基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测新策略与应用探索

基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测新策略与应用探索一、引言1.1microRNA概述microRNA（miRNA）是一类长度约为21-23个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，广泛存在于动植物、病毒等真核生物中。1993年，科学家在线虫中首次发现了miRNA——lin-4，这一发现开启了miRNA研究的大门。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到miRNA在生物体内发挥着极为重要的作用。截至目前，根据miRBase的最新数据统计显示，已发现的人类miRNA前体有1982条，成熟miRNA有2694条。从结构特点来看，miRNA通常由基因组DNA转录产生初级转录本（pri-miRNA），其长度可达数千碱基对，具有复杂的二级结构。pri-miRNA在细胞核内被Ⅲ型核酸内切酶Drosha和辅助因子DGCR8蛋白识别，并在距离pri-miRNA茎环结构分界点约11个碱基处被剪切，形成长度约为70-100个核苷酸的前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA呈发夹状茎环结构。随后，pre-miRNA通过核孔转运到细胞质中，在多种蛋白和Ⅲ型核酸内切酶Dicer的作用下，被进一步切割形成miRNA双链。miRNA双链与包括Argonaute蛋白的蛋白质复合体结合，形成靶向mRNA的沉默复合体RISC（RNAinducedsilencingcomplex），又称为miRNP（microribonucleoprotein）。在这一过程中，miRNA双链中5′-端碱基配对稳定性较差的链被保留，形成成熟的miRNA，另一条链则会被迅速降解。miRNA在生物体内参与了众多重要的生物学过程。在细胞增殖过程中，miRNA可通过调控相关基因的表达来影响细胞周期的进程。研究发现，某些miRNA能够抑制细胞周期蛋白的表达，从而阻止细胞从G1期进入S期，进而抑制细胞增殖。在细胞凋亡方面，miRNA也发挥着关键作用。一些miRNA可以通过靶向凋亡相关基因，促进或抑制细胞凋亡。当细胞受到外界刺激时，特定的miRNA表达水平发生变化，通过调控相关基因的表达，启动或抑制细胞凋亡程序，维持细胞内环境的稳定。在细胞分化过程中，miRNA同样不可或缺。不同的miRNA在细胞分化的不同阶段发挥作用，它们通过调控一系列转录因子和信号通路，引导细胞向特定的方向分化。在胚胎发育过程中，特定的miRNA表达模式决定了细胞的分化命运，促使胚胎细胞逐渐分化形成各种组织和器官。miRNA与多种疾病的发生发展密切相关。在癌症领域，大量研究表明miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展、转移和预后密切相关。某些miRNA在肿瘤组织中表达上调，发挥癌基因的作用，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-21在多种癌症中高表达，它可以通过靶向抑制肿瘤抑制基因的表达，促进肿瘤细胞的生长和存活。相反，一些miRNA在肿瘤组织中表达下调，失去了对肿瘤细胞的抑制作用，从而导致肿瘤的发生发展。miR-34家族在多种肿瘤中表达降低，其靶基因包括一些与细胞增殖、凋亡和转移相关的基因，miR-34家族表达下调会导致这些靶基因的异常表达，进而促进肿瘤的发生发展。在心血管疾病方面，miRNA也参与了疾病的病理过程。例如，miR-126与血管内皮功能调节密切相关，其表达异常可能导致心血管疾病的发生。当miR-126表达降低时，会影响血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成，增加心血管疾病的发病风险。在神经系统疾病中，如阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病，也发现了miRNA的表达异常。这些异常表达的miRNA可能通过调控神经细胞的存活、凋亡、突触功能等，参与神经退行性疾病的发病机制。1.2microRNA检测的重要性microRNA检测在生命科学和医学领域具有至关重要的意义，尤其是在疾病的早期诊断、治疗监测和预后评估方面，发挥着不可替代的关键作用。在疾病早期诊断中，microRNA作为一类极具潜力的生物标志物，展现出独特的优势。许多疾病在早期阶段，机体尚未出现明显的临床症状，但体内的microRNA表达谱已发生特异性改变。以癌症为例，癌症的早期诊断对于提高患者的治愈率和生存率至关重要。研究发现，多种癌症在早期阶段都有特定的microRNA表达特征。在肺癌早期，miR-126、miR-21等的表达水平会出现显著变化。通过检测血液、痰液等样本中这些microRNA的表达，能够在癌症发生的早期阶段实现精准检测，为患者争取宝贵的治疗时间。据相关临床研究数据显示，基于microRNA检测的肺癌早期诊断方法，相较于传统的诊断方法，灵敏度提高了20%-30%，特异性也有显著提升。在乳腺癌早期诊断中，miR-155、miR-221等被证实具有重要的诊断价值。一项针对1000例乳腺癌患者和500例健康对照人群的研究表明，通过检测血液中这两种microRNA的表达水平，能够准确区分乳腺癌患者和健康人群，准确率达到85%以上。这些研究充分表明，microRNA检测为癌症等疾病的早期诊断提供了新的思路和方法，有助于实现疾病的早发现、早治疗。在治疗监测方面，microRNA检测能够实时反映患者对治疗的反应，为医生调整治疗方案提供重要依据。在肿瘤化疗过程中，患者对化疗药物的敏感性存在个体差异，部分患者可能会出现耐药现象，导致治疗效果不佳。研究发现，某些microRNA的表达水平与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关。miR-34a可以通过调控相关基因的表达，增加肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性。在临床治疗中，通过定期检测患者血液或肿瘤组织中miR-34a的表达水平，医生能够及时了解患者对顺铂的治疗反应。当发现miR-34a表达水平较低，提示患者可能对顺铂耐药时，医生可以及时调整治疗方案，更换化疗药物或采用联合治疗的方式，提高治疗效果。在靶向治疗中，microRNA检测同样具有重要意义。对于接受表皮生长因子受体（EGFR）靶向治疗的非小细胞肺癌患者，miR-129-5p的表达水平与治疗效果密切相关。通过检测miR-129-5p的表达，医生可以预测患者对靶向治疗的响应情况，为个性化治疗提供有力支持。在预后评估方面，microRNA检测能够帮助医生判断患者的疾病预后，为患者提供更合理的康复建议和随访计划。大量研究表明，不同的microRNA表达谱与疾病的预后密切相关。在结直肠癌中，高表达的miR-21与患者的不良预后相关，患者的复发率和死亡率较高。而低表达的miR-34a则提示患者的预后较好，复发风险较低。通过检测结直肠癌患者肿瘤组织中miR-21和miR-34a的表达水平，医生可以准确评估患者的预后情况，为患者制定个性化的康复计划和随访方案。对于预后较差的患者，医生可以加强随访频率，密切关注患者的病情变化，及时发现复发迹象并采取相应的治疗措施。对于预后较好的患者，可以适当减少随访次数，减轻患者的经济负担和心理压力。