先进表征方法与技术 课件 4.5.单颗粒光谱学

4.5.单颗粒光谱学5.单颗粒光谱学纳米技术的进步使得纳米发光材料在成像、传感和光子器件的应用中取得了巨大的进展。尽管材料是从同一批合成的，但每个纳米颗粒的尺寸、形状、缺陷、表面基团和电荷往往是不同的，即使是同一颗粒也存在不均匀的分布。这些是与材料科学、晶体学和界面化学相关的基础研究中的核心问题，对再现性、功能性和应用至关重要。传统光谱仪可以显示出纳米颗粒的统计性质，例如平均发光强度，平均荧光寿命等，但是无法分析单个颗粒对激发光源的光谱响应。因此，对纳米材料的组元（即单个发光纳米颗粒）的光物理性质进行测量极其重要。原子力显微镜（AFM）和电子显微镜（SEM、TEM）是用来观测单个纳米颗粒结构的重要工具，但无法获得颗粒的光学性能。单光子探测器的使用极大推动了纳米发光材料的发展，5.单颗粒光谱学具有高量子效率和低噪声的单光子雪崩二极管（SPAD）和电子倍增电荷耦合器件（CCD）的进展使单颗粒荧光光谱和成像能够在显微镜系统（例如光镊、超分辨系统）中广泛应用。光镊通过高数值孔径的物镜聚焦激光光束操纵微纳级单个颗粒，来实现对其光学、力学性质的测量。而超分辨系统可以分辨出超过衍射极限的单个纳米颗粒，可以实现宽场纳米级分辨率成像，是单颗粒材料的表征的重要手段。单颗粒光谱学（微区光谱学）是一项快速发展的技术，使得我们能够得到单个粒子的光学特征，直接提供其均匀性信息。通过测量单个粒子的光学性质的分布，可以分析颗粒尺寸、形状、表面状态、成分、几何取向，并分析局部环境对其光学性质的影响。单颗粒光谱学使人们能够辨别微观粒子的个体特征，从而提供关于其异质性的直接信息。5.单颗粒光谱学现阶段，光学显微镜系统要实现微纳单颗粒光谱测试，首先依靠高分辨率测试手段（如AFM、TEM、超分辨系统等）判断样品均匀性，样品均匀、再现性良好，才有进一步表征单颗粒的必要。随后，利用光学显微镜大致判断颗粒分散性。最后，进行单颗粒光谱测试，共聚焦显微镜系统、超分辨显微镜、单光子探测器或光谱仪的有效配合是实现单颗粒光谱测试的关键。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.1原子力显微镜与电子显微镜原子力显微镜（AFM）是一种纳米级高分辨率的显微镜，它能够在原子尺度上观察样品表面的形貌和性质。图5-33与光学显微镜集成的原位AFM（顶部）揭示颗粒的数量、几何形状和二维（2D）取向（底部）。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.1原子力显微镜与电子显微镜AFM的工作原理基于测量探针与样品表面的相互作用力来获得图像。如图5-33所示，其主要组成部分包括一个微小的针尖（通常是纳米尺度的），一个非弹性的悬臂，以及一个非导电样品表面。针尖悬浮在样品表面的上方，通过测量悬臂的振动来获取样品表面的拓扑信息。AFM的工作原理有几种模式，其中最常见的是接触模式和非接触模式。在接触模式中，尖端直接接触样品表面，并通过调整悬臂高度以保持恒定的力来获取图像。在非接触模式中，尖端悬浮在样品表面上方，通过测量悬臂的振动频率和幅度来获取表面信息，而无需实际接触样品。基于软件的AFM数据图像处理可以提供单个纳米颗粒的定量数据。以纳米棒为例，原位AFM与光学显微镜配合，可以分析颗粒的数量、几何形状和二维取向。与试样的水平悬臂位置相关联的AFM图像的分辨率受制于扫描探针直径的影响。通常，AFM仪器的垂直分辨率高于0.1nm，X-Y分辨率约为1nm。由于其高分辨率和能够在不同环境条件下工作的能力，AFM成为研究纳米尺度结构和表面性质的强大工具。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.1原子力显微镜与电子显微镜扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）是两种常见的电子显微镜，它们都使用电子束而不是可见光来实现对样品的高分辨率成像。SEM的工作原理是通过将电子束聚焦到样品表面，然后扫描整个样品表面，测量由样品表面反射的次级电子、反射电子和散射电子的信号，从而产生表面形貌的图像。SEM具有较高的表面分辨率，可以提供有关样品表面形貌、形状、纹理和表面成分的信息。TEM通过将电子束透过样品，然后测量穿透样品的电子束，产生对样品内部结构的高分辨率图像。