DB53-T 447.4-2022云岭牛 第4部分：胚胎移植

ICS65.020.3053CCSB4353云 南 省 地 方 标 准DB53/T447.4—2022DB53/T447.4-2012云岭牛第4部分：胚胎移植2022-05-202022-05-20发布2022-08-20实施云南省市场监督管理局  发布DB53/T447.4DB53/T447.4—2022前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件为DB53/T447—2022《云岭牛》的第4部分。DB53/T447已经发布了以下部分：——第1部分：品种；——第2部分：养殖场建设规范；34——第5部分：体外胚胎生产；——第6部分：饲养管理；——第7部分：饲草加工与调制技术；89——第10部分：档案管理；——第11部分：胴体生产、评定及分割技术。DB53/TBMY第4DB53/T447.4-2012BMY3.5（3）；（4.2）；（5.2.3）；f)（6.1.2.1、6.1.2.3）；（7.2.3）；（7.2.4.4）；8.1）；j)（8.2.1.1、8.2.1.28.2.1.3）；k)更改了“胚胎解冻”中部分表述，并将细管装枪及移植部分内容并入10.5.4（见9.2、10.5.4.1、10.5.4.2）。本文件由云南省草地动物科学研究院提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本文件起草单位：云南省草地动物科学研究院。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：——2012年首次发布；——本次为第一次修订。IDB53/T447.4DB53/T447.4—2022引 言DB53/T447-20222014年12户）DB53/T447-2022由十一个部分构成。12345IVMIVFIVC67（碱）化饲料、青干草饲料的加工调制技术要求。——第8部分：育肥技术。目的在于确立云岭牛优质牛肉生产和雪花牛肉生产技术要求。91011DB53/T447-2022IIIDB53/T447.4DB53/T447.4—2022DB53/T447.4DB53/T447.4—2022云岭牛第4部分：胚胎移植范围本文件适用于云岭牛的超数排卵及胚胎移植（MOET）的各个环节。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB4143牛冷冻精液DB53/T247.3肉牛养殖综合标准第3部分：繁殖技术DB53/T447.3云岭牛第3部分：人工授精术语和定义下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。3.1供体牛donor提供卵子和胚胎的优秀繁殖母牛。3.2受体牛recipient接受胚胎（移植）的母牛。3.3同期发情synchronousestrus使用外源激素来调控一群母牛的发情进程，使之在预定的时间内集中发情和排卵。3.4超数排卵（简称超排）superovulation在母牛发情周期的适当时间，使用外源性腺激素，诱导更多的卵泡正常发育，并多排卵。3.5胚胎冷冻保存embryocryopreservation按胚胎冷冻的原理和方法，对胚胎进行冷冻，并在液氮中长期保存。3.6胚胎移植embryotransfer将受精卵（胚胎）移植到受体母牛子宫角内。4胚胎移植的要求124供体牛的选择与饲养管理供体牛的选择10280kg～600kg。经产母牛产后60供体牛的饲养管理供体牛的超排及输精超排处理超排激素FSH（促卵泡素）、PG（前列腺素及其类似物）、CIDR®或CUE-MATETM（孕酮阴道栓）、GnRH（促性腺激素释放激素）、LH（促黄体生成素）等。超排方法FSH+PG法在发情周期的任一天对供体牛用一次PG法进行同期发情处理或选择自然发情的供体牛在发情周期的第10～114FSH的第3PG。CIDR®CUE-MATETMFSH+PG法以供体牛发情当日为0天置入CIDR®或10天～11天开始注射连续注射4天，第12天～13天（FSH注射第3天）注射PG，同时取出CIDR®或CUE-MATETM。