1.3传统microRNA检测方法及局限性由于miRNA具有片段短小、表达丰度低、家族成员序列相似度高等特点，对其进行准确检测存在一定的挑战。目前，传统的miRNA检测方法主要包括基于杂交的检测方法和基于扩增的检测方法，这些方法在miRNA检测中发挥了重要作用，但也存在一些局限性。1.3.1基于杂交的检测方法基于杂交的检测方法是利用核酸分子的碱基互补配对原则，将标记的探针与样本中的miRNA进行杂交，通过检测杂交信号来实现对miRNA的检测。这类方法中较为典型的是Northernblot和微阵列技术。Northernblot是一种经典的基于核酸杂交的RNA检测技术，也是最早用于miRNA检测的方法之一。其基本原理是：首先提取样本中的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳或脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳，依据RNA分子的大小对其进行分离。随后，将分离后的RNA转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，并使RNA固定在膜上。接着，用放射性同位素（如32P）、荧光素或地高辛等标记的含有miRNA互补序列的DNA探针与固定在膜上的miRNA进行杂交。杂交完成后，洗去未杂交的探针，通过放射自显影、荧光扫描或化学发光等方法检测杂交信号，从而实现对miRNA的定性和半定量分析。虽然Northernblot是检测miRNAs的标准方法，常用于评价其它miRNAs检测方法的可靠性，但它存在诸多缺点。操作步骤繁琐，涉及RNA提取、电泳分离、转膜、杂交、洗膜和信号检测等多个步骤，整个实验过程耗时较长，通常需要2-3天。检测灵敏度较低，其检测限一般为纳摩尔级别（nmol/L），对于低丰度表达的miRNA，难以准确检测。该方法为低通量检测，一次只能检测一种或少数几种miRNA，无法满足对大量miRNA同时检测的需求。实验过程中需要使用放射性探针，这不仅会带来健康和环境安全问题，还需要专门的防护设施和处理设备。此外，该方法对RNA样本的需求量较大，一般需要10-30μg的总RNA，对于一些来源有限的样本，可能无法满足检测要求。微阵列技术，也称为基因芯片技术，是一种高通量的核酸检测方法，可用于大规模检测miRNA的表达谱。其原理是将大量已知序列的寡核苷酸探针固定在固相载体（如玻璃片、硅片或尼龙膜）表面，形成微阵列。提取样本中的总RNA，经逆转录合成荧光团或生物素标记的cDNA。将标记后的cDNA与微阵列上的探针进行杂交，杂交完成后，通过荧光扫描或化学发光等方法检测杂交信号的强度。信号强度与样本中相应miRNA的表达水平呈正相关，从而实现对miRNA表达水平的定量分析。如果杂交的cDNA被生物素化，可利用链霉亲和素标记的荧光团进行标记；若cDNA直接被荧光团标记，则可直接测量每孔的荧光强度以确定miRNA的表达水平。微阵列技术能够在一次实验中同时检测数百个甚至数千个miRNA，具有高通量的优势，适用于大规模的miRNA表达谱分析，在疾病的诊断、分类和预后研究中具有重要应用价值。然而，该技术也存在一些局限性。成本较高，包括芯片的制备、检测仪器的购置以及实验试剂的消耗等，使得其应用受到一定限制。操作复杂，需要专业的技术人员和设备，实验过程中容易出现误差。特异性较差，由于miRNA序列较短，家族成员之间序列相似度高，容易出现非特异性杂交，导致检测结果的准确性受到影响。对低丰度表达的miRNA检测灵敏度较低，可能会遗漏一些重要的miRNA信息。1.3.2基于扩增的检测方法基于扩增的检测方法主要是通过对miRNA或其互补DNA进行扩增，增加目标分子的数量，从而实现对miRNA的高灵敏检测。这类方法中最常用的是RT-qPCR和二代测序技术。RT-qPCR，即逆转录定量聚合酶链式反应，是目前miRNA定量检测的金标准方法之一。由于成熟miRNA序列较短，无法像mRNA那样按常规方法设计引物进行逆转录和扩增，科研工作者对传统的qRT-PCR方法进行了改进，目前主要有加尾法和茎环法两种方法。加尾法是先在miRNA的3′端添加poly（A）尾，然后用3′端带有标签的poly（T）引物进行通用的逆转录，得到cDNA。以cDNA为模板，设计特异性引物和荧光探针，利用PCR技术对其进行扩增。在扩增过程中，荧光探针会与模板结合，随着PCR反应的进行，荧光信号逐渐增强，通过实时监测荧光信号的变化，实现对miRNA的定量检测。茎环法是利用茎环结构设计引物，以达到延长miRNA长度的目的。茎环引物是长度约为45bp且能够实现自身环化的序列，每一个miRNA都有自己独特的茎环引物，其结构为5′端的环化序列+3′端的miRNA的特定互补序列。在逆转录过程中，茎环引物与miRNA序列结合，起到延长miRNA的作用，后续的PCR扩增和检测过程与加尾法类似。RT-qPCR具有灵敏度高、特异性强、动态范围宽等优点，能够对低丰度表达的miRNA进行准确检测，并且可以实现对多个样本中多个miRNA的同时定量分析。该方法也存在一些缺点。对设备要求较高，需要配备荧光定量PCR仪等专业设备，设备价格昂贵，维护成本高，限制了其在一些基层实验室的应用。操作复杂，涉及RNA提取、逆转录、PCR扩增等多个步骤，每个步骤都需要严格控制实验条件，否则容易出现误差。实验过程中容易受到污染，导致假阳性结果的出现。此外，引物设计困难，尤其是对于一些序列相似的miRNA家族成员，需要设计高度特异性的引物，增加了实验的难度和成本。二代测序技术，也称为新一代测序技术，是一种高通量的核酸测序方法，可用于全面分析miRNA的表达谱和序列信息。其基本原理是将样本中的RNA逆转录成cDNA，然后对cDNA进行片段化处理，并在片段两端连接上特定的接头。将连接接头后的cDNA片段构建成文库，通过桥式PCR等技术进行扩增，最后利用测序仪对扩增后的文库进行高通量测序。通过对测序数据的分析，可以获得样本中miRNA的种类、表达水平以及序列变异等信息。二代测序技术具有高通量、高分辨率、能够发现新的miRNA等优点，可同时对样本中的所有miRNA进行无偏倚的检测和分析，为miRNA的研究提供了全面、深入的信息。然而，该技术也存在一些局限性。成本较高，包括文库构建、测序和数据分析等环节，需要耗费大量的资金和时间。数据分析复杂，产生的海量测序数据需要专业的生物信息学知识和软件进行分析和解读，对研究人员的技术要求较高。实验过程中需要使用大量的试剂和耗材，且对实验环境和操作要求严格，容易出现实验误差。此外，由于测序深度的限制，对于低丰度表达的miRNA，可能存在检测不准确或遗漏的情况。1.4电化学检测技术的优势电化学检测技术作为一种重要的分析检测手段，在众多领域展现出显著的优势，尤其在即时检测（POCT）中具有巨大的应用潜力，为疾病的快速诊断和监测提供了新的解决方案。电化学检测技术具有极高的灵敏度。它能够检测到极低浓度的目标物质，这是许多传统检测方法难以企及的。在检测重金属离子时，基于阳极溶出伏安法的电化学传感器可以检测到低至纳摩尔级别的重金属离子浓度。这种高灵敏度使得电化学检测技术在生物标志物检测中具有重要应用价值。在肿瘤标志物检测中，电化学免疫传感器能够灵敏地检测到血液中微量的肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等。研究表明，某些基于纳米材料修饰电极的电化学免疫传感器对CEA的检测限可低至皮克每毫升（pg/mL）级别，能够在肿瘤早期，当肿瘤标志物含量极低时就实现准确检测，为肿瘤的早期诊断提供有力支持。电化学检测技术的响应速度快也是其一大突出优势。相比于一些传统的检测方法，如色谱分析、质谱分析等，需要复杂的样品前处理和较长的检测时间，电化学检测能够在短时间内给出检测结果。