DB15∕T 2555-2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法

ICS65.020.30

CCSB40

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2555—2022

原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技

术规程-乳汁分离法

Technicalregulationoftheisolation,primarycultureand

identificationofBovineMammaryEpithelialCellsderivedfromfresh

milk

2022-04-25发布2022-05-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2555—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。

本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、

康长清。

I

DB15/T2555—2022

原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法

1范围

本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、

操作步骤等技术要求与规范。

本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

原代奶牛乳腺上皮细胞primarybovinemammaryepithelialcells

从奶牛乳汁或乳腺中分离、培养并鉴定出来的上皮细胞。

免疫荧光技术immunofluorescencetechnique

又称荧光抗体技术，是以荧光物质标记抗体，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的检测

和定位。

染色体组型分析karyotypeanalysis

对不同生物的染色体组型（有丝分裂中期的染色体数目及其特征）进行定性和定量的分析和研究。

4材料

乳汁来源

泌乳前期（22d～100d）健康奶牛。

取样

用无菌水及75%酒精擦洗奶牛乳房，挤牛乳约500mL分装于灭菌的蓝盖瓶中，37℃保温瓶保温带

回实验室。

1

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5仪器和试剂耗材

仪器

生物安全柜，CO2培养箱，高压蒸汽灭菌锅（137℃，0.25MPa），普通光学显微镜，超低温冰箱

（-50℃～-86℃），PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低速冷冻离心机（2000g，-8℃～10℃），低

温高速台式离心机（20000g，-8℃～10℃），酶标仪，恒温水浴锅，倒置荧光显微镜（40x～640

x）。

试剂与耗材

5.2.1试剂

PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，细胞冻存液，0.4%台盼蓝，MTT(0.5mg/mL)，二甲基亚砜(DMSO)，

总RNA提取试剂盒，DNA水解酶，反转录试剂盒，PCR试剂盒，Taq酶，琼脂糖，4%多聚甲醛，山羊血清

（10%），兔抗人角蛋白8多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔IgG，DAPI（10μg/mL），秋水仙素（5

μg/mL），0.2%TritonX－100，10%Giemsa染色液等。

5.2.2配制溶液组分

完全培养液：10%FBS+DMEM/F12+100U青链霉素双抗+氢化考的松（1μg/mL）+孕酮（1μg/mL）

+转铁蛋白（5μg/mL）+胰岛素（5μg/mL）+谷氨酰胺（200mmol/L）+EGF（10ng/mL）。

核型分析固定液：甲醇：冰醋酸为3:1。

5.2.3耗材

T25细胞培养瓶，96孔细胞培养板，90mm培养皿，0.22μM滤膜，15mL/50mL离心管，2mL细胞

冻存管，无酶PCR管，移液器，血球计数板等。

6操作步骤

分离培养

6.1.1分离

6.1.1.1在生物安全柜中，将200mL乳汁与含青链霉素双抗（100U/mL）的PBS按体积比2：1混合

后，分装于15mL无菌离心管中，500g离心20min，自上而下吸弃上层乳脂层及相邻乳白色浑浊层

的一半。

6.1.1.2向剩余液体中加入等量含青链霉素双抗（100U/mL）的PBS，再次500g离心15min，自上

而下缓缓吸弃大部分上清层，重复上述步骤，直至剩余1mL左右。

6.1.1.3将所有剩余液体收集于一个15mL无菌离心管中，等量PBS重悬，500g再次离心5min，

自上而下缓缓吸弃大部分上清层，重复上述步骤，直至剩余1mL左右，即为乳汁中分离到的细胞层。

6.1.2培养

向细胞层中加入5mL完全培养液，接种于T25细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每

隔48h换液。待细胞形成单克隆后，原瓶胰酶消化，长至80%汇集时，传代培养。

传代培养

2

DB15/T2555—2022

待细胞长至80%汇集时，吸弃培养液，用PBS清洗细胞两次；T25培养瓶加1mL胰酶消化液，37℃

消化10min，普通光学倒置显微镜下观察到细胞变圆脱落后，加入至少200μL胎牛血清终止消化，反

复吹打细胞，使细胞完全脱落，300g离心5min，弃上清，将收集的细胞按1:3的比例接种于新培养皿

中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔48h换液，待长至80%汇集时，继续传代培养或将细胞冻存