FSHPG用量6.1.2.1和6.1.2.2中FSH和PG用量可采用下列任意一种组合：——日本产FSH24mg～36mg+美国产PG30mg～35mg或国产氯前列烯醇0.6mg～0.8mg；——加拿大产FSH320mg～380mg+美国产PG30mg～35mg或国产氯前列烯醇0.6mg～0.8mg；——国产FSH10mg～12mg+国产氯前列烯醇0.6mg～0.8mg。发情鉴定在注射PG24h后进行发情鉴定，发情鉴定方法按DB53/T247.3的规定执行。冻精质量检查2应符合GB4143的规定。输精注射PG48h12hDB53/T447.3GnRH50µg～100µgLH2000IU～3000IU。胚胎回收（冲胚）冲胚时间供体牛以超排发情后第一次输精当日为0天，在第（7±0.5）天，用非手术法回收胚胎。冲胚前的准备主要器材冲胚管及内芯、子宫颈扩张棒、子宫颈黏液吸除器、过滤式集卵（胚）杯、Y字型三通硅胶管，以及50mL注射器、20mL注射器、10mL注射器、5mL注射器、培养皿、量筒、毛剪、镊子等。药剂新洁尔灭、2%利多卡因、0.9%生理盐水、酒精、青霉素、链霉素等。冲胚液的配制基液：杜氏磷酸缓冲液（PBS），配方见附录A。也可用进口PBS粉配制。冲胚液：含1%FCS（胎犊血清）或CS（犊牛血清）加含抗生素的PBS液。也可直接用进口的冲胚液。冲胚准备按以下步骤进行冲胚准备：23mL～5mL将牛尾固定，清除直肠中的粪便；用子宫颈扩张棒扩张子宫颈口，再用黏液吸除器清除子宫颈黏液；20mL10mL～1515mL～18mL；Y冲胚按以下步骤冲胚：50mL15mL～30mL36～10250mL～300mL一侧子宫冲胚完毕后，用注射器筒接到冲胚管的注气口将气囊中的气体放出，抽出冲胚管；用同样的方法对另一侧子宫角冲胚；（20010020mL～50mL）PG（0.4mg～0.6mg）；10mL胚胎质量鉴定检胚在实验室（检胚室）20～2513～4图图1 检胚顺序20%犊牛血清（CS）PBSTCM-199（同一头供体牛的胚胎放入同一培养皿中），并做好标记。PBSTCM-1993～5胚胎的质量鉴定形态学方法观察在40～80发育期划分4供体牛超排发情后第（7±1）天的胚胎发育期划分为以下6个时期：——早期桑椹胚（EarlyMorula，EM），卵裂球隐约可见，内细胞团基本占满卵周间隙；——致密桑椹胚（CompactMorula，CM），卵裂球进一步分裂变小，看不清卵裂球的界线，内细胞团致密收缩，占卵周间隙的60%～70%；——早期囊胚（EarlyBlastocyst，EB），出现透亮的囊胚腔，开始分为发暗的内细胞团和明亮的滋养层，但两层界线尚不明晰，细胞团占卵周间隙的70%～80%；——囊胚（Blastocyst，BL），囊胚腔增大明显，内细胞团和滋养层细胞界线清晰，细胞充满卵周间隙；——扩张囊胚（ExpandedBlastocyst，Exp），囊胚腔充分扩张，体积增至原来的1.2～1.5倍，透明带变薄，约为原厚度的1/3；——孵化囊胚（HatchedBlastocyst，Hed或HB），囊胚腔扩张到一定程度，透明带破裂，胚胎细胞团脱出透明带。发育阶段供体牛排卵受精后不同时间的胚胎发育阶段见表1。表1 供体牛排卵受精后不同时间的胚胎发育阶段时间（天）0～11～22～33～44～55～66～77～88～10胚胎形态发育阶段1细胞2细胞4细胞8细胞16细胞早期桑葚胚致密胚早期囊胚囊胚扩张囊胚孵化囊胚胚胎质量等级胚胎质量划分为下列四个等级：——1——210%以下；——3级，即普通胚，发育阶段正常、突出的细胞或较明显不均匀，变性部分占10%～30%；——4级，即不良胚，细胞不均匀、变性细胞明显，变性部分占30%～50%；发育缓慢和未受精卵。胚胎使用1～31～238.2.2体外培养法将被鉴定的胚胎用TCM199＋F1CS或TC-199＋FCS＋β-ME（β-巯基乙醇）培养液，在5%C、95%空气、38.5℃、饱和湿度的培养箱中培养24h～48h，判断胚胎是否存活和活力。桑椹胚、早期囊胚5胚胎的冷冻保存及解冻胚胎的冷冻保存仪器、器材实体显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、液氮、细管、封口仪、吸胚管、0.22µm过滤器、培养皿、记号笔等。保存液与冷冻液含有20%犊牛血清(CS)的PBS液为保存液。