与光学显微镜不同，TEM利用电子的波动性质，因此其分辨率远远超过可见光显微镜。TEM具有非常高的分辨率，高分辨TEM的分辨率可达50pm级，可以提供有关样品粒子尺寸、内部结构、晶体结构、生物细胞超微结构等的详细信息。这两种电子显微镜都为研究微观结构和纳米尺度的样品提供了关键的工具，但它们的应用范围和图像类型略有不同。SEM适用于表面形貌的观察，而TEM则更适合对样品的内部结构进行高分辨率成像，附带的能谱仪还可以给出元素分布等信息。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.2.光镊（OT）光的本质是电磁波，光子不仅携带有能量，而且携带有动量。当光子运行的轨迹发生变化时，例如发生散射与折射，就必然伴随着动量转移的过程，也就是说，在散射与折射的界面会发生力的作用。Ashkin在20世纪80年代使用了一种高度聚焦的激光来捕获不同尺寸的微粒，这种技术被称为光镊。光学捕获是指，通过高数值孔径的物镜聚焦激光束形成的光学势阱可以限制小物体运动。当粒子的折射率大于捕获介质（通常是水）的折射率时，激光束向粒子提供两种力，散射力和梯度力。梯度力大小正比于光场梯度Fgrad((I，其作用是将颗粒沿着梯度方向吸引至光强的最大位置。散射力大小正比于光强Fscat(I，散射力沿着激光传播的方向（即光束的k矢量方向）推动粒子。为了对颗粒形成稳定束缚，梯度力必须大于散射力，所以通常将入射光通过显微镜聚焦到很小的区域以提供足够的光强梯度。当梯度力大于散射力时，粒子可以以稳定的方式被捕获于焦点处。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.2.光镊（OT）作为操控微观颗粒的一种有效工具，光镊能够直接操控的粒子尺寸范围从几十纳米到几十微米。在光镊的帮助下，可以研究单个微米或纳米颗粒，包括量子点、上转换纳米颗粒、金纳米颗粒和硅纳米颗粒等微纳颗粒的光学性质。随着光镊技术的发展，全息光镊逐渐成为光镊领域对光阱势场、多光阱调制最有效的手段，它可以实现实时、在线、动态、三维、独立地操控多个粒子。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜早期的单颗粒光谱测试常用荧光显微镜，传统的荧光显微镜由于受到衍射限制，有相对较低的空间分辨率。受制于光波长和物镜数值孔径（NA），荧光显微镜的横向分辨率在横向约为200~300nm，轴向约为500~800nm。20世纪80年代以来,随着扫描探针显微技术的发展，在光学领域中出现了一个新型交叉学科——近场光学。近场光学对传统的光学分辨极限产生了革命性的突破。新型的近场光学显微镜（NSOM——Near-fieldScanningOpticalMicroscope，或称SNOM）的出现使人们的视野由入射光波长一半的尺度拓展到波长的几十分之一，即纳米尺度，从而实现超分辨显微成像。在近场光学显微镜中，传统光学仪器中的镜头被细小的光学探针所代替，其尖端的孔径远小于光的波长。超分辨荧光显微在发展过程中出现了三大主流技术：第一类是基于点扩散函数（PointSpreadFunction,5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜PSF）压缩的激光扫描成像方法，代表性技术是受激发射损耗（StimulatedEmissionDepletion,STED）显微；第二类是基于空间频谱扩展的宽场成像方法，代表性技术是结构光照明显微（StructuredIlluminationMicroscopy,SIM）；第三类是基于单分子定位的显微成像方法（Single-MoleculeLocalizationMicroscopy,SMLM），代表性技术是光激活定位显微（Photo-ActivationLocalizationMicroscopy,PALM）和随机光学重建显微（StochasticOpticalReconstructionMicroscopy,STORM）以及由此衍生出的其它技术。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜三类技术在成像空间分辨率、成像速度、对生物样品的光损伤等方面各有优缺点。SMLM技术的空间分辨率高，但成像速度较慢，且需要特殊的荧光分子标记；SIM技术的成像速度快，但分辨率提升较低；STED技术在分辨率和速度上都表现比较好，但缺点是对样品的光损伤较大。