T-CVMA 285-2025 牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法

牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法2025-9-30发布2025-9-30实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国兽医协会提出并归口。本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科技有限公司、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、娄底市动物疫病预防控制中心、江苏省动物疫病预防控制中心、确山县畜牧技术服务中心、开封市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：孙雨、胡冬梅、李琦、宋晓晖、于宁卫、孙航、李晓霞、司国辉、邢嶷文、邹联斌、阚威、李静、郑思思、林元清、王新杰、孙晓明、高姗姗、袁晓涛、徐鹏、闫新博、郑辉、王斯、张旭、剡文亮、刘洁琼、苏贵成、吴镜、谭庆辉、丁朝阳、王建、柴旭斓、王贞贞、谢军伟。1本文件规定了牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB19489实验室生物安全通用要求实时荧光PCR:实时荧光聚合酶链式反应(Real-timepolymerasechainreaction)BHQ:无荧光淬灭基团(Blackholequenchbp:碱基对(Basepair)DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)5.1.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T668224%氢氧化钠、柠檬酸钠一磷酸缓冲液、4%硫酸溶液，配方见附录A。5.1.3曲拉通100。5.1.4DNA提取相关试剂见附录A或其他等效商品化核酸提取试剂。5.1.5实时荧光PCR检测试剂为商品化试剂。含有牛布鲁氏菌靶基因片段(参考序列见附录B.1)、牛分枝杆菌靶基因片段(参考序列见附录B.2)高速冷冻离心机、电子天平、荧光PCR仪、-20℃低温冰箱、pH计、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、可调移液器(2.5μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)和各规格移6mL血液加1mL抗凝剂。3组织，放在含有保护液(50%甘油生理盐水)。组织样品应不少于2g,用灭菌容器密闭送检。妊娠母牛用无菌拭子在子宫绒毛膜间隙反复采集渗出物5～10次后放在含有保护液(50%甘油生理盐水)。流产母牛用无菌拭子反复采集阴道分泌物5～10次后放在含有保护液(50%甘油生理盐水)。直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种待检样品在2℃~8℃保存不应超过24h。样品采集后，置于加冰袋的保温箱中，密封，24h内送低温冰箱保存。-20℃保存不超过三个月；-80℃以下可长期保存。心10min。弃上清，若红细胞裂解不完全，需采用灭菌双蒸水取10mL奶液，加100μL曲拉通100,振荡混匀，2500g离心20min,弃上清，取沉淀。加1mL0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.6),充分振荡混匀。将沉淀悬浮液移入微量离心管，15000g离心10min,4在痰液样品中加入2倍～4倍体积4%氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置30min,间或振荡混匀，使其充分液化(无明显固状物并且吸出时无脱丝现象即为液化完全。若液化不完全，可适当再加入少量4%氢氧化钠溶液直至液化完全)。15000g离心10min,弃上清，加1mL0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.6),充分振荡混匀，15000g离心10min,弃上清，重复本步骤1次。收集沉淀物置-20℃贮存备用。取适量组织样品(剔除脂肪、被膜),剪碎，按1:5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液(例如，1g组织样品，加入5mL缓冲液),充分研磨。加等量4%氢氧化钠溶液，继续研磨5min～10min,使组织液化。移入离心管，充分振荡，75℃温浴0.5h～1h,取上清(避免吸取粗渣),15000g离心10min,弃上清，加等量0.01mol/L磷酸缓冲液(p取粪样1g~2g,按1:5的比例加入4%硫酸溶液(例如1g粪样，加5mL液体)充分振荡混匀，室温静置0.5h～1h,取上层约3mL液体(避免吸取粗渣),5000g离心1min,取上清，15000g离心10min,弃上清，加等量0.01mol/L磷酸缓冲液，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min弃上清，重复本步骤1次，收集沉淀物置-20℃贮存备用。分振荡混匀，15000g离心10min,弃上清，收集沉淀物置-20℃贮存备用。8.1若选用附录A中所列试剂提取DNA,则参g)室温静置2min,12000×g离心1min,离心管中液体为模板DNA。得到的核酸模板尽量在2h内进行实时荧光扩增，若需长时间保存须放置一70℃冰箱，但8.2若使用DNA试剂盒提取DNA,则按试剂盒说明书进行操作。也可采用其他等效的DNA提取方9双重实时荧光PCR反应牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光定量PCR反5牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PC当所有阳性对照的FAM和HEX检测通道均有典型的S型扩增曲线且Ct值均应≤30,阴性对照的FAM和HEX检测通道均无扩增曲线且Ct>35或10.2.1牛布鲁氏菌阳性：若被检样本仅FAM检测通道出现典型的S型扩增曲线，且Ct值≤32;而HEX检测通道Ct值>35或无Ct值，且无典型的S型扩增曲线，表示样品中含有牛布鲁氏菌核酸。10.2.2牛分枝杆菌阳性：若被检样本仅HEX检测通道出现典型的S型扩增曲线，且Ct值≤32;而FAM检测通道Ct值>35或无Ct值，且无典型的S型扩增曲线，表示样品中含有牛分枝杆菌核酸。