凝胶层析课件

凝胶层析

(Gelchromatography)12

凝胶层析(Gelchromatography)分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限制扩散层析等。是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。3第一节凝胶层析的基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA，它包括填料的骨架体积VGM，填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。VA=V1+V0+VGM

45原理当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。Ve=V0+ViKd

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6（一）平衡排除理论当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。7（二）扩散分离理论溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1．流速为0.65ml/min；2．流速为2.0ml/min溶剂为甲苯

8（三）流动分离理论

红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快.较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。

9分离过程三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。10分离过程最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。“部分排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi

11分配系数Kd排阻系数：

当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。12物质的Kd值13凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。（4）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。14第二节凝胶的结构和性质一、葡聚糖凝胶

(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶

（Bio-GelP）四、琼脂糖类凝胶

（Sepharose）

五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）

15一、葡聚糖凝胶(Sephadex)商品名为SephadexG类.交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。

16SephadexG编号意义：

1、吸液量；

2、溶涨时间；

3、凝胶孔径；

4、分离范围蛋白质、多糖17葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度大（SephadexG－150

）小大慢大大小小（SephadexG－50

）大小快小小大18葡聚糖凝胶（G类）的规格19葡聚糖凝胶（G类）特点1、孔径。2、稳定性。3、吸附作用。4、芳香族化合物和杂环化合物。20保存保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用60~80℃吹干。半缩法：21二、修饰葡聚糖凝胶

(ModifiedSephadex)（一）亲脂性葡聚糖凝胶（LipophilicSephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。（二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex–ion-exchanger）将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。22交联葡聚糖离子交换剂23

（三）Supperdex系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）Sephacryl系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。24Supperdex系凝胶25Sephacryl系凝胶26三、聚丙烯酰胺凝胶

商品名为生物凝胶-P（Bio-GelP）。该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。特点：

1、孔径；

2、稳定性、强度；

3、无非特异吸附，保存方便；

4、编号反映出它的分离界限。

27聚丙烯酰胺凝胶的性质

生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-GelP-100。28四、琼脂糖类凝胶

（Sepharose）

（一）琼脂糖凝胶结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。29琼脂糖凝胶特点1、没有共价键的交联。2、孔径琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。5、分离范围大。6、颗粒强度差。30琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。31几种蛋白质Kav值

32（二）架桥琼脂糖凝胶（SepharoseCL）

架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经1，3-二溴丙醇交联的凝胶。它的凝胶孔径均匀，机械强度明显加大。对热和化学物质的稳定性大大增加,在pH3~14范围内稳定。

33SepharoseCL的性质

34（三）超胶（Utro-gelACA）所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。35

（四）

Superose系凝胶

是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的高速凝胶过滤介质。有6%和12%两个规格。36五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特点：1、化学稳定性高、强度大。

2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。

3、编号表示其孔径,越大，分离分子量也越大。37六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品,

分离范围为1600～40000000。生物珠（Bio-BeadS），适于分离分子量较小的物质。分离不溶水的有机物质。38常用的商品化凝胶介质

39一第三节

凝胶层析的实验条件和操作

4041第三节

凝胶层析的实验条件和操作

一、凝胶的选择和处理

二、凝胶层析柱的设计和制备

三、凝胶层析操作

四、主要参数测算

42一、凝胶的选择和处理（一）凝胶的选择(1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。431．类分离（1）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的Kd=1。选用SephadexG-25凝胶，分离范围1000～5000。442．分级分离（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。（2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。（3）分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。如用SephadexG-200分离血清蛋白质的效果要比SephadexG-150为好。45（二）凝胶粒度的选择细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。46（三）凝胶的预处理使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。热法溶涨(水浴)。47二、凝胶层析柱的设计和制备

（一）层析柱的选择层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，柱比5:1到10:1即可。对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积25倍以上，甚至多达100倍。柱比在25至100之间。48凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系

49（二）凝胶柱的装填常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。空柱中应留约1/5的水或溶剂.不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。50（三）凝胶床的检查和维护观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流，色带是否平整。检查物质为蓝色葡聚糖。51操作压

层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。

52层析床横截面所允许的最大压力

53三、凝胶层析操作（一）样品和加样蛋白质类样品浓度:不大于4%。加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。

样品粘度对洗脱曲线的影响柱：交联葡聚糖G-25，4×85cm；流速180ml/h；样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠；（1）相对粘度为0.118；（2）相对粘度为0.042；（3）相对粘度为0.01054方法

（1）直接将样品加到层析床表面。（2）样品比重高。55

（二）洗脱与收集1、洗脱剂。2、流速（操作压、型号、粒度）。3、分部收集器。56（三）凝胶柱的再生反冲。重新装柱。57四、主要参数测算V0及Vi的测算Kd及Kav的值分辨率R58（一）V0及Vi的测算1．重量法Vt=Vo+Vi+Vg=π/4·d2h