结构光照明显微镜（SIM）通过干涉图案实现超分辨，以条纹图案照射焦平面，条纹图案由具有接近分辨率极限的最小条纹距离的干涉激光束产生。图案的频率与其他不可分辨的“高频”样本特征相互作用，导致可以通过物镜孔径的更大规模干涉（莫尔效应）。SIM将样品中通常不可见的高频信息携带到显微镜的可见低通频带；通过改变图案的方向和相位，记录荧光结果并对得到的多个图像数据集进行适当的处理，提取携带的高频信息并重建出超分辨率图像。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜在实际使用时，通过在照明光路中插入一个结构光的发生装置（如光栅，空间光调制器，或者数字微镜阵列DMD等），照明光受到调制后，形成亮度规律性变化的图案，然后经物镜投影在样品上，调制光所产生的荧光信号再被相机接收。为了提高横向空间分辨率，通过移动和旋转照明图案使其覆盖样本的各个区域，并将拍摄的多幅图像用软件进行组合和重建。然后对频移信息进行算法解码，并在频率空间中重新组合，以重建横向和轴向分辨率提高两倍的对比增强图像。SIM可以实现横向100~130nm和轴向300~400nm的波长相关分辨率，当与超高NA（1.7）物镜相结合时，SIM的横向分辨率可以提高到~80nm。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜受激发射损耗显微镜（STED）光学设置配置如图5-34a所示，显示了相位板、激发和耗尽激光、双色镜、物镜和管透镜。探针在两个同步的超快微小对齐光源下照射，该光源由脉冲激光和环形耗尽脉冲激光组成，该耗尽脉冲激光也称为STED光束。两束激光同时照射样品，一般来说，激发激光的脉冲宽度比STED激光的脉冲宽短，第一束激光脉冲用于将物镜焦点艾里斑范围内荧光基团激发至荧光状态；第二束激光脉冲是经改良的“环形”或“甜甜圈”损耗光束，与第一束激光叠加，用于对激发焦点周围的所有荧光基团进行去激发，使物镜焦点艾里斑边沿区域处于激发态的荧光分子通过受激辐射损耗过程返回基态而不自发辐射荧光。因此只有中心区域的荧光分子可自发辐射荧光，从而获得超衍射极限的荧光发光点。图5-34b表明，当分子遇到与基态（S0）和激发态（S1）之间的能隙匹配的光子时，就会出现荧光团。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜在光子和激发荧光团之间相互作用时，激发荧光团在荧光发射发生之前通过激发发射瞬间返回基态。因此，STED光束可以有效地耗尽激发荧光团焦斑附近选定区域的荧光（图5-34c）。荧光团的失活发生在整个聚焦体积中，不包括聚焦中心。STED显微镜是一种点扩散函数（PSF）工程技术，它能够锐化焦点的大小，相当于扩展显微镜的空间频率带宽。尽管两个激光束仍然受到衍射限制，但由于STED光束被塑造成在焦点中心具有近乎零强度的点，并且向外围的强度呈指数增长，因此最终可实现的分辨率可以轻易地绕过衍射极限。STED光束对激发荧光态的非线性耗尽构成了在衍射极限下实现高分辨率成像的基础（图5-34d）。在标准STED中，从理论上来讲，由于STED损耗光为环状光束且其中心强度为零，因此环状损耗光越强，5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜则由第一束激发光激发的荧光分子所占的区域就越小，其横向分辨率就越高，STED的图像采集可以使用多个扫描光束来加速，而空间分辨率可以通过激光的强度来调节。STED在固定细胞和活细胞实验中可以达到30~50nm的横向分辨率，而使用染料优化的STED的横向分辨率达到20~30nm。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜图5-34STED显微镜的原理。（a）STED显微术的实验装置。（b）STED中荧光开关的简化能级。（c）STED显微术示意图。（d）非线性耗尽曲线被表示为归一化荧光信号随STED激光功率变化的函数。插图显示了不同最大STED强度值对应的模拟损耗率分布。单分子定位超分辨显微成像（SMLM）技术利用荧光分子的光开关效应，实现亚细胞结构的纳米精度超分辨成像。如图5.5.4所示，在SMLM中，单个荧光分子持续发光时，发光强度会出现随机涨落现象，称之为荧光闪烁。在传统的荧光显微技术中，研究的重点是如何抑制闪烁这一不利因素以获得持续的荧光发射。