在血糖检测中，电化学血糖仪通过检测血液中葡萄糖在电极表面的氧化还原反应产生的电流信号，能够在几秒钟内准确测量出血糖浓度，为糖尿病患者的日常血糖监测提供了极大的便利。在环境污染物检测中，电化学传感器可以实时快速地检测水中的有机污染物和重金属离子，及时反映环境质量状况，为环境监测和污染治理提供及时的数据支持。该技术设备具有便携性的特点。随着微纳加工技术和材料科学的不断发展，电化学检测设备逐渐向小型化、集成化方向发展。现在已经出现了许多便携式的电化学检测仪器，如手持式电化学分析仪、可穿戴式电化学传感器等。这些设备体积小巧、重量轻，便于携带和操作，能够满足现场检测和即时检测的需求。在现场水质检测中，工作人员可以携带便携式电化学水质分析仪，随时随地对水中的酸碱度、溶解氧、重金属离子等参数进行检测，无需将样品带回实验室进行复杂的分析。在家庭健康监测领域，可穿戴式电化学传感器可以实时监测人体的生理参数，如心率、血压、血糖等，并将数据实时传输到手机或其他智能设备上，方便用户随时了解自己的健康状况。操作简便也是电化学检测技术的一大优势。其检测过程通常不需要复杂的样品前处理和专业的技术人员。对于一些简单的电化学检测项目，如常见离子浓度的检测，普通操作人员经过简单培训即可熟练掌握检测方法。在食品安全检测中，利用电化学传感器检测食品中的农药残留、兽药残留等有害物质，操作简单快捷，不需要昂贵的仪器设备和复杂的实验步骤，能够在短时间内对大量食品样本进行快速筛查，保障食品安全。在即时检测方面，电化学检测技术的优势得到了充分的体现。POCT要求检测设备能够在现场快速、准确地给出检测结果，为临床诊断和治疗提供及时的依据。电化学检测技术正好满足了这些要求。在急诊医学中，对于急性心肌梗死、脑卒中患者的快速诊断至关重要。利用电化学免疫传感器可以快速检测血液中的心肌标志物和神经标志物，如肌钙蛋白、脑钠肽等，在几分钟内就能够做出诊断，为患者的及时治疗争取宝贵的时间。在基层医疗单位和偏远地区，由于医疗资源相对匮乏，电化学检测技术的便携性和操作简便性使其成为一种理想的检测手段。基层医生可以使用便携式电化学检测设备对患者进行常见疾病的筛查和诊断，提高医疗服务的可及性。二、多重信号放大技术原理与分类2.1信号放大原理基础信号放大技术的核心在于通过特定的机制增加检测信号的强度，从而提高检测方法的灵敏度。在分析检测领域，检测信号的强度与目标物质的含量密切相关，但由于实际样品中目标物质的浓度往往较低，直接检测时信号微弱，难以准确测定。以电化学检测技术为例，其检测信号通常来源于电活性物质在电极表面发生氧化还原反应产生的电流、电位或电容变化。当目标物质为电活性物质时，其在电极表面的反应活性和浓度决定了检测信号的大小。在检测重金属离子时，重金属离子在电极表面发生氧化还原反应，产生相应的电流信号。然而，当样品中重金属离子浓度极低时，产生的电流信号非常微弱，容易受到噪声干扰，导致检测误差较大。为了提高检测灵敏度，需要增加电活性物质的浓度，从而增强检测信号。在传统的电化学检测中，通常采用增加目标物质浓度的方法来提高信号强度，但这种方法受到样品中目标物质含量的限制，对于低浓度样品效果不佳。而信号放大技术则通过引入额外的信号放大步骤，巧妙地解决了这一问题。在基于酶标记的电化学免疫传感器中，利用酶的催化作用，将大量的底物转化为电活性产物，从而显著增加了电活性物质的浓度，实现了检测信号的放大。在检测肿瘤标志物时，将酶标记在抗体上，当抗体与肿瘤标志物特异性结合后，加入酶的底物，酶催化底物发生反应，生成大量的电活性产物，这些电活性产物在电极表面发生氧化还原反应，产生强烈的电流信号，使得检测灵敏度大幅提高。二、多重信号放大技术原理与分类2.1信号放大原理基础信号放大技术的核心在于通过特定的机制增加检测信号的强度，从而提高检测方法的灵敏度。在分析检测领域，检测信号的强度与目标物质的含量密切相关，但由于实际样品中目标物质的浓度往往较低，直接检测时信号微弱，难以准确测定。以电化学检测技术为例，其检测信号通常来源于电活性物质在电极表面发生氧化还原反应产生的电流、电位或电容变化。当目标物质为电活性物质时，其在电极表面的反应活性和浓度决定了检测信号的大小。在检测重金属离子时，重金属离子在电极表面发生氧化还原反应，产生相应的电流信号。然而，当样品中重金属离子浓度极低时，产生的电流信号非常微弱，容易受到噪声干扰，导致检测误差较大。为了提高检测灵敏度，需要增加电活性物质的浓度，从而增强检测信号。在传统的电化学检测中，通常采用增加目标物质浓度的方法来提高信号强度，但这种方法受到样品中目标物质含量的限制，对于低浓度样品效果不佳。而信号放大技术则通过引入额外的信号放大步骤，巧妙地解决了这一问题。在基于酶标记的电化学免疫传感器中，利用酶的催化作用，将大量的底物转化为电活性产物，从而显著增加了电活性物质的浓度，实现了检测信号的放大。在检测肿瘤标志物时，将酶标记在抗体上，当抗体与肿瘤标志物特异性结合后，加入酶的底物，酶催化底物发生反应，生成大量的电活性产物，这些电活性产物在电极表面发生氧化还原反应，产生强烈的电流信号，使得检测灵敏度大幅提高。2.2常见多重信号放大技术2.2.1酶催化信号放大技术酶催化信号放大技术是基于酶的高效催化活性，通过酶促反应将底物转化为大量可检测的信号分子，从而实现检测信号的显著增强。在众多酶中，辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）是该技术中最为常用的两种酶。HRP广泛存在于植物界，是一种含血红素的糖蛋白，其相对分子质量约为40kDa。HRP催化的底物显色反应在生化分析中应用极为广泛，其中以3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）最为常见。以TMB作为底物时，在过氧化氢（H₂O₂）的存在下，HRP能够催化TMB发生氧化反应。TMB分子中的氨基被氧化，形成具有共轭结构的醌式产物，该产物呈现出明显的蓝色。在酸性条件下，蓝色产物进一步发生质子化反应，颜色转变为黄色，通过分光光度计在特定波长（如450nm）下检测吸光度，可对反应产物进行定量分析。研究表明，在最佳反应条件下，一个HRP分子在1分钟内能够催化数百个TMB分子发生反应，产生大量的显色产物，从而实现信号的有效放大。当HRP标记的抗体与抗原特异性结合后，加入TMB和H₂O₂底物溶液，反应体系迅速显色，通过检测吸光度的变化，能够灵敏地检测出低至皮克级别的抗原。ALP是一组特异的磷酸酯酶，其分子质量在80-120kDa之间，在碱性条件下具有高度的催化活性。对硝基苯磷酸酯（pNPP）是ALP常用的底物之一。在碱性环境中，ALP催化pNPP发生水解反应，断裂磷酸酯键，生成对硝基苯酚和磷酸。对硝基苯酚在碱性溶液中呈现出黄色，可在405nm波长处检测其吸光度。由于ALP的催化效率较高，每一个ALP分子在适宜条件下能够在短时间内催化大量的pNPP分子水解，使得反应体系中对硝基苯酚的浓度迅速增加，从而产生强烈的颜色变化信号。在免疫检测中，利用ALP标记的抗体与抗原结合，加入pNPP底物后，通过检测吸光度的变化，能够实现对目标抗原的高灵敏检测。酶催化信号放大技术具有灵敏度高、特异性强的显著优势。由于酶的催化作用具有高度的特异性，只有特定的底物能够在酶的作用下发生反应，因此可以有效减少非特异性信号的干扰，提高检测的准确性。在检测病毒抗原时，酶标记的抗体能够特异性地识别病毒抗原，避免与其他无关物质发生反应，从而保证检测结果的可靠性。该技术操作相对简便，不需要复杂的仪器设备和专业技术人员，在临床诊断、食品安全检测等领域得到了广泛的应用。在临床诊断中，基于酶催化信号放大技术的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法被广泛用于检测各种疾病标志物，如肿瘤标志物、病原体抗体等。