10.2.3牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌阳性：若被检样本FAM检测通道与HEX型扩增曲线，且Ct值≤32,表示样品中同时含有牛布鲁氏菌核酸和牛分枝杆菌核酸。10.2.4可疑：若被检样本的PCR反应体系FAM和/或HEX检测通道出现典型S型扩增曲线，且32<Ct值≤35,此时应对样本进行重复检测。如重复实验结果仍为32<Ct值≤35,且出现典型S型扩增或无Ct值，则判定样本牛布鲁氏菌核酸和牛分枝杆菌核酸6(资料性)样品保存试剂和DNA提取试剂的配制A.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(pH8.0)称取18.61g乙二铵四乙酸二钠，溶于80mL双蒸水中，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至8.0,最后加双蒸水定容至100mL。A.2保护液(50%生理盐水)将生理盐水缓慢倒入盛有甘油的容器中，按1:1体积比充分混合。A.30.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)称取34.00g氯化钠、6.20g磷酸氢二钠、0.81g磷酸二氢钠溶于800mL双蒸水中搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调节溶液至7.6,加双蒸水定容至1L。采用121±2C/0.1MPa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.44%氢氧化钠取8g氢氧化钠，加入200mL双蒸水中搅拌至完全溶解。A.5柠檬酸钠一磷酸缓冲液先配制pH6.8磷酸缓冲液。A液(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液):称取15.16g磷酸二氢钠加双蒸水搅拌至完全溶解后定容至0.5L。B液(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液):称取35.82g磷酸氢二钠加双蒸水搅拌至完全溶解后定容至0.5L。分别量取51mLA液、49mLB液，混合即成100mL磷酸缓冲液(pH6.8)。称取2.84g柠檬酸钠，加入100mLpH6.8磷酸缓冲液中搅拌至完全溶解。采用121±2C/0.1MPa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.64%硫酸溶液量取20mL浓硫酸，加入500mL双蒸水中，混匀。A.7裂解液称取118.2g异硫氰酸胍、11.6g氯化钠溶于800mL双蒸水中搅拌至完全溶解，再加入20mLpH8.0浓度0.5mol/L的乙二铵四乙酸二钠溶液，最后加双蒸水定容至1L。A.8洗涤液称取17.9g磷酸氢二钠、7.8g磷酸二氢钾、2.25g氯化钠于200mL双蒸水中搅拌至完全溶解，加双蒸水定容至250mL,再加入750mL无水乙醇，充分混匀。A.9洗脱液称取71.6g磷酸氢二钠、31.2g磷酸二氢钾于800mL双蒸水中搅拌至完全溶解，最后加双蒸水定容至1L。7(资料性)5′-CTCGTGCTAGCAATTTTCTCGCAGCCTCATTTTCCACAATGCCTGCCCGCTTTCGCACAGGAGAATCAGATGACGACGCAGCCCGCGGGAAGGCATGATGACGGCCTCGCCCGATATGGCCATTCTCAATCTCTCGAGACCGCGCGCGAAGCCATGACCGCGAATAATGGAAGGCCGGCATCGAAGATCGCGATCTCCAGATCTATCCTGACGACAAGAACAACCTGAAAGAGCCTACCATCACCGGCTATTCTGTATCCACCAGTCTCACGGTTCGCGTGCGCGAACTGGCCAATGTTGGAAAAATTTTGGATGGTGTTAATCAGGGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAATCCCTCCGCCGCAAGCGCGCAGTGGCCAATGCCATTGCCAAGGCGAAGACGCTTGCCGGCTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAGTGAACTGAGCCGCCCGCCCATGCCGGACAGTTCAGAACCATGCTAGCAGCCGCACCGGACAATTCCGTGCCGACAGCTATAACGTATCGGTCAATGTCGTTT5′-GTGGAAGCGACCCGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGTAGGTCCTGCGGGCTTTGCCGCGGGTGGTCCCGGACAGCATCTGGCCACCTCGATGCCCTCACGGTTCAGGGTTAGCCACACTTTGCGGGCACCGTAAAC以布鲁氏菌和牛分枝杆菌基因组DNA为模板，利用设计的2对特异性引物分别进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接至pMD19-T载体构建重组质粒pMD-Bru、pMD-Mtb,经菌液PCR鉴定、测序加以验证。利用紫外分光光度计检测2氏菌和牛分枝杆菌阳性对照所需的重组质粒标准品母液。将母液10倍系列稀释之后，可作为牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方8用500μLTEBuffer(pH8.0)对pMD-Bru、pMD-Mtb质粒进行溶解和10倍梯度稀释，按本标准建立的方法测定FAM通道和HEX通道Ct值。选择FAM通道和HEX通道Ct值在23～28之间的稀释倍数作为阳性对照。B.4阴性对照的制备灭菌双蒸水：将双蒸水高压灭菌后作为阴性对照。9(规范性)引物和探针序列牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的引物、探针的名称与序列见表B.1。病原引物和探针序列(5′→3')牛布鲁氏菌FAM一TCTCCAGACAGGCGGCATCAATAT牛分枝杆菌(资料性)双重实时荧光PCR反应体积(μL)终浓度(μM)引物Gdh-R引物Bru-R引物Mtb一R探针Bru-P(FAM标记)探针Mtb一P(HEX标记)无核酸酶水补齐至总体积液充分混合后，最后加入模板，短暂离心，按照下列反应程序进行荧光RT-