然而，在SMLM技术中，需要通过改变外部条件有效控制荧光闪烁特性，使得荧光分子在荧光态（ON/开）和非荧光态（OFF/关）之间转换，利用这种光开关特性实现荧光分子的稀疏激发。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜如果稀疏到足以被识别为单分子切换事件，信号就会在时空上分离，并在数千个相机帧上收集。单分子定位技术使用特定的荧光分子探针标记样品，通过改变分子所处的外部环境有效控制其光开关特性，将空间上重叠的多分子荧光图像在时间上分离为一系列子图像，使得每一帧子图像中只有少量稀疏分布的单分子发射荧光，即每个衍射极限范围内只有一个荧光分子被激发。采集成千上万帧荧光信号随机分布的图像，利用单分子定位算法精确定位每个分子的中心位置。最后，将所有获得的定位点进行叠加，重建出一幅突破衍射极限的超分辨图像。5.1.提供单颗粒信息的基本方法5.1.3.超分辨显微镜图5-35单分子定位原理示意图近年来，各种新的超分辨荧光显微成像方法不断涌现，包括最低光子数显微成像、波动超分辨显微成像、基于单分子反聚束效应的超分辨成像、干涉交叉偏振显微成像、基于深度学习的超分辨显微成像技术等等，使得单颗粒的光学表征分辨率不断提高。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.1.量子点量子点是具有离散的、类似原子的能级和窄跃迁光谱的人造原子。单量子点在光激发下，其光致发光强度会随时间发生高低起伏或间歇性的中断，该现象被称为量子点的光致发光闪烁。光致发光闪烁是单量子点等单粒子特有的现象。由于量子点的光致发光主要来源于单激子的辐射复合，因此，光致发光闪烁主要源于单激子辐射强度的变化。通过对比单量子点光致发光强度和寿命随时间的变化关系可以有效地揭示量子点的光致发光闪烁的起源。在聚集状态下，不同大小和形状的量子点团簇会引起不均匀的光谱偏移和变形，因此普通光谱测试技术无法表征单量子点的荧光性质。利用远场显微镜，SPS已被用于解码量子点激发态的离散性质，单个CdSe量子点的荧光间歇性（闪烁）被揭示。如图5-36所示，在连续激发下，荧光强度在开启和关闭状态之间跳跃。激光光功率变化，其闪烁特性也会发生变化。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.1.量子点图5-36不同激光功率下量子点（表面覆盖有ZnS超薄壳层的CdSe量子点）闪烁特性5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石含有色中心（如氮空位中心，NV–）的荧光纳米金刚石已被用作单光子源。颗粒尺寸越小，表面缺陷可能就越多，发光中心就越少，并且发射强度就越不均匀，因此，纳米金刚石的性质取决于他们的形状和大小，SPS是验证单量子发射体荧光的标准技术，为纳米金刚石荧光性质研究提供了权威见解。比如，人们发现一种离散的5nm纳米金刚石在几个小时的照射下会闪烁和漂白；1.6nm纳米金刚石中的硅空位在化学上是稳定的，但具有荧光闪烁特性，且光学性质不稳定，荧光只持续几十分钟。干涉交叉偏振显微镜（interferometriccross-polarizationmicroscopy，ICPM）是一种干涉性的点扫描、类共聚焦检测方法，具有与常规共聚焦显微镜相当的光学切片能力。由于工作在交叉偏振状态下，该技术的检测灵敏度仅受限于散射信号的散粒噪声，可在极低激发功率（<1μW）下检测到5nm以下的金纳米粒子。采用ICPM技术，可以进行单个纳米金刚石的成像，同时检测来自色中心的荧光信号。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石图5-37是干涉交叉偏振显微镜原理图。相干激光源入射到50:50分束器上，产生信号和参考分支。为了实现外差检波，参考分支在通过半波片和偏振器（GTP）定向产生y偏振光之前，由一对声光调制器进行频率补偿。信号分支由第二个GTP产生x偏振光，并通过油浸式高数值孔径照明物镜聚焦到盖玻片上。聚焦光由收集物镜重新准直，并通过第二个分束器与参考分支重叠，然后聚焦在光电二极管上。光学切片由两个分支之间的平面波干涉定义，只有从焦点区域成像的光才会在重组分束器上干涉。荧光信号通过照明物镜从样品中收集，并通过二色分束器在雪崩光电二极管（APD）上检测，其暗计数率小于100次/秒。