在食品安全检测中，可用于检测食品中的农药残留、兽药残留等有害物质。然而，该技术也存在一些局限性。酶的活性容易受到温度、pH值、抑制剂等因素的影响，在实际应用中需要严格控制反应条件，以确保酶的活性和检测结果的稳定性。酶催化反应的底物种类相对有限，限制了该技术在某些特殊检测中的应用。2.2.2核酸扩增信号放大技术核酸扩增信号放大技术是通过对核酸分子进行扩增，增加目标核酸的拷贝数，从而实现核酸信号的显著放大，在生物检测和分子诊断领域发挥着至关重要的作用。常见的核酸扩增技术包括聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和滚环扩增（RCA）等。PCR技术由穆利斯（KaryMullis）于1983年发明，是一种模拟体内DNA复制过程的体外核酸扩增技术。其基本原理是在模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）和耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等存在的条件下，通过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤的循环，使目的DNA片段呈指数级扩增。在高温变性阶段，双链DNA模板在95℃左右的高温下解链成为两条单链；在低温退火阶段，引物与单链模板DNA的互补序列结合，形成引物-模板复合物；在适温延伸阶段，TaqDNA聚合酶以dNTPs为原料，在引物的引导下，按照碱基互补配对原则，从引物的3'-端开始合成新的DNA链。每完成一个循环，DNA分子数量增加一倍，经过30-40个循环后，DNA量可扩增数百万倍。PCR技术具有极高的灵敏度和特异性，能够检测出极低拷贝数的目标核酸。在临床诊断中，PCR技术被广泛用于检测病原体核酸，如新冠病毒核酸检测，通过对患者样本中的病毒核酸进行扩增，能够快速、准确地判断患者是否感染新冠病毒。在法医鉴定中，PCR技术可用于扩增犯罪现场残留的微量DNA，为案件侦破提供重要线索。LAMP技术是由日本学者Notomi等在2000年开发的一种新型等温核酸扩增技术。该技术利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶和针对靶基因的6条特异性引物，在恒温条件下（60-65℃）实现核酸的快速扩增。LAMP技术的引物设计独特，包括两对内部引物（FIP、BIP）和两对外部引物（F3、B3）。在反应过程中，FIP引物中的F1c序列与靶基因的互补序列结合，BstDNA聚合酶以其为引物开始合成DNA链，同时置换出下游的单链DNA。随后，B3引物与被置换出的单链DNA结合，启动新一轮的DNA合成，形成哑铃状结构的DNA模板。该模板可在自身引发下进行链置换扩增，形成大量具有茎-环结构的DNA产物。LAMP技术的扩增效率极高，在1小时内可使核酸扩增10⁹-10¹⁰倍。其反应结果可通过肉眼观察白色焦磷酸镁沉淀的生成或使用荧光染料进行检测。在病原体检测中，LAMP技术可快速检测出细菌、病毒等病原体的核酸，如对结核杆菌的检测，LAMP技术能够在短时间内得出结果，且操作简便，不需要复杂的仪器设备，适用于基层医疗机构和现场检测。RCA技术是一种借鉴自然界中环状DNA或RNA分子滚环复制过程发展而来的体外等温核酸扩增技术。RCA反应需要环状DNA模板、与模板部分互补的DNA/RNA引发链、具有链置换活性的DNA/RNA聚合酶（如Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶）和脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）等组分。在反应过程中，环状DNA模板在DNA连接酶的作用下环化，引发链与环状模板的特定区域结合，DNA聚合酶以环状模板为模板，从引发链的3'-端开始合成新的DNA链。在合成过程中，DNA聚合酶持续将dNTPs添加到新合成的DNA链上，同时置换出已合成的DNA链，形成具有重复串联序列的单链DNA分子。Phi29DNA聚合酶具有强大的5'-3'聚合活性和3'-5'外切酶活性，在30℃左右的最适温度下，能够在20分钟内产生大于70kbp的扩增子，扩增灵敏度可达到单分子拷贝水平。RCA技术在生物传感器领域应用广泛，可用于检测核酸、蛋白质等生物分子。在检测microRNA时，通过设计特异性的环状探针，利用RCA技术对与microRNA互补的序列进行扩增，能够实现对低丰度microRNA的高灵敏检测。2.2.3纳米材料辅助信号放大技术纳米材料辅助信号放大技术是利用纳米材料独特的物理和化学性质，如大比表面积、良好的导电性、荧光特性等，实现检测信号的有效放大，在生物分析和检测领域展现出巨大的应用潜力。金纳米颗粒（AuNPs）、碳纳米材料（如碳纳米管、石墨烯）等是该技术中常用的纳米材料。AuNPs是一种具有独特光学和电学性质的纳米材料，其粒径通常在1-100nm之间。AuNPs具有较大的比表面积，能够提供大量的表面活性位点，可高效地负载生物分子，如抗体、核酸等，从而显著增强检测信号。在免疫检测中，将AuNPs标记在抗体上，由于AuNPs的大比表面积，每个AuNPs可以连接多个抗体分子。当标记有AuNPs的抗体与抗原特异性结合后，在后续的检测过程中，AuNPs能够放大检测信号。利用银增强技术，在AuNPs表面沉积银原子，使AuNPs的尺寸增大，从而进一步增强其光学信号，提高检测灵敏度。AuNPs还具有良好的表面等离子体共振（SPR）特性，其表面等离子体共振波长会随着周围环境的变化而发生改变。当AuNPs与目标分子结合后，其周围的电子云密度发生变化，导致SPR波长发生位移，通过检测SPR波长的变化，可实现对目标分子的高灵敏检测。在检测肿瘤标志物时，基于AuNPs的SPR生物传感器能够快速、准确地检测出低浓度的肿瘤标志物，检测限可达到纳摩尔级别。碳纳米管是由碳原子组成的具有管状结构的纳米材料，根据其结构可分为单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）。碳纳米管具有优异的导电性和高的机械强度。在电化学生物传感器中，将碳纳米管修饰在电极表面，能够显著提高电极的电子传递速率，增强电信号的检测。碳纳米管修饰的电极可以促进电活性物质在电极表面的氧化还原反应，使检测信号增强。在检测神经递质时，基于碳纳米管修饰电极的电化学生物传感器能够灵敏地检测出多巴胺、肾上腺素等神经递质，检测灵敏度比传统电极提高数倍。此外，碳纳米管还具有良好的生物相容性，能够与生物分子（如酶、抗体等）进行有效的结合，为构建高性能的生物传感器提供了有利条件。石墨烯是一种由碳原子以sp²杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的二维碳纳米材料。石墨烯具有极高的载流子迁移率和良好的电学性能，其理论比表面积高达2630m²/g。在生物检测中，石墨烯可作为信号放大材料，提高检测灵敏度。将石墨烯与核酸适配体结合，构建基于石墨烯的荧光生物传感器。当目标分子与核酸适配体特异性结合后，会导致核酸适配体的构象发生变化，从而使石墨烯与核酸适配体之间的相互作用改变，荧光信号发生变化。由于石墨烯的荧光猝灭效应，在未结合目标分子时，荧光信号较弱；当结合目标分子后，荧光信号增强，通过检测荧光信号的变化，可实现对目标分子的检测。在检测蛋白质时，基于石墨烯的荧光生物传感器能够检测到低至皮摩尔级别的蛋白质，具有较高的灵敏度和选择性。2.2.4生物亲和作用信号放大技术生物亲和作用信号放大技术是基于生物分子之间特异性、高亲和力的结合特性，如抗原-抗体、生物素-链霉亲和素等，实现检测信号的放大，在生物检测和分析领域具有广泛的应用。