Vi=g·WrVo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。2．过柱法已知物质的洗脱体积Ve=Vo+KdVi如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。59（二）分配系数测定分配系数当测得某物质的Ve及Vt

，内水体积Vi及外水体积V0时，算出Kd及Kav的值。Kd及KavVe被认为是一种组分对于某一个凝胶柱的特征常数。60（三）分辨率凝胶层析中，两物质（A和B）和分辨率（R）定义为：

当R值＞1，两物质完全分开，小于1时则不能完全分离。分离时较大柱床体积可增大△Ve

。减少（WA+WB）的方法是适当浓缩样品、选用小粒度凝胶、流速适当减慢等。61五、凝胶层析的扩展

（一）上行凝胶层析

利用流动和重力方向相反的上行层析法，即洗脱液向上流动的层析法。反转柱（二）增加有效床高

-提高分辨率

（1）串联层析：有效柱长

（2）循环层析：即在同一根或两根柱上，样品反复进行层析。62循环层析图7.21人血浆蓝蛋白的循环层析分离柱：交联葡聚糖凝胶G-100，3.2×93cm；样品：5.2ml（3%）；流速：20ml/h；洗脱液：0.1mol/LpH8.0Tris缓冲液（含0.5mol/LNaCl）

简单的循环层析装置选择阀用于选择待循环液或废液，样品从A→D上柱，经B→D洗脱，经检出的废液由E→C排出，需循环的物质由E→D进入层析柱。

63（三）薄层凝胶层析

用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体，称“薄层凝胶层析”。仅适用于分析。特点：

生化分析；设备简单，操作方便，分离迅速；分辨率高；同一薄板可同时分析数个样品；64第四节

色谱峰变宽的问题

样品的洗脱曲线不是一个窄的矩形峰，而是一个较宽的高斯峰。洗脱曲线：样品的分子量分布，仪器造成的峰加宽效应。

65一、溶液通过色谱柱造成的峰加宽Giddings提出的无规则行走模型。溶质分子本身的运动是无规则的。（一）分子扩散（二）涡流扩散（三）流动相中传质阻力（三）固定相中传质阻力66（一）分子扩散

浓度梯度

(HETP)d=2γDm/V

（HETP）d—溶质分子纵向扩散对塔板高度的贡献γ—扰动因子，表示柱内填料对于溶质分子扩散的扰动作用。Dm—是溶质分子在流动相中的扩散系数；V—流速。(1)小而均匀的填料(2)适当的溶剂(3)提高流速67（二）涡流扩散与填料颗粒的形状，尤其是颗粒尺寸有关。(HETP)e=2λdp

dp—填料颗粒的直径；

λ—是与填料及装填有关的常数。(1)小而均匀的填料(2)粒度一致且装得均匀68（三）流动相中传质阻力流动相在柱中的流速是不均匀的。溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度，径向扩散。

（HETP）m=ωd2pV/Dm

(1)填料装得规整、紧密。(2)采用粒度小的填料；(3)降低流速；(4)选用合适的溶剂（溶质的扩散系数较大）。69（四）固定相中传质阻力在色谱柱中溶质分子的一部分F在流动相中，而另一部分（1—F）在固定相中。分子从固定相中脱离出来到流动相中去，而另一些分子则从流动相进入固定相中。结果：（1）溶质层变宽；（2）溶质层作为一个整体以FV的速度运动。70色谱柱内造成的峰加宽填充介质粒度越小,峰加宽效应越小。71溶液在柱外产生的峰加宽

（一）连接管路

当液体流经细管时，径向速度梯度使矩形溶液脉冲变成抛物面形，并导致浓度的径向梯度。减小管径

（二）检测池

72二、峰宽的表示方法W是峰宽，它是通过曲线的两个拐点的切线和基线交点之间的距离。拐点之间的距离等于2δ，δ称为峰的标准偏差。δ是衡量峰的宽度的量。

W=4δ

73分离效果—分离度

分离效果用两个峰的峰尖距离以及两个峰的峰宽来表示。分离度Rs的定义为：选择性决定分离能力，表现在两个峰之间的距离上；柱效决定峰的扩张程度，表现在峰宽W和标准偏差σ上。74分离能力：填料颗粒的孔径大小孔径分布溶质分子量分布.柱效：

溶质分子的扩散填料的粒度和分布填料颗粒的几何形状柱子的尺寸流速75第五节凝胶层析的应用一、脱盐和浓缩二、分子量测定三、分离纯化76一、脱盐和浓缩脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。交联度大，凝胶颗粒强度好；凝胶粒度大，流速高。