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石根据强电磁聚焦理论，通过高数值孔径物镜聚焦的线偏振光束沿三个轴都投射出线偏振态，在焦平面的空间和强度分布如图5-37b、d所示。如果不受干扰，焦点处的偏振分布将通过收集物镜重新转换为线偏振，由于正交偏振光束之间不会发生干涉，因此光电二极管上不会检测到干涉信号。如果焦点处存在具有电偶极矩的物体，光将从所有三个偏振方向散射到远场，强度与它们在焦点处的强度及偶极子方向有关。只有向前散射的y偏振光通过同偏振参考分支进行干涉增强，产生了扫描纳米粒子时观察到的标志性四叶草散射分布。这种散射分布强烈地反映了焦点处相应的偏振分量（见图5-37c）。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石图5-37干涉交叉偏振显微镜原理图5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石在ICPM上使用532nm的激光对约10nm的纳米金刚石成像，同时通过一个640nm长通滤波器在APD上收集荧光。如图5-38a所示为散射光强度随位置变化的典型图像。观察到的峰强度变化与AFM下观察到的粒径范围一致，清楚地识别到了图5-37c中由场分布产生的与交叉偏振成像相关的四叶草散射分布特征。散射图像观察到与AFM测试相似的纳米颗粒间距离，表明确实能检测到10nm的纳米金刚石。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石当入射光偏振方向沿y轴时，图5-38b显示了与图5-38a的散射图像同时拍摄的荧光图像，可以看到荧光通道里沿着偏振方向拉长的衍射极限斑点。当NV-中心偶极子沿着偏振方向时，其具有最佳的光吸收。为了探测NV-中心的偶极性质，将入射和参考偏振旋转90度拍摄第二张图像（图5-38c,d）。图5-38b和d中的虚线框(i,ii)突出了两种纳米金刚石的荧光特征，它们在y方向偏振光照射下的荧光峰值分别为122cts/px和168cts/px，在x方向偏振光照射下为189cts/px和131cts/px，表明光子发射过程中粒子之间存在择优的极化排列。这样，就可以在单分子水平上通过散射信号和荧光信号的共定位检测来观察单个纳米金刚石的偶极行为。正交偏振照明的伪彩色图像（图5-38e,f）显示了一些荧光聚集点，5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.2.荧光纳米金刚石像是来自于单一发光颗粒，但是没有对应的散射图样。当在没有溶液的情况下按照相同的方法成像时，没有观察到这种荧光背景，表明该信号来自用于分散纳米金刚石的溶液。这个结果强调了同时检测粒子的散射和荧光特征的必要性。图5-38以y向偏振的532nm光源得到的10±2nm金刚石纳米粒子的(a)散射强度图像和(b)荧光信号。以x偏振光源得到的(c)散射强度图像和(d)荧光信号。散射和荧光数据被分配到叠加图像的绿色和红色通道，以显示在(e)y偏振和(f)x偏振光照射下的共定位情况。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.3.上转换荧光纳米颗粒上转换荧光纳米颗粒（UCNPs）通常由镧系元素离子（共）掺杂，是一种新兴的非线性光学材料，它吸收低能量的近红外光子，在可见光和紫外区域产生高能发射。UCNPs的单颗粒性质通常通过AFM/TEM/SEM图像和共焦/宽场荧光图像之间的相关性来证实。由于其非线性性质，UCNP在用普通荧光谱和SPS测量中的表现非常不同。对堆积颗粒的普通荧光光谱测试表明，在β-NaYF4基体中，受到浓度猝灭效应的限制，Tm3+和Er3+的最佳掺杂浓度应分别小于1mol%和2mol%。然而，SPS测试表明，浓度猝灭是高度依赖于激发光的功率的。当激发功率密度达到104Wcm−2或更高时，高浓度掺杂（8mol%Tm3+或20mol%Er3+）的单个UCNP比传统的低浓度掺杂的UCNP亮几个数量级。因此，上转换荧光纳米颗粒的单光谱测量至关重要。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.3.上转换荧光纳米颗粒常见的单颗粒上转换成像与测试平台示意图如图5-39所示，以搭载有纳米步进压电位移台的激光扫描共聚焦显微系统为平台，激发源为与UCNPs吸收相对应的激光器，探测器为单光子计数器。