十九　基因工程及其应用(挑战组)-2025版世纪金榜二轮生物收官专项辅导与训练

十九基因工程及其应用(挑战组)(30分钟29分)一、单项选择题:共2题,每小题2分,共4分。每题只有一个选项最符合题意。1.(2024·河北二模)现如今,随着技术的不断发展,人们发明了多种PCR技术的衍生版本,如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述正确的是()A.已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来,因此可用于较长DNA分子的人工合成B.已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异,因此可用于病毒的检测与分析C.已知热不对称性PCR可通过调节退火温度产生多种产物,因此操作时对温度的要求低于常规PCRD.已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号,因此可用于亲子鉴定【解析】选A。重叠延伸PCR可将多个短DNA片段连接成一个长DNA分子,可以帮助将人工合成的短DNA片段合成目标长DNA分子,A正确;等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异,可用于亲子鉴定以及遗传病的筛查,无法检测是否存在某种病毒,B错误;热不对称性PCR需对温度进行精细控制,对温度的要求高于常规PCR,C错误;荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号,可用于某些病毒的检测,无法判断两份DNA间的细微差别,因此无法用于亲子鉴定,D错误。【加固训练】为了提高玉米的抗虫能力,研究员将H与S两种抗虫基因构建成融合基因,共同导入植物体内。图1为构建表达载体所用质粒,图2是H-S融合基因两侧序列,图3为部分限制酶的识别序列。下列叙述正确的是()A.卡那霉素抗性基因可以用来筛选导入目的基因的植物细胞B.目的基因和质粒应该同时用酶B与酶C来切割,确保不会发生反向连接和自身环化C.该玉米同时转入两种抗性基因可延缓害虫抗性基因频率增加D.重组质粒中仍有酶A的切割位点【解析】选C。卡那霉素抗性基因位于T-DNA之外的区域,只能与重组质粒一起导入农杆菌细胞,用于筛选导入目的基因的农杆菌细胞,只有T-DNA上的潮霉素抗性基因才能用于筛选导入目的基因的植物细胞,A错误;质粒应用酶A和酶B切割,目的基因用酶B和酶C切割,将目的基因插入T-DNA中间,B错误;相比于导入一种抗性基因,同时导入两种抗性基因可以减缓害虫对抗性基因的选择,从而延缓抗性基因频率增加,C正确;酶A与酶C的识别序列相比,酶C的识别序列特异性更低,酶A与酶C切割后产生的黏性末端互补后形成的连接位点只能被酶C识别,而不能被酶A识别,D错误。2.科学家从某植物中提取乙烯受体基因(Ers1),通过基因工程技术将Ers1基因反向连接到质粒中,筛选出转入反义Ers1基因的该种植物,其果实的储藏期将延长,过程如图所示。下列相关叙述错误的是()A.PCR扩增时,需在Ers1基因左右两端分别添加XhoⅠ、HpaⅠ酶切序列B.筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素,过程④包括脱分化和再分化C.转基因植物中反义Ers1基因和Ers1基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补D.若目的基因成功转入植物细胞中,则可检测到Kanr和hyg的表达产物【解析】选D。依题意,Ers1基因的转录方向由左向右,据图可知,质粒中限制酶HpaⅠ靠近启动子,限制酶XhoⅠ靠近终止子,若要将Ers1基因反向连接到质粒中,则需在Ers1基因左右两端分别添加XhoⅠ、HpaⅠ酶切序列,A正确。基因表达载体中含有潮霉素抗性基因,筛选农杆菌的培养基中可加入潮霉素,受体细胞经脱分化和再分化后形成转基因植株,因此过程④包括脱分化和再分化,B正确。反义Ers1基因转录的模板链和Ers1基因转录的模板链互补,因此,反义Ers1基因和Ers1基因分别转录出的mRNA碱基序列能互补,C正确。农杆菌侵染植物细胞后,其中的T-DNA转移至植物的染色体上,依题意,LB、RB分别为T-DNA的左右边界,标记基因Kanr不在T-DNA上,hyg在T-DNA上,因此,若目的基因成功转入植物细胞中,且相关基因都能正常表达,也只能检测到hyg的表达产物,D错误。二、多项选择题:共1题,共3分。每题有不止一个选项符合题意。每题全选对者得3分,选对但不全的得1分,选错或不答的得0分。3.(2024·扬州模拟)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了下图所示的表达载体,以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是()A.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒B.表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用T-DNA的同一条DNA单链为模板C.可用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞,在培养基中添加壮观霉素进行筛选D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用【解析】选A、B、C。如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒,会破坏LUC基因,A错误;表达载体中GUS基因和LUC基因转录时双向启动子的转录方向不同,使用T-DNA的模板链也不同,B错误;将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,但壮观霉素抗性基因位于T-DNA序列之外,可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞,C错误;双向启动子如果正常表达,就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶,催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质,从而确定双向启动子的作用,D正确。三、非选择题:共2题,共22分。4.(12分)(2024·石家庄二模)研究表明羊乳中的β-乳球蛋白(BLG)是人体主要过敏原,图1为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因,同时导入人乳铁蛋白(hLF)基因并获得转基因山羊的操作过程。图1中sgBLG/Cas9复合物中,sgBLG为能准确识别图1中母羊甲DNA特定序列的RNA,并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。回答下列问题:(1)上述操作过程中的目的基因是_________________。Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的____________酶。

(2)图中③应用到的技术为____________。

(3)为获取更多母羊丙的卵母细胞,需对丙注射____________,并将获取的细胞培养至___________________期后去核,去核的目的是________________________。早期胚胎移植之前,需对母羊丁进行___________处理。