用8%乙二醇（EG）＋0.1mol/L海藻糖（Tre.）＋m-PBS＋20%CS,用0.22µm滤器过滤灭菌分装为冷冻液。胚胎装管胚胎先在保存液微滴中清洗4次，然后在冷冻液微滴中清洗4次。将胚胎吸入0.25mL细管内，用封口机封口、分类、标记，在4℃的冰箱内放置平衡10min～15min后放入冷冻仪。胚胎冷冻保存胚胎冷冻仪温度降至-772min后进行人工植冰，继续保持至10min，以0.3/min的速率降温至-30-3010min后，直接放入盛有液氮的液氮罐中保存，并定期检查和加液氮。9.2胚胎解冻9.2胚胎解冻从液氮中取出装有胚胎的细管，空气浴6s后在32～3510s。10胚胎移植受体牛的选择供同期发情处理的受体牛必须是确认空怀的。受体牛的选择参见附录B。受体牛的饲养管理75A、D、E，补充微量元素，如硒等。保持受体牛饲养环境的相对稳定与卫生，避免应激。妊♘受体牛在饲喂全价日粮饲料基础上，补充盐、矿物质和维生素，加强舍外运动。受体牛的同期发情处理PGF2α法PGF2α法对受体牛在发情周期的任意一天（除发情当日）直肠检查，只对卵巢上有黄体的一次注射PGFα或类似物（Lutalyse®或氯前列烯醇），在注射PG后24h～96h观察发情。PGF2α法6在受体牛发情周期的任意一天（除发情当日外），不论卵巢上有无黄体，先注射PGF2α或类似物一次(Lutalyse®或氯前列烯醇)，间隔11天～14天再用等量注射一次，在第二次注射PG后24h～96h内观察发情。CIDR®（CUE-MATETM）＋PGF2α法在受体牛发情周期的任一天（除发情当日），无论卵巢上有无黄体，将CID®（CU-MAE）孕酮阴道栓置入阴道内，以置栓之日为0天，在第7天一次性肌注PGFα类似物（氯前列烯醇），第9天取出CID（CUEMAT810～12取栓后72h或第9～10EB+CIDR®（CUE-MATETM）＋PGF2α法在受体牛发情周期的任一天，将CIDR®（CUE-MATETM）置入阴道内，同时肌肉注射EB（EstradiolBenzoate，EB，苯甲酸雌二醇)。第8天撤栓,同时肌注氯前列烯醇；第9天再次注射EB，不观察发情，在第16天～17天检查黄体状况。GnRHPGF2α法对受体牛不作黄体检查，第1GnRH或类似物（Fertagy）或促排3（LHRH-A3），第7PGF（Lutlys，第9GnR16同供体牛发情鉴定。受体牛的胚胎移植器具、药剂同供体牛发情鉴定。受体牛的胚胎移植器具、药剂解冻杯、移植枪、移植枪塑料外套和保护膜、毛剪、2%利多卡因、酒精棉球、5mL一次性注射器、无菌纸、生理盐水棉球。移植时间（胚龄24表2 受体牛胚胎移植时间10.5.3黄体判定7受体与供体的发情时间相差（h）-240+24站立发情时间早移植移植移植晚移植移植不移植（AB级胚胎移植操作细管装枪鲜胚装管或冻胚按9.2进行解冻，用消毒纸擦干细管，再用半干的酒精棉球擦拭细管表面，剪开细管封口端(如用细管塞封口的则拔出即可)，细管棉塞端装入移植枪中，套上灭菌的保护外套和保护膜。胚胎移植2%min内完成移植。移植记录（左或右侧卵巢（A、B、C级）、供体牛号以及移植日期、移植者、备注（如出血、子宫内膜炎和其它）等。11受体牛的妊娠诊断与否。诊断方法按DB53/T447.3的规定执行。8受体牛胚胎移植后第25天～30天，用B超作早期妊♘诊断，第60天～80天用直肠检查，确定妊♘与否。诊断方法按DB53/T447.3的规定执行。8附录 A（规范性）杜氏磷酸缓冲液配方表杜氏磷酸缓冲液配方见表A.1。表A.1杜氏磷酸缓冲液配方表试剂名称量NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4（Na2HPO4∙12H2）1.15(2.16）gKH2PO40.20gCaCl2（CaCl2∙2H2O）0.10(0.132）gMgCl2（MgCl2∙6H2O）0.1(0.2133）g丙酮酸钠0.36g葡萄糖（葡萄糖∙H2O）1.00(1.10）g青霉素0.075g链霉素0.05g酚红0.005g超纯净水1L99附录 B（规范性受体牛选择见表B.1。表B.1受体牛选择牛品种受体选择标准云岭牛2～81～6300kg60周期正常，发情表现良好；泌乳性能好。奶牛1.5～80～5350