测量时，首先以薄涂的UCNPs颗粒聚集体对焦，再以单颗粒标准卡片校准光路，最后对测试样品进行微区扫描得到单颗粒分散样图。定位单颗粒后即可利用单光子计数器、光谱仪、时间相关单光子计数器等对上转换稳定性、激发光功率密度依赖特性曲线、光谱线型以及特定能级的荧光寿命等进行测量。以氮化硅支持膜为衬底的单颗粒样品，通过分散图样5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.3.上转换荧光纳米颗粒图5-39单颗粒上转换成像与测试平台示意图定位可实现与透射电子显微镜的结合。通过光学与电镜相结合的方式，既能够研究单个粒子结构与发光特性的内在关系，也能够对不同粒子之间的特异性进行全面分析。近红外激发光通过物镜聚焦在直径数百纳米的小体积上。如果纳米颗粒是稀疏分布的，这就为单个纳米颗粒的唯一激发提供了机会。当纳米粒子被近红外光照射时，透射的上转换可见发光通过物镜传播回去，而反射的近红外激发光被二色镜拦截。在探测器前放置一个共聚焦针孔，以确保只检测到聚焦的信号。STED超分辨显微镜于2014年获得了诺贝尔奖，近年来成为表征上转换荧光纳米颗粒和生物分子光谱的有力工具。然而，传统STED显微镜存在原理性局限和问题：受激辐射作用如果要在与自发辐射（寿命有机染料通常为纳秒级）竞争中占主导，5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.3.上转换荧光纳米颗粒通常需要高功率的超短脉冲（飞秒/皮秒）激光作为损耗激光，这往往会导致严重的光漂白、光毒性和重激发背景等问题。此外，多色STED超分辨技术和系统复杂度高、成本高、维护难。为解决STED面临的上述难题，科学家基于上转换荧光技术提出通过抑制敏化离子和发光离子间的能量传递过程切断对发光离子的能量补给，使得发光离子被“釜底抽薪”，即受激辐射诱导激发损耗（Stimulated-emissioninducedexcitationdepletion,STExD）。结合上转换发光的多光子非线性泵浦依赖特性（非线性效应随泵浦的光子数增多而不断增强），实现了光子数越高的荧光能级电子损耗越强烈。STExD机理具有传统STED所不具有的对荧光损耗进行非线性放大的独特效应，逐级降低高能级荧光损耗所需要的饱和光强，5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.3.上转换荧光纳米颗粒突破了传统STED中饱和光强理论的限制。结合上转换发光一对多的敏化-发光特性，STExD可以实现一对激光对多种UCNPs探针的光开关控制。基于STExD机理，发展了一种基于单对低光强、近红外、连续波激光的多色超分辨显微成像技术，分别对钕，铒，钬掺杂的上转换荧光探针实现了不同颜色的超分辨成像。如图5-40是双通道检测的STExD超分辨率显微系统的示意图及对NaYF4:Nd纳米粒子的超分辨成像及谱线分析，原始图像分辨率达34nm，并进一步实现了钕、钬掺杂的上转换荧光双色超分辨成像。5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.3.上转换荧光纳米颗粒图5-40a双通道检测的STExD超分辨率显微系统的示意图；bNaYF4:Nd纳米粒子(16.7±0.9nm)的超分辨成像及谱线分析5.2.单颗粒光谱学表征实例5.2.4.碳点碳点是一种新型的碳基发光纳米粒子。碳点由碳晶体或无定形核以及各种发光和非发光表面基团组成，它们提供了独特或意想不到的光学特性的组合。此外，掺杂各种元素，如氮、硫和磷，可以调节荧光碳点的荧光发射光谱，使其更具有多样性。越来越多的研究致力于了解碳点的发光机制。SPS已经表明，尽管它们的大多数发光特性在很大程度上类似于有机分子的发光特性，但发光表面基团与碳核和非发光基团的相互作用可能决定了碳点的闪烁特性。与半导体量子点相比，碳点闪烁周期更稀疏，因为其存在丰富的表面状态，可以深捕获电子（或空穴）以转换为关闭状态。而且，这种自发的闪烁特性本质上与它们的结构，大小和激发条件相关。荧光碳点的尺寸小，毒性低，水溶性好，光稳定性好，难漂白。精确控制荧光碳点的闪烁次数，理想情况下闪烁一次，就可以成为定量超分辨成像显微镜如单分子定位显微镜、光激活定位显微镜和随机光学重构显微镜的首选荧光探针。5.3.单颗粒光谱学前景和挑战SP