紫花地丁病原菌的鉴定

ADDINCNKISM.UserStyle紫花地丁病原菌的鉴定摘要：2019年在甘肃省临夏市和政甘肃中医药大学药用植物园中发现了紫花地丁感病植株，其症状表现为在叶片上出现黑色圆点状的密集的病斑，中间略有凸起。在NA培养基上分离纯化后进行细菌的烟草过敏性坏死反应，生理生化实验和紫花地丁上的致病性实验，以确定分离的细菌是否有致病性。实验结果表明分离的细菌对烟草有致病性；为格兰氏阴性菌，耐盐性强，可以利用葡萄糖、木糖和甘露糖，对PH的适应范围广，代谢产生色氨酸酶、酪氨酸酶和过氧化氢酶，可以利用柠檬酸盐，为好氧型细菌；对新鲜未感病的紫花地丁有致病性。由实验可知从紫花地丁上分离得到的细菌是致使紫花地丁发病的病原菌。关键词：紫花地丁；病原菌；生理生化；致病性in2019,theplantofViolaphilippicawasfoundinthemedicinalbotanicalgardenofLinxiacityandgansuuniversityoftraditionalChinesemedicineinGansuprovince.Thesymptomsshowedthattheblackdot-likedensespotsappearedontheleaves,withaslightbulgeinthemiddle.AfterisolationandpurificationonNAmedium,theallergicnecrosisreactionoftobacco,physiologicalandbiochemicalexperimentsandpathogenicityexperimentsonViolaphilippicawerecarriedouttodeterminewhethertheisolatedbacteriawerepathogenic.Experimentalresultsshowedthattheisolatedbacteriawerepathogenictotobacco.Gram-negativebacteriahadstrongsalttolerance,andcoulduseglucose,xyloseandmannosetoadapttoPH.Enzyme,tyrosinaseandcatalase,whichcanusecitrate,areaerobicbacteria;itispathogenictofreshandunsentimentalpurpleflower.TheresultsshowedthatthebacteriaisolatedfromP.purpureawerethepathogenicbacteria.Keywords:Phellodendronamurensis;Pathogen;PhysiologyandBiochemistry;Pathogenicity紫花地丁（Violaphilippica）是堇菜科（Violaceae）堇菜属（ViolaL.）多年生草本植物。主要分布在我国的黑龙江、吉林、辽宁、山西、陕西、甘肃等地。以全草入药，性寒味微苦，有清热解毒的功效。所含黄酮苷类及有机酸对金色葡萄球菌、猪巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌都有较强的抑菌作用，素有“解毒草”之称。据文献记载，将紫花地丁简称地丁，始自明末清初，李中立[1]ADDINCNKISM.Ref.{6768D0C083904fc4B029475F2151DC5B}《本草原始·草部下》地丁条云：“花开有紫、白二种。根直如钉，入药用紫花者，故俗呼为紫花地丁。”目前，已从紫花地丁中分离得到70多种化合物，研究表明，紫花地丁在抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤方面有广泛的作用。文献对紫花地丁的细菌性病害记载较少[2-3]。