量移液器。

6.1.4组织匀浆器。

6.1.5电泳仪。

6.1.6电泳槽。

6.1.7紫外凝胶成像系统。

6.2试剂

6.2.1水，应符合GB/T6682所规定一级水的要求。

6.2.2磷酸盐缓冲液，配置方法应符合附录A中A.1的规定。

6.2.310%十二烷基磺酸钠溶液，配置方法应符合附录A中A.2的规定。

6.2.4蛋白酶K溶液，配置方法应符合附录A中A.3的规定。

6.2.53M乙酸钠溶液，配置方法应符合附录A中A.4的规定。

6.2.61×TAE电泳缓冲液，配置方法应符合附录A中A.5的规定。

6.2.71.0%琼脂糖凝胶，配置方法应符合附录A中A.7的规定。

6.2.810×加样缓冲液，配置方法应符合附录A中A.8的规定。

6.2.9引物（Primer）：10μmol/L。根据鸭瘟强弱毒的UL2基因保守区设计，对鸭瘟强弱毒扩增片

段大小分别为1019bp和491bp。

上游引物UL2F：5’-TAACGTCGTTTATACTGTTCCAC-3’。

下游引物UL2R：5’-AGACCCAAATGACAGAACCT-3’。

6.3样品处理

将采集的组织（肝脏、食道粘膜假膜）经剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液按体积比1:3的比例制成组

织匀浆液，反复冻融3次，4000r/min离心30min，取上清液冻存分装备用。

6.4核酸DNA提取

6.4.1取420μL组织匀浆上清液和30μL核糖核酸酶加入1.5mL灭菌离心管混匀后，室温（20℃～

25℃）作用20min。

6.4.2加入40μL10%十二烷基磺酸钠溶液和10μL蛋白酶K溶液，56℃水浴2h。

6.4.3加入等量的Tris·饱和酚，颠倒充分混匀，12000r/min离心5min，小心吸取上层水相于另

一1.5mL灭菌离心管中。

6.4.4加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12000r/min离心5min，小心

吸取上层水相于另一1.5mL灭菌离心管中。

6.4.5加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20℃放置1h。

2

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12000r/min离心15min，去上清。加入600μL75%冰冻预冷的乙醇清洗2次，倒置于吸水纸上5min，

室温晾干。加入20μL灭菌双蒸水溶解，-20℃放置备用。

6.4.6核酸DNA提取也可采用市售等效的商品化核酸DNA提取试剂盒，按说明书的要求进行操作。

6.5对照

以56℃30min灭活的鸭瘟强毒、弱毒病毒提取的基因组DNA或目的片段为阳性对照，以其他灭活的

病毒或健康鸭组织提取的基因组DNA为阴性对照，以灭菌双蒸水为空白对照。

6.6PCR扩增

6.6.1PCR反应体系为50μL，每个PCR反应管的反应液配置为：依次加入10×PCR缓冲液5μL，

上/下游引物各1μL、dNTPMixture（各2.5mM）4μL、提取的核酸DNA2μL、Taq聚合酶1μL，

加水至总体积50μL。2000r/min离心15s。

6.6.2将PCR反应管置于PCR仪进行PCR扩增。反应条件：94℃预变性5min；循环参数为94℃变

性50s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；第三步72℃再延伸10min结束。

6.6.3PCR扩增也可采用市售等效的商品化PCR检测试剂盒，按说明书的要求进行操作。

6.7电泳

用1×TAE电泳缓冲液配置1.0%的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。

取5μLPCR扩增产物与0.5μL10×加样缓冲液混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶板的加样孔中。在