备用。

冻存和复苏

6.3.1冻存

上述方法消化细胞，用血清终止反应，用血球计数板计数后，300g离心5min，弃上清，根据细胞

数量计算冻存支数，沿管壁缓缓加入冻存液使细胞密度为2×106/mL，用吸管轻轻吹打，令细胞处于重

悬状态。分装入无菌冻存管中，每瓶1mL细胞悬液。标记冻存日期、细胞名称、培养代数等信息，放入

程序降温盒中，快速置于-80℃超低温冰箱中冻存，24h后转入液氮罐中保存。

6.3.2复苏

将冻存管从液氮罐中小心取出，迅速浸没在40℃温水的恒温水浴锅中解冻，解冻时间尽量控制在

1min左右。用培养液重悬离心以清洗冻存液，保护细胞。用移液枪吸出细胞悬液，缓慢移入加有完全

培养液的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待长至80%汇集时，可继续传代培养或冻存。

细胞生长曲线测定

采用MTT法，参考文献1。

角蛋白8、18和β-酪蛋白测定

6.5.1引物设计

根据NCBI上公布的牛基因序列设计引物，引物序列符合附录A。

6.5.2RT-PCR

复苏培养，生长到80%汇集时，用胰酶消化并收集细胞，用总RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA。为排

除基因组DNA的污染，用DNA酶消化处理后，用反转录试剂盒反转录，用PCR反应试剂盒进行扩增反应并

电泳检测扩增产物。PCR扩增反应条件均为95℃，5min；95℃，30s；62℃，30s；72℃，30s；

72℃，10min；30个循环。扩增体系符合附录B。

细胞免疫荧光染色法鉴定角蛋白8

6.6.1固定

细胞复苏培养，生长到80%汇集时，吸弃培养液并用PBS清洗细胞2～3次，常温下多聚甲醛固定30

min，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min。

6.6.2封闭

TritonX－100处理5min，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min；山羊血清封闭30min。

6.6.3抗体处理

3

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加一抗（兔抗人的细胞角蛋白8多克隆抗体100倍稀释，空白对照试验用PBS代替）于37℃下振荡孵

育1h或4℃过夜孵育，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min；加入二抗（50倍稀释的FITC标记的山

羊抗兔的IgG）并于室温下避光振荡孵育30min，用PBS清洗细胞3次，每次5min～10min。

6.6.4鉴定

加入DAPI染色液于室温避光孵育10min，荧光显微镜下观察结果。正常奶牛乳腺上皮细胞会呈强阳

性，发出绿色荧光，核为蓝色荧光；空白对照组的细胞检测呈阴性。参照图见附录C。

染色体中期分裂相制备与组型分析

6.7.1细胞复苏培养与消化

复苏步骤同6.3.2，生长到80%汇集时，向培养液中加入秋水仙素使其终浓度为0.1μg/mL，在

37℃、5%CO2培养箱中继续培养3h～4h；消化步骤同6.2。

6.7.2分裂相制备

缓缓加入5mL低渗KCl（0.075M，37℃预热），并轻吹细胞使其悬浮，37℃孵育30min，加入

1mL新鲜配制的核型分析固定液预固定3min，300g离心5min，弃上清，加入新鲜配制的核型分析固

定液6mL，并轻吹细胞使其悬浮，室温孵育30min，重复固定细胞2次并离心后，小心吸除大部分上清

液，余下0.5mL固定液，轻吹细胞使其悬浮。

6.7.3制片染色

用滴管吸取少量细胞悬液，从1m高处滴落在洁净载玻片上（-20℃预冷），迅速于酒精灯上过火

烤干，将制作的标本浸入Giemsa染色液浸染10min，流水冲洗至水流无色并自然风干。

6.7.4观察照相

染色体标本首先用低倍镜检查，当寻找到分散良好、轮廓清晰的分裂相后，换用高倍镜和油镜观察

拍照。

6.7.5组型分析

拍照后进行染色体组型的排列分析。染色体数目应为60，2n=60；核型为60，XX。其中29对常染色

体为端着丝粒染色体，一对性染色体是近端着丝粒染色体。参照图见附录C。

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A

A

附录A

（规范性）

PCR扩增反应引物

牛基因序列设计引物见表A.1。

表A.1PCR扩增反应引物

GeneBank序列号基因引物序列(5’-3’)产物长度

F:TGGAAGGGCTGACTGATGAG

NM_001033610.1角蛋白8540bp

R:GCTTCCTGTAGGTGGCAATC

F:CAGGGCGAGAAGGAGACCAT

NM_001192095.1角蛋白18504bp

R:TAAGGTCCTGAGGTTTGGGG

F:ATCCCTAACAGCCTCCCAC

NM_181008.2β-酪蛋白303bp

R:AGAAAGGGACAGCACGGAC

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B

B

附录B

（规范性）

PCR扩增反应体系

PCR扩增反应体系见表B.1。

表B.1PCR扩增反应体系

无酶水7.2μL

上游引物（10μmol/L）0.4μL

下游引物（10μmol/L）0.4μL

SYBRPremixExTaqＴＭⅡ(2×)10μL

cDNA模板2μL

总计20μL

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C

C

附录C

（资料性）

奶牛乳腺上皮细胞CK-8鉴定及染色体组型分析参照图

A、B：正常奶牛乳腺上皮细胞，其中A是荧光显微镜拍摄，细胞发出绿色荧光，B是普