本实验的目的是确定致使紫花地丁发病的病原菌，为中药的病害防治和药材的规范化生产提供依据，以及提高药材的质量和产量。实验如下。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌种图1.紫花地丁感病原植物2019年x月x日于甘肃省临夏市和政甘肃中医药大学药用植物园中采集具有典型症状的紫花地丁病株压制成标本，带回实验室在NA培养基上经过分离纯化得到1个菌株，编号为zhdd。原感病植株如下图。（图1）图1.紫花地丁感病原植物1.1.2供试植物烟草过敏性坏死反应用的是新鲜的烟草叶片、致病性测定用的是健康的未感病的紫花地丁植株。1.1.3培养基分离、纯化和保存细菌用的均是NA培养基（牛肉浸膏3g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、琼脂17g、水1000ml）。1.2方法1．2.1病原菌分离将剪刀、玻璃棒、培养皿、蒸馏水放在高压蒸汽灭菌中以115℃的条件灭菌30min备用。选择有病斑的叶片，用剪刀剪取病斑后放在培养皿中，加入0.1%的升汞将病斑浸没消毒2min，然后用灭菌水冲洗3次，再用玻璃棒将病斑捣碎，放置32min，使菌体从叶片的组织中释放出来。将接种环放在酒精灯外焰上灼烧灭菌3次，放冷后用接种环沾取组织液，用平板划线的方法将其接种在NA培养基上，将接好种的培养基放在25℃的恒温培养箱中培养，48h后观察菌落的生长情况[4]。1.2.2病原菌纯化和保存将接种环在酒精灯灭菌后沾取分离得到的单菌落再一次用平板划线的方法接种在NA培养基上培养，将接好种的培养基放在25℃的恒温培养箱中继续培养24h使菌种纯化。将配置好的NA培养基分装在试管中，放置成斜面备用。将接种环灭菌后沾取纯化后的菌落，接种在试管中，放在25℃的恒温培养箱中培养24h，转移到冰箱中保存，用以之后的烟草过敏性坏死反应、各项生理生化实验和致病性的测定。1.2.3病原菌的形态鉴定将保存的细菌重新活化后接种在NA培养基上培养，对单菌落的形态、大小、颜色和质地等进行观察。挑取活化24h的菌落放在干净的载玻片上，滴加灭菌将细菌涂成一层薄层，将细菌固定在载玻片上，滴加结晶紫初染1min,用蒸馏水冲洗后滴加碘液媒染1min，用蒸馏水冲洗后，再用95％的酒精脱色30s，最后滴加番红复染1min，晾干后放在油镜下观察其颜色及形态[5]。1.2.4烟草过敏性反应采取生长旺盛的烟草叶片插在三角瓶中，加入蒸馏水，放在25℃的光照培养箱中缓苗一夜备用。将保存的细菌重新接种在NA培养基上活化24h后，加入适量的灭菌水配置成细菌悬浮液，用灭过菌的注射器吸取菌悬液注射在新鲜的光合作用旺盛的烟草叶片的背面，选择避开叶脉的地方，用注射器吸取灭菌水用同样的方法注射在烟草叶片上作对照。将处理和对照放在25℃的光照培养箱中培养，从第6h起开始观察记录叶片上出现的现象，之后每隔2h观察记录一次[6]。1.2.5生理生化鉴定方法生理生化实验主要有：耐盐性实验、糖醇发酵类实验、生长PH的测定、吲哚实验、柠檬酸盐的利用实验、明胶液化实验、酪朊水解实验、酪氨酸水解实验、V-P测定实验、接触酶实验、淀粉水解实验、卵磷脂酶实验、苯丙氨酸脱氨酶实验、甲基红实验、厌氧实验、生长温度测定等试验方法，主要参照《植物病害研究方法》《常见细菌系统鉴定手册》等书中的方法进行[7-8]。1.2.6紫花地丁上致病性测定将紫花地丁采集后，在近基部包上棉花放在烧杯中，让棉花吸收足量的水分，在叶片上喷水后放在25℃的光照培养箱中缓苗一夜备用。将菌种重新接种在NA培养基上活化24h后加入适当的灭菌水配置成细菌悬浮液，选择新鲜健康的未感病的紫花地丁作供试材料。第一种方法是将昆虫针5根扎成一把，在酒精灯上灼烧灭菌后沾取菌悬液在紫花地丁上以针刺的方法接种，对照用灭过菌的昆虫针沾取灭菌水针刺在紫花地丁的叶片上。第二种方法是用灭过菌的棉签将菌悬液涂抹在紫花地丁的叶片上，对照是不做任何处理[9-10]。