抗原-抗体特异性结合是免疫检测的基础，其结合具有高度的特异性和亲和力。在免疫检测中，利用抗原-抗体的特异性结合，将抗体标记上可检测的信号分子（如荧光素、酶等），当抗体与抗原结合后，通过检测信号分子的信号强度，实现对抗原的检测。在酶联免疫吸附测定（ELISA）中，将抗原固定在固相载体表面，加入待检测的抗体，抗体与抗原特异性结合后，再加入酶标记的二抗。二抗与一抗结合，形成抗原-抗体-酶标二抗复合物。加入酶的底物后，酶催化底物发生反应，产生可检测的信号，如颜色变化或荧光信号。由于每个抗原分子可以结合多个抗体分子，每个抗体分子又可以结合多个酶标二抗分子，通过这种级联放大作用，大大增强了检测信号，提高了检测灵敏度。在检测肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）时，利用ELISA方法，能够检测到低至纳克每毫升（ng/mL）级别的AFP，为肿瘤的早期诊断提供了有力支持。生物素-链霉亲和素系统是一种具有极高亲和力的生物分子相互作用体系。生物素是一种水溶性维生素，又称维生素B7，能够与链霉亲和素特异性结合，其结合常数高达10¹⁴-10¹⁵M⁻¹，比抗原-抗体的结合力强100万倍。链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，每个链霉亲和素分子可以结合4个生物素分子。在生物检测中，将生物素标记在抗体、抗原或核酸等生物分子上，然后利用链霉亲和素与生物素的特异性结合，实现信号的放大。在免疫组化实验中，先将生物素标记的一抗与组织切片中的抗原结合，再加入链霉亲和素标记的荧光素或酶。链霉亲和素与生物素结合后，由于其多价结合特性，可同时结合多个生物素标记的一抗分子，从而使荧光素或酶的信号得到显著放大。通过荧光显微镜或显色反应，能够清晰地观察到抗原在组织中的分布和表达情况。在核酸检测中，利用生物素-链霉亲和素系统，可将生物素标记的核酸探针与目标核酸杂交，然后通过链霉亲和素与生物素的结合，引入可检测的信号分子，实现对目标核酸的高灵敏检测。三、基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法构建3.1电极材料的选择与修饰3.1.1常见电极材料在电化学检测中，电极材料的选择对检测性能起着关键作用。常见的电极材料包括玻碳电极、金电极、碳纳米管修饰电极等，它们各自具有独特的特性和优缺点。玻碳电极（GCE）是一种由玻璃碳制成的电极，具有优异的化学稳定性。在强酸、强碱等恶劣的化学环境中，玻碳电极不易被腐蚀，能够保持电极的结构和性能稳定。它还具有较宽的电位窗口，一般在酸性溶液中，其电位窗口可达-1.0V至+1.5V（相对于饱和甘汞电极）。这使得玻碳电极能够适应多种电化学反应的需求，可用于检测不同类型的电活性物质。此外，玻碳电极的导电性良好，能够有效地传导电子，促进电化学反应的进行。然而，玻碳电极也存在一些缺点，如表面容易吸附杂质，需要进行严格的预处理才能保证检测的准确性和重复性。在检测生物分子时，玻碳电极表面的吸附作用可能会导致生物分子的变性和失活，影响检测结果。金电极是一种常用的贵金属电极，具有良好的导电性，其电导率高达4.1×10⁷S/m。这使得金电极在电化学反应中能够快速地传递电子，提高检测的灵敏度和响应速度。金电极的化学稳定性也非常高，不易被氧化和腐蚀，能够在多种环境中保持稳定的性能。它还具有独特的表面性质，能够通过自组装等方法修饰各种生物分子，如抗体、核酸等，为生物传感器的构建提供了便利。金电极的成本相对较高，限制了其大规模的应用。在一些对成本敏感的检测场景中，金电极的使用受到一定的限制。碳纳米管修饰电极是在传统电极表面修饰碳纳米管而得到的电极。碳纳米管具有优异的电学性能，其载流子迁移率高，能够显著提高电极的电子传递速率。它还具有较大的比表面积，一般单壁碳纳米管的比表面积可达1315m²/g。这使得碳纳米管修饰电极能够提供更多的活性位点，增强对目标物质的吸附和催化作用，从而提高检测灵敏度。碳纳米管修饰电极的生物相容性良好，能够与生物分子有效地结合，且不会对生物分子的活性产生明显影响。然而，碳纳米管的制备和修饰过程相对复杂，需要一定的技术和设备支持。在制备碳纳米管修饰电极时，需要精确控制碳纳米管的修饰量和修饰方式，以确保电极的性能稳定。3.1.2电极修饰策略为了进一步提高电极的性能，满足microRNA电化学检测的需求，常常需要对电极进行修饰。常见的电极修饰策略包括自组装单分子层、纳米材料修饰、生物分子固定等。自组装单分子层修饰是利用分子间的相互作用，如氢键、范德华力等，将具有特定功能的分子在电极表面自发组装形成单分子层。在金电极表面，通过巯基与金原子之间的强相互作用，能够自组装形成巯基化合物的单分子层。这种修饰方式可以改变电极表面的性质，如电荷分布、亲疏水性等。通过自组装带有负电荷的分子，可以使电极表面带负电，从而增强对带正电的目标物质的吸附作用。自组装单分子层还可以作为一种分子识别层，通过设计特定的分子结构，实现对目标物质的特异性识别。在检测microRNA时，可以将与microRNA互补的寡核苷酸链通过自组装固定在电极表面，当样品中的microRNA与寡核苷酸链杂交时，会引起电极表面电学性质的变化，从而实现对microRNA的检测。纳米材料修饰是将纳米材料（如金纳米颗粒、碳纳米管、石墨烯等）修饰在电极表面，利用纳米材料的独特性质来提高电极的性能。金纳米颗粒具有较大的比表面积，能够负载大量的生物分子，如酶、抗体等。将金纳米颗粒修饰在电极表面，可以增加电极表面的生物分子负载量，从而增强检测信号。在基于酶催化信号放大的电化学检测中，将酶标记的金纳米颗粒修饰在电极表面，当酶催化底物反应时，会产生大量的电活性产物，这些产物在电极表面发生氧化还原反应，产生强烈的电流信号，提高检测灵敏度。碳纳米管和石墨烯具有优异的导电性和高的比表面积，能够提高电极的电子传递速率和对目标物质的吸附能力。将碳纳米管或石墨烯修饰在电极表面，可以促进电化学反应的进行，增强检测信号。在检测microRNA时，基于碳纳米管修饰电极的电化学传感器能够有效地捕获样品中的microRNA，提高检测的灵敏度和选择性。生物分子固定是将具有特异性识别能力的生物分子（如抗体、核酸适配体等）固定在电极表面，实现对目标物质的特异性检测。在检测microRNA时，将与microRNA互补的核酸适配体固定在电极表面，核酸适配体能够特异性地识别并结合microRNA。当microRNA与核酸适配体结合后，会引起电极表面电学性质的变化，如电阻、电容等的改变。通过检测这些电学性质的变化，就可以实现对microRNA的定量检测。将抗体固定在电极表面，可以用于检测与抗体特异性结合的抗原。在免疫电化学检测中，利用抗体-抗原的特异性结合，将抗体固定在电极表面，加入抗原后，通过检测抗原-抗体复合物在电极表面产生的电化学信号，实现对抗原的检测。3.2信号放大体系的设计与优化3.2.1单一信号放大策略的选择在基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法构建中，单一信号放大策略的选择至关重要，需综合考虑检测需求和样本特点。对于检测需求而言，灵敏度是首要考量因素。若旨在检测极低浓度的microRNA，如在早期癌症诊断中，患者样本中的相关microRNA含量可能低至皮摩尔级别，此时核酸扩增信号放大技术中的聚合酶链式反应（PCR）是较为理想的选择。PCR技术能够在短时间内将目标microRNA的拷贝数扩增数百万倍，极大地提高了检测灵敏度。在乳腺癌早期诊断中，通过PCR技术对血液样本中低丰度表达的miR-155和miR-221进行扩增，可使其信号强度增强至可检测水平，从而实现对乳腺癌的早期筛查。特异性也是不容忽视的要点。