(4)研究人员利用人乳铁蛋白基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA,已知mRNA的序列为5'-UUACUUCCUG…(中间序列)…CAAGUUUCAU-3'。在目的基因两端加上相应的限制酶识别序列后利用PCR技术扩增,目的基因和图2中的质粒连接构建表达载体。请分别写出PCR扩增时所需两种DNA引物按5'到3'方向的前12个碱基序列:_____________。

(5)筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白,______(填“能”或“不能”)作为判断目的基因是否成功导入并表达的依据,理由是_________________________________________________。

【解析】(1)利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因,同时导入人乳铁蛋白(hLF)基因并获得转基因山羊,说明目的基因是人乳铁蛋白基因。题干中“引导Cas9蛋白对DNA进行切割”,说明Cas9蛋白可以切割DNA分子,所以与限制性内切核酸酶(限制酶)作用类似。(2)图中③对母羊丙的卵母细胞进行去核操作,应用到的技术为显微操作去核。(3)通过超数排卵处理,可以获得较多的卵母细胞,该过程需对丙注射促性腺激素,并将获取的细胞培养至减数第二次分裂中期后去核,去核的目的是确保重构胚的核(遗传物质)来自母羊乙。图中母羊丁是受体,早期胚胎移植之前,需对母羊丁进行同期发情处理,使其生理状态与供体母羊丙相同。(4)由题干信息可知,mRNA的序列为5'-UUACUUCCUG…(中间序列)…CAAGUUUCAU-3',通过逆转录得到的cDNA双链(目的基因),其模板链序列为3'-AATGAAGGAC…(中间序列)…GTTCAAAGTA-5',对应的编码链序列为5'-TTACTTCCTG…(中间序列)…CAAGTTTCAT-3';设计引物进行PCR扩增,引物需要从5'到3',且已知双链cDNA的两端序列,设计的引物从cDNA的两端向中间方向扩增,则引物1序列为5'-TTACTTCCTG-3',引物2序列为5'-ATGAAACTTG-3';根据图2载体中乳腺蛋白基因的启动子和终止子的位置及限制酶识别序列位点可知,cDNA(目的基因)需要插入EcoRⅠ和PstⅠ所在的位置,由于EcoRⅠ位于乳腺蛋白基因的启动子一侧,又依据cDNA的模板链序列,可知扩增的目的基因引物1所在的一端应该靠近乳腺蛋白基因的启动子,引物2所在的一端应该靠近终止子;cDNA(目的基因)没有EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列,故设计引物时需要在引物的5'端添加相应的识别序列,根据上述分析,引物1的5'端增添EcoRⅠ识别序列,而引物2的5'端增添PstⅠ识别序列,即引物1添加限制酶后序列为5'-GAATTCTTACTT-3'(下图左侧的引物),引物2添加限制酶后序列为5'-CTGCAGATGAAA-3'(下图右侧的引物)。如图所示:(5)由于人乳铁蛋白(目的)基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达,筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白,因此不能作为判断目的基因是否成功导入并表达的依据。答案:(1)人乳铁蛋白(hLF)基因限制(性内切核酸)(2)显微操作去核(3)促性腺激素MⅡ(或减数分裂Ⅱ中/减数第二次分裂中)确保重构胚的核(遗传物质)来自母羊乙同期发情(4)5'-GAATTCTTACTT-3'5'-CTGCAGATGAAA-3'(5)不能人乳铁蛋白(目的)基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达5.(10分)(2024·泰州模拟)虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTR-B)的作用下转化而来,具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物,生长快,易培养,能大量合成β-胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”(如图1)构建含BKT基因和CRTR-B基因的表达载体(如图2、图3),导入杜氏盐藻,以实现虾青素的工厂化生产,回答下列问题。(1)获取目的基因:雨生红球藻是天然虾青素的重要来源,提取雨生红球藻的总DNA为______,设计特异性引物扩增BKT基因和CRTR-B基因,此过程需要______________酶的催化。

(2)构建转化载体:①PCR获取抗除草剂基因过程中,为确保基因两端具有所需同源序列,需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因从重组质粒中切除,还需要在基因两侧加入限制酶识别序列,则扩增抗除草剂基因时,设计的引物序列(5'→3')为_____。

A.同源序列+抗除草剂基因部分序列+限制酶识别序列B.同源序列+限制酶识别序列+抗除草剂基因部分序列C.抗除草剂基因部分序列+限制酶识别序列+同源序列②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将BKT基因和CRTR-B基因插入质粒,形成的重组质粒对应部位如图2所示,推测此过程扩增BKT基因所用的引物为______;扩增CRTR-B基因所用的引物为_______。

③最终形成的重组质粒如图3所示,其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子,选用内源性启动子的目的是____________________。

(3)准备受体细胞:选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养,一段时间后,挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。两次培养的目的分别为____________、______________。

【解析】(1)因雨生红球藻是天然虾青素的重要来源,是目的基因的来源,故可提取雨生红球藻的总DNA为模板,设计特异性引物对其DNA中的BKT基因和CRTR-B基因进行PCR扩增,此过程需要TaqDNA聚合酶(耐高温DNA聚合酶)的催化。(2)①根据PCR扩增的原理,在PCR过程中,为确保基因两端具有所需同源序列,需在5'端添加对应的同源序列;根据题意,若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除,则所需引物(5'→3')的序列应为“同源序列+限制酶识别序列+抗除草剂基因部分序列”,A、C错误,B正确。②根据图2所示,要通过“无缝克隆技术”同时将BKT基因和CR