向保湿的箱子中喷入足量的蒸馏水后将紫花地丁的处理和对照分开放在袋子的四个角上，并在箱子中放一盆水以保持其湿度，将袋子放在室外光照充足的地方，48h后揭开箱子观察记录植株表现的症状。2结果与分析2.1病原细菌分离和纯化经过分离纯化共获得了1种细菌，记为zhdd。菌落在培养基上生长较慢，菌落稍透明，直径约1-2mm，产生黄绿色的色素。2.2对病原菌的形态鉴定对接种的紫花地丁的单菌落进行观察，其直径约1-2mm,稍透明，会产生黄绿色的色素。将活化24h的单菌落用革兰氏染色剂经过初染、媒染、脱色和复染四个步骤后，放在油镜下观察为红色杆状的细菌，所以zhdd是革兰氏阴性菌。（图3）图3.革兰氏染色图图3.革兰氏染色图图2.紫花地丁单菌落图2.3对烟草过敏性反应图4.烟草过敏性坏死图将zhdd菌悬液接种在烟草叶片上，放在光照培养箱中恒温培养，zhdd的处理在第6h即出现较小的过敏性坏死斑点，斑点呈褐色，并在之后的观察中逐渐扩大，对照的烟草没有在叶片上出现任何斑点。（图4）图4.烟草过敏性坏死图2.4对生理生化的检测zhdd的各项生理生化测定结果如下。（表1）供试菌株为好氧菌，2％、5％和7％的耐盐性实验为阳性；10％的耐盐性实验阴性，糖醇发酵类均阳性，生长PH值为5.7和6.8均为阳性，吲哚实验、酪朊水解实验、酪氨酸水解实验、接触酶实验、苯丙氨酸脱氨酶实验为阳性，柠檬酸盐利用实验为阳性，V-P测定为阳性，淀粉水解为阴性，卵磷脂酶实验细菌不能正常生长，甲基红实验为阳性，41℃下可以进行正常的生命活动。注：“＋”表示反应为阳性，“－”表示反应为阴性。卵磷脂酶实验中细菌不能在培养基上生长。2.5对在紫花地丁上的致病性测定图5.紫花地丁针刺处理图将zhdd的菌悬液用针刺和涂抹的方法接种在新鲜健康的紫花地丁植株上，放在室外阳光充足的地方，保持湿度。在48h观察时其叶片时发现用针刺的方法接种的植株，在针刺的部位，叶片的正面和背面都出现了淡褐色水渍状的坏死病斑，对照的叶片上只表现出针刺的痕迹；用喷洒的方法处理的紫花地丁后，处理和对照在叶片上没有出现明显的发病的症状。（图5）图5.紫花地丁针刺处理图3结论与讨论从紫花地丁的感病植株上经过分离和纯化共得到一种细菌，经过细菌的形态观察发现zhdd是红色杆状的革兰氏阴性菌。经过zhdd的烟草过敏性坏死反应，发现烟草叶片上出现病斑，说明zhdd对烟草有致病性。经过15项生理生化实验可知zhdd为好氧菌，在2％和5％的盐环境中生命活动旺盛，在7％的盐环境中生命活动减弱，在10％的盐环境中细菌不能正常生长；zhdd在代谢活动中可以利用木糖、葡萄糖和甘露糖；zhdd在PH为5.7和6.8的环境中可以进行正常的生命活动；zhdd在代谢过程中可以产生色氨酸酶、酪氨酸酶、过氧化氢酶和苯丙氨酸脱氨酶，不会产生卵磷脂酶和淀粉水解酶；zhdd可以将柠檬酸盐作为碳源被利用；zhdd在41℃的条件下可以正常生长。将zhdd接种在新鲜健康的紫花地丁上，以针刺接种的紫花地丁在叶片上出现水渍状淡褐色病斑，有发病的症状，而涂抹处理的叶片上没有任何症状出现，说明针刺处理的效果较涂抹处理的更好。实验结果表明zhdd对紫花地丁有致病性。。可以由烟草过敏性坏死反应、细菌的形态观察、生理生化实验和紫花地丁上的致病性检测结果说明zhdd是导致紫花地丁发病的病原菌。参考文献：周驰,张启伟,常章富.紫花地丁的本草考证[J].中国中药杂志,2010,35(22):3086-3088.[2]李永生,何希瑞,杨燕,张春玲,常育,何睿.紫花地丁化学成分与药理活性研究新进展[J].环球中医药,2013,6(04):313-318.[3]张兵锋.紫花地丁的研究进展[J].宜春学院学报,2008(02):88-90.[4]余磊,秦西云,杜静,汪安云,赵莹莹,商珊,申敦晋,李昊,黄琼.云南烟草上1种新的细菌性病害病原鉴定[J].植物病理学报,2009,39(03):243-248.[5]严玉宁,何红,叶艺俊,卢文标,文尚华,张秀清.香蕉叶鞘腐败病病原鉴定[J].植物病理学报,2011,41(02):124-130.[6]吕祝邦,李敏权,惠娜娜,王立,漆永红