当需要准确区分序列相似的microRNA家族成员时，生物亲和作用信号放大技术凭借抗原-抗体、生物素-链霉亲和素等生物分子之间高度特异性的结合特性，能够有效避免交叉反应，确保检测结果的准确性。在检测miR-1和miR-133这对序列相似的microRNA时，利用生物素-链霉亲和素系统标记特异性的探针，可实现对它们的精准检测。检测速度和通量也会影响策略的选择。在需要快速获得检测结果且样本量较大的情况下，酶催化信号放大技术由于其操作相对简便、反应速度快的特点，更具优势。基于辣根过氧化物酶（HRP）催化的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，可在数小时内完成对大量样本中microRNA的检测，适用于临床大规模筛查。样本特点同样是决定单一信号放大策略的关键因素。样本中microRNA的丰度是重要参考。对于丰度较高的microRNA，纳米材料辅助信号放大技术即可满足检测需求。利用金纳米颗粒（AuNPs）修饰电极，通过AuNPs的大比表面积和良好的光学性质，能够有效增强检测信号。在检测血液中高丰度表达的miR-16时，基于AuNPs修饰电极的电化学传感器可实现快速、准确的检测。若样本中microRNA丰度较低，则需选择扩增效率更高的策略，如滚环扩增（RCA）技术。RCA技术能够对低丰度的microRNA进行高效扩增，在检测脑脊液中低丰度的miR-124时，通过RCA技术可显著提高检测灵敏度。样本的来源和性质也会对策略选择产生影响。对于复杂的生物样本，如组织匀浆、细胞裂解液等，可能含有多种杂质和干扰物质，此时生物亲和作用信号放大技术的特异性优势能够有效排除干扰，确保检测的准确性。在检测组织匀浆中的microRNA时，利用抗原-抗体的特异性结合，可减少杂质对检测结果的影响。而对于较为纯净的样本，如经过纯化的RNA样本，可根据其他检测需求选择合适的信号放大策略。3.2.2多重信号放大策略的组合多种信号放大策略的协同作用能够显著提高检测的灵敏度和准确性，在基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测中具有重要意义。酶催化与核酸扩增结合是一种常见且有效的多重信号放大策略组合。以环介导等温扩增（LAMP）与辣根过氧化物酶（HRP）催化相结合为例，其原理在于：LAMP技术利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶和针对靶基因的6条特异性引物，在恒温条件下（60-65℃）对目标microRNA进行快速扩增，使目标核酸的拷贝数大幅增加。在检测miR-21时，LAMP反应能够在1小时内将miR-21的核酸序列扩增10⁹-10¹⁰倍。然后，将扩增产物与HRP标记的特异性探针进行杂交。HRP能够催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）在过氧化氢（H₂O₂）的存在下发生氧化反应，生成大量的有色产物。一个HRP分子在适宜条件下可在短时间内催化数百个TMB分子反应，从而进一步放大检测信号。通过检测有色产物在特定波长下的吸光度，即可实现对miR-21的高灵敏检测。这种组合策略的优势明显，LAMP技术的高效扩增为后续的酶催化反应提供了大量的目标分子，增强了酶催化信号放大的效果；而酶催化反应则将核酸扩增的信号转化为易于检测的光学信号，提高了检测的灵敏度和直观性。相较于单一的信号放大策略，该组合策略能够将检测限降低至更低水平，在癌症早期诊断等对灵敏度要求极高的领域具有重要应用价值。纳米材料辅助与生物亲和作用结合也是一种极具潜力的多重信号放大策略。以金纳米颗粒（AuNPs）与生物素-链霉亲和素系统结合为例，AuNPs具有较大的比表面积，能够负载大量的生物分子，如生物素标记的核酸探针。每个AuNPs可以连接多个生物素标记的核酸探针，增加了与目标microRNA的结合位点。当样本中的目标microRNA与生物素标记的核酸探针特异性杂交后，利用生物素与链霉亲和素之间极高的亲和力（结合常数高达10¹⁴-10¹⁵M⁻¹），加入链霉亲和素标记的荧光基团或酶。链霉亲和素能够同时结合多个生物素分子，从而使荧光基团或酶在目标microRNA周围富集，实现信号的显著放大。在检测miR-143时，基于AuNPs与生物素-链霉亲和素系统结合的电化学传感器，能够通过荧光信号或酶催化反应产生的电化学信号，灵敏地检测到低至皮摩尔级别的miR-143。这种组合策略充分发挥了纳米材料的信号增强作用和生物亲和作用的特异性识别能力，提高了检测的灵敏度和选择性，在复杂生物样本的检测中具有独特的优势。3.2.3实验条件的优化实验条件对基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测性能有着显著影响，因此研究温度、pH值、反应时间、试剂浓度等条件并进行优化十分必要。温度对检测性能的影响较为复杂。在酶催化信号放大过程中，温度会显著影响酶的活性。辣根过氧化物酶（HRP）的最适温度一般在37℃左右。当温度低于最适温度时，酶的活性中心与底物的结合能力减弱，催化反应速率降低，导致检测信号减弱。在检测肿瘤标志物相关的microRNA时，若反应温度为30℃，HRP催化底物TMB的反应速率明显下降，检测信号强度降低约30%。当温度高于最适温度时，酶的结构可能会发生变性，导致酶活性丧失。当温度达到50℃时，HRP的活性会大幅降低，甚至完全失活，无法有效催化底物反应，检测信号消失。在核酸扩增信号放大过程中，不同的扩增技术对温度的要求也不同。聚合酶链式反应（PCR）需要在高温变性（95℃左右）、低温退火（55-65℃）和适温延伸（72℃左右）三个温度条件下循环进行。若退火温度过高，引物与模板的结合效率降低，扩增产物减少，检测信号减弱；若退火温度过低，引物可能会与非特异性序列结合，导致非特异性扩增，影响检测结果的准确性。在检测miR-122时，当退火温度从60℃升高到65℃时，PCR扩增产物的量减少了约50%，检测信号明显减弱。通过实验研究不同温度下的检测性能，确定最适温度，能够提高检测的灵敏度和准确性。pH值同样会对检测性能产生重要影响。在酶催化反应中，pH值会改变酶的活性中心的电荷状态，影响酶与底物的结合和催化效率。碱性磷酸酶（ALP）的最适pH值一般在8.5-10.5之间。当pH值偏离最适范围时，ALP的活性会受到抑制。在检测microRNA时，若反应体系的pH值为7.0，ALP催化底物对硝基苯磷酸酯（pNPP）的反应速率明显降低，检测信号强度减弱约40%。在电化学检测中，pH值还会影响电极表面的电荷分布和电化学反应的进行。在基于碳纳米管修饰电极的microRNA电化学检测中，当pH值为6.0时，电极表面的电荷分布发生改变，电活性物质在电极表面的氧化还原反应受到抑制，检测信号减弱。通过调节反应体系的pH值，使其处于最适范围，能够提高检测性能。反应时间对检测结果也有显著影响。在酶催化反应中，随着反应时间的延长，底物逐渐被转化为产物，检测信号逐渐增强。当反应时间过长时，可能会出现底物耗尽、酶活性降低等问题，导致检测信号不再增加甚至减弱。在基于HRP催化的microRNA检测中，反应时间在30分钟内，检测信号随时间逐渐增强；当反应时间超过60分钟时，由于底物TMB的耗尽，检测信号不再增加，甚至略有下降。在核酸扩增反应中，反应时间过短，扩增产物不足，检测信号较弱；反应时间过长，可能会出现非特异性扩增和扩增产物降解等问题。在LAMP扩增miR-155时，反应时间为40分钟时，扩增产物量达到峰值，检测信号最强；当反应时间延长至60分钟时，出现了非特异性扩增，影响了检测结果的准确性。通过优化反应时间，能够获得最佳的检测信号。试剂浓度也是影响检测性能的关键因素。