电泳时，使用5μLDNA相对分子量标准物（DL2000DNAMarker）作对照。以5V/cm的电压进行电泳，

30min后在紫外凝胶成像系统观察结果。

7结果判定

7.1试验成立的条件

当鸭瘟强毒阳性对照、鸭瘟弱毒阳性对照分别出现约1019bp和491bp的特异性条带，阴性对照、

空白对照均无扩增条带（见附录B），试验结果成立。

7.2试验结果判定

当待检样品出现约1019bp条带，判定为鸭瘟强毒阳性；当待检样品出现约491bp条带，判定为鸭

瘟弱毒阳性；当待检样品出现约1019bp和491bp两个条带，判定为鸭瘟强毒、鸭瘟弱毒双阳性；当待

检样品无特异性扩增条带（见附录B），判定为鸭瘟强毒、鸭瘟弱毒双阴性。

必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待测样品的测序结果与参考序列进行比较。与参考序

列（见附录C中的C.1）核苷酸同源性在99.0%以上，判为鸭瘟强毒阳性；与参考序列（见附录C中的C.2）

核苷酸同源性在99.0%以上，判为鸭瘟弱毒阳性。

3

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A

A

附录A

（规范性）

试剂的配制

A.10.01M磷酸盐缓冲液（PBS）

NaCl8.0g

KCl0.2g

Na2HPO4·12H2O2.9g

KH2PO40.2g

将上述试剂溶于800mL水中，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

A.210%十二烷基磺酸钠溶液

取10g的SDS粉末溶解在70mL水中，加热到70℃，搅拌待完全溶解后，定容到100mL，高压灭菌

后室温保存。

A.3蛋白酶K（10mg/mL）

取100mg的蛋白酶K溶解在6mL水中，定容到100mL，-20℃保存。

A.43M乙酸钠（Ph5.2）

取408.1g三水乙酸钠溶解于700mL水中，用冰乙酸调节pH至5.2，定容到1000mL，高压灭菌后室

温保存。

A.51×TAE电泳缓冲液

A.5.1配制0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）

二水乙二铵四乙酸二钠18.61g

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水定容至100mL

A.5.2配制50×TAE电泳缓冲液

羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL

灭菌双蒸水定容至1000mL

用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。

A.5.3配制1×TAE电泳缓冲液

50×TAE电泳缓冲液20mL

灭菌双蒸水定容至1000mL

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A.6溴化乙锭溶液

溴化乙锭20mg

灭菌双蒸水定容至20mL

也可采用市售商品化的更环保、更安全Goldviewer等荧光染料。

A.71.0%琼脂糖凝胶

琼脂糖1.0g

1×TAE电泳缓冲液定容至100mL

置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃～60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5µL，摇匀后倒入

制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。

A.810×加样缓冲液

聚蔗糖25g

溴酚蓝0.1g

二甲苯青0.1g

灭菌双蒸水定容至100mL

5

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B

B

附录B

（资料性）

电泳图

鸭瘟强弱毒核酸PCR检测结果电泳图见图B.1。

M12345678

bp

2000

1000

750

500

250

100

标引序号说明：

M——DL2000DNAMarker；

1——鸭瘟弱毒阳性对照；

2——鸭瘟强毒阳性对照；

3——阴性对照；

4——空白对照；

5——待检样品-鸭瘟弱毒阳性；

6——待检样品-鸭瘟强毒阳性；

7——待检样品-鸭瘟强弱毒双阳性；

8——待检样品-鸭瘟强弱毒双阴性。

图B.1鸭瘟强弱毒核酸PCR检测结果电泳图

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C

C

附录C

（资料性）

参考序列

C.1鸭瘟强毒参考序列

TAACGTCGTTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTGCCAGTCAACCGGCTCAACGCCACGACCTTCCAGGTATTCATTGGCCTTTTTAAAAT

GATCACATAAGATGAATGGCTTTCTAGACAGCGGTGATGGATGGCTATATTTCAAAACACAATGCTTGCGACAATTCGGTTTGAACGCT

TCCTGAGCATGCACGCCCCACAGCATAAACACTAATCCTTCCTTATTGTCATGTAACCATTGTAATACAGATTTGACTATTTTTGACCA

ACCAACGTCTACATGCGATCCCGGATGCCCCTTTCGTACTGTGAGGGTGGTATTTAACAACAAAACTCCAGCTTTGGCCCATGCCTCTA

GGCAGCCATGATCAACAATTTTCGTCTCTGGGTAAGAGCGCCGAACGGCCGATAATATATTACGTAGGCTAGGAGGTATCTGAATACCT

CTCCGCACGCTGAATGCGAGCCCGTGAGCCTGGCCGGGTTGATGATATGGATCTTGCCCAACTATGAT