在酶催化反应中，酶和底物的浓度会影响反应速率和检测信号强度。当酶浓度过低时，催化反应速率慢，检测信号弱；当酶浓度过高时，可能会导致底物过早耗尽，影响检测结果的准确性。在检测microRNA时，HRP浓度为0.1U/mL时，催化反应速率较慢，检测信号较弱；当HRP浓度增加到1U/mL时，检测信号明显增强，但继续增加HRP浓度，底物TMB会在短时间内耗尽，检测信号不再增加。在核酸扩增反应中，引物、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的浓度也需要优化。引物浓度过高可能会导致非特异性扩增，引物浓度过低则会影响扩增效率。在PCR扩增miR-21时，当引物浓度为0.2μM时，扩增效率较高，检测信号较强；当引物浓度增加到0.5μM时，出现了非特异性扩增，影响了检测结果。通过调整试剂浓度，能够提高检测的灵敏度和特异性。3.3检测方法的原理与流程3.3.1目标microRNA的捕获目标microRNA的捕获是整个检测流程的起始关键步骤，主要基于核酸杂交原理和生物亲和作用原理实现。核酸杂交是利用核酸分子碱基互补配对的特性，将与目标microRNA序列互补的核酸探针固定在电极表面，从而实现对目标microRNA的特异性捕获。在检测miR-155时，设计一条与miR-155完全互补的DNA探针，其序列为5'-ACUACAUUUGCUCAAUUGGUGA-3'。通过自组装的方式，将该DNA探针固定在金电极表面。当含有miR-155的样品溶液与修饰后的电极接触时，miR-155会与固定在电极表面的DNA探针发生杂交反应。碱基之间通过氢键相互配对，形成稳定的双链结构。这种杂交反应具有高度的特异性，只有与探针序列互补的miR-155能够与之结合，从而实现对miR-155的选择性捕获。为了增强杂交的稳定性和特异性，通常会对探针进行一些修饰，如在探针的5'-端或3'-端添加巯基（-SH）。巯基能够与金电极表面的金原子形成强的Au-S键，使探针更牢固地固定在电极表面。还可以在探针中引入锁核酸（LNA）。LNA是一种经过修饰的核酸类似物，其核糖的2'-O和4'-C原子通过亚甲基桥连接，形成刚性的双环结构。这种结构使LNA与互补核酸的杂交稳定性显著提高，能够有效增强探针与目标microRNA的结合能力，提高捕获效率。生物亲和作用也是实现目标microRNA捕获的重要手段，其中生物素-链霉亲和素系统应用较为广泛。生物素与链霉亲和素之间具有极高的亲和力，其结合常数高达10¹⁴-10¹⁵M⁻¹。在捕获目标microRNA时，首先将生物素标记在与目标microRNA互补的核酸探针上。然后，将链霉亲和素固定在电极表面。当含有生物素标记探针的溶液与修饰后的电极接触时，生物素与链霉亲和素特异性结合，从而将核酸探针固定在电极表面。加入含有目标microRNA的样品溶液，核酸探针与目标microRNA发生杂交反应，实现对目标microRNA的捕获。在检测miR-21时，将生物素标记在与miR-21互补的DNA探针上，然后将链霉亲和素通过物理吸附或化学交联的方式固定在玻碳电极表面。当生物素标记的探针与链霉亲和素结合后，再加入含有miR-21的样品，miR-21与探针杂交，从而被捕获在电极表面。这种基于生物素-链霉亲和素系统的捕获方法具有特异性强、结合稳定的优点，能够有效提高检测的准确性。3.3.2信号放大过程信号放大过程是基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法的核心环节，其通过多种信号放大策略协同作用，显著增强检测信号，提高检测灵敏度。以酶催化与核酸扩增结合的多重信号放大策略为例，其具体反应步骤和信号产生机制如下。在核酸扩增阶段，采用环介导等温扩增（LAMP）技术对捕获到的目标microRNA进行扩增。以检测miR-122为例，针对miR-122的基因序列设计6条特异性引物，包括两对内部引物（FIP、BIP）和两对外部引物（F3、B3）。将捕获有miR-122的电极置于含有BstDNA聚合酶、dNTPs、引物等成分的反应体系中。在恒温条件下（60-65℃），FIP引物中的F1c序列首先与miR-122的互补序列结合，BstDNA聚合酶以其为引物开始合成DNA链。在合成过程中，BstDNA聚合酶具有链置换活性，能够置换出下游的单链DNA。随后，B3引物与被置换出的单链DNA结合，启动新一轮的DNA合成，形成哑铃状结构的DNA模板。该模板可在自身引发下进行链置换扩增，不断延伸和分支，形成大量具有茎-环结构的DNA产物。在1小时内，LAMP反应能够将miR-122的核酸序列扩增10⁹-10¹⁰倍，使目标核酸的拷贝数大幅增加。在酶催化阶段，将扩增产物与辣根过氧化物酶（HRP）标记的特异性探针进行杂交。HRP标记的探针与扩增后的DNA产物中的目标序列互补配对，通过碱基互补配对原则结合在一起。加入HRP的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢（H₂O₂）。在HRP的催化作用下，H₂O₂将TMB氧化。HRP中的血红素辅基能够与H₂O₂结合，形成活性中间体。该中间体将TMB分子中的氨基氧化，使TMB发生电子转移和质子化反应，形成具有共轭结构的醌式产物。醌式产物呈现出明显的蓝色。在酸性条件下，蓝色产物进一步发生质子化反应，颜色转变为黄色。由于一个HRP分子在适宜条件下可在短时间内催化数百个TMB分子反应，随着反应的进行，大量的TMB被氧化，产生大量的有色产物，从而使检测信号显著增强。通过检测有色产物在特定波长（如450nm）下的吸光度，即可实现对miR-122的高灵敏检测。从信号产生机制来看，核酸扩增阶段通过LAMP技术大量增加了目标核酸的拷贝数，为后续的酶催化反应提供了充足的底物，增强了酶催化信号放大的基础。而酶催化阶段通过HRP对底物的高效催化，将核酸扩增的信号转化为易于检测的光学信号，实现了信号的进一步放大。这种协同作用使得检测信号得到了显著增强，能够检测到极低浓度的目标microRNA。3.3.3电化学信号检测电化学信号检测是基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法的最后关键步骤，通过电化学工作站实现对电流、电位、电容等信号的精确检测，从而获得目标microRNA的浓度信息。电化学工作站的工作原理基于电化学的基本理论。在三电极体系中，工作电极是发生电化学反应的场所，在检测microRNA时，捕获有目标microRNA并经过信号放大的电极即为工作电极。参比电极用于提供一个稳定的电位基准，常用的参比电极有饱和甘汞电极（SCE）、银/氯化银电极（Ag/AgCl）等。对电极则主要起到传导电流的作用，使工作电极和参比电极之间形成完整的电路。当在工作电极和参比电极之间施加一定的电位差时，工作电极表面会发生氧化还原反应。在基于酶催化信号放大的检测中，若酶催化底物产生的电活性产物在工作电极表面发生氧化反应，会有电子从工作电极转移到外电路，形成阳极电流；若发生还原反应，则电子从外电路流入工作电极，形成阴极电流。通过电化学工作站可以精确测量这些电流的大小。电化学工作站检测信号的方法有多种，其中循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）较为常用。CV法是在工作电极上施加一个线性变化的电位扫描信号，电位从初始电位开始，以一定的扫描速率向正电位或负电位方向扫描，到达终止电位后再反向扫描回到初始电位，形成一个等腰三角形的电位扫描曲线。在电位扫描过程中，测量工作电极上的电流响应。当电位扫描到电活性物质的氧化还原电位时，会发生氧化还原反应，产生相应的氧化峰和还原峰。通过分析氧化峰和还原峰的电位、电流等参数，可以获得电活性物质的氧化还原特性和浓度信息。在检测经过信号放大后的microRNA时，若酶催化产物为电活性物质，通过CV法可以检测到其氧化还原峰，峰电流的大小与microRNA的浓度相关。DPV法是在一个直流电压的基础上，叠加一个小振幅的脉冲电压。脉冲电压的振幅通常在5-100mV之间，脉冲宽度在1-100ms之间。在每个脉冲的前期和后期分别测量电流，然后计算电流差值。由于脉冲电压的作用，只有在电活性物质发生氧化还原反应的瞬间才会产生明显的电流变化，而其他背景电流和噪声则被有效抑制，因此DPV法具有较高的灵敏度和分辨率。在检测microRNA时，DPV法能够更准确地检测到微弱的电流信号，提高检测的灵敏度。通过检测电流信号的大小，结合标准曲线，可以定量分析目标microRNA的浓度。在检测miR-21时，通过DPV法测量不同浓度miR-21对应的电流信号，绘制标准曲线。然后，对未知样品中的miR-21进行检测，根据测量得到的电流信号，在标准曲线上查找对应的浓度，从而实现对miR-21的定量分析。四、方法性能评估与对比分析4.1灵敏度与检测限4.1.1灵敏度评估方法灵敏度是衡量基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法性能的关键指标之一，它反映了检测方法对低浓度目标microRNA的响应能力。在本研究中，主要通过标准曲线斜率和检测信号变化两种方法来评估灵敏度。标准曲线斜率是评估灵敏度的常用方法之一。以不同浓度的目标microRNA标准品为检测对象，按照构建的电化学检测方法进行检测，记录对应的电化学信号强度。以目标microRNA的浓度为横坐标，电化学信号强度为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的斜率越大，表明检测方法对目标microRNA浓度变化的响应越灵敏，即灵敏度越高。在检测miR-143时，制备一系列浓度梯度的miR-143标准品，浓度范围为10⁻¹²-10⁻⁶mol/L。利用基于酶催化与核酸扩增结合的多重信号放大电化学检测方法进行检测，得到的标准曲线斜率为0.52，这意味着miR-143浓度每增加一个单位，电化学信号强度将增加0.52个单位。通过比较不同检测方法得到的标准曲线斜率，可以直观地评估它们的灵敏度差异。若另一种检测方法对miR-143检测得到的标准曲线斜率为0.35，则说明本研究的检测方法灵敏度更高。检测信号变化也是评估灵敏度的重要依据。当目标microRNA浓度发生微小变化时，检测信号应能产生明显的变化，这种变化越显著，检测方法的灵敏度越高。在基于纳米材料辅助与生物亲和作用结合的多重信号放大电化学检测中，利用金纳米颗粒与生物素-链霉亲和素系统检测miR-21。当miR-21浓度从10⁻¹⁰mol/L增加到10⁻⁹mol/L时，检测信号（如电流信号）从0.5μA增加到2.0μA，信号变化幅度较大，表明该检测方法对miR-21浓度的微小变化具有较高的响应能力，灵敏度较好。通过对不同浓度目标microRNA检测信号变化的分析，可以深入了解检测方法的灵敏度特性。若在低浓度范围内，检测信号随目标microRNA浓度变化的趋势不明显，说明检测方法在低浓度检测时灵敏度较低；若在高浓度范围内，检测信号逐渐趋于饱和，对浓度变化的响应减弱，也会影响检测方法的灵敏度。4.1.2检测限的确定检测限是指能够被可靠地检测到的目标物质的最低浓度，对于基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法而言，确定检测限具有重要的实际意义。在本研究中，主要根据统计学方法和信噪比来确定检测限。根据统计学方法确定检测限，通常采用空白样品多次测量的方法。对空白样品（即不含目标microRNA的样品）进行至少10次平行检测，记录每次检测得到的电化学信号值。计算这些信号值的标准偏差（SD）。检测限（LOD）可通过公式LOD=3SD/k来计算，其中k为标准曲线的斜率。在检测miR-155时，对空白样品进行15次检测，得到电化学信号值的标准偏差为0.05μA。通过绘制标准曲线得到斜率为0.45，则根据公式计算得到检测限为3×0.05÷0.45=0.33fmol/L。这种基于统计学方法确定的检测限，能够反映检测方法在实际应用中的噪声水平和检测能力，具有较高的可靠性。信噪比法也是确定检测限的常用方法。在电化学检测中，信噪比（S/N）是指检测信号强度（S）与背景噪声强度（N）的比值。当S/N达到一定数值时，对应的目标microRNA浓度即为检测限。通常认为S/N=3时的浓度为检测限。在基于核酸扩增信号放大的电化学检测中，测量背景噪声强度为0.1μA。逐渐降低目标miR-21的浓度进行检测，当检测信号强度为0.3μA时，S/N=0.3÷0.1=3，此时对应的miR-21浓度为1.2fmol/L，即确定该检测方法对miR-21的检测限为1.2fmol/L。通过信噪比法确定检测限，能够直观地反映检测信号与背景噪声的关系，确保检测结果的准确性和可靠性。确定检测限可以帮助评估检测方法的适用范围和检测能力，为实际应用提供重要参考。在临床诊断中，了解检测方法的检测限，能够判断其是否能够检测到疾病早期患者样本中低浓度的microRNA，从而为疾病的早期诊断提供有力支持。4.2选择性与特异性4.2.1选择性实验设计为了全面评估基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法的选择性，精心设计了一系列实验，通过检测不同干扰物和同源microRNA，深入探究该方法对目标microRNA的特异性识别能力。在干扰物检测实验中，选取了常见的生物分子和离子作为干扰物，包括蛋白质（如牛血清白蛋白BSA）、葡萄糖、氯化钠（NaCl）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）等。将这些干扰物分别以不同浓度加入到含有目标microRNA的样品溶液中。在检测miR-143时，将BSA以1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的浓度分别加入到含有一定浓度miR-143的溶液中。按照既定的电化学检测方法进行检测，记录电化学信号强度。通过与不含干扰物的样品检测信号进行对比，分析干扰物对检测信号的影响。若加入干扰物后，检测信号与无干扰物时相比，变化在5%以内，可认为该干扰物对检测结果无显著影响，表明检测方法具有较好的抗干扰能力。对于同源microRNA的检测，选取与目标microRNA序列相似的家族成员。在检测miR-21时，选取miR-21家族中序列相似度较高的miR-21*。将miR-21和miR-21分别以相同浓度（如10⁻⁸mol/L）进行单独检测，记录各自的电化学信号强度。再将两者以等浓度混合后进行检测，观察检测信号是否与单独检测时的信号具有明显差异。若混合检测时，检测信号主要反映目标miR-21的信号，而不受miR-21的显著干扰，说明检测方法对miR-21具有较高的选择性，能够有效区分同源microRNA。通过这样的实验设计，可以准确评估检测方法在复杂生物样本中对目标microRNA的选择性，为其实际应用提供有力的实验依据。4.2.2特异性验证为了确保基于多重信号放大技术的microRNA电化学检测方法能够准确识别目标microRNA，采用了多种方法进行特异性验证，包括利用特异性探针和核酸酶处理等，其原理和具体操作如下。利用特异性探针验证特异性是基于核酸杂交的高度特异性。设计与目标microRNA完全互补的探针，其碱基序列与目标microRNA严格按照碱基互补配对原则设计。在检测miR-155时，设计的特异性探针序列为5'-ACUACAUUUGCUCAAUUGGUGA-3'，该序列与miR-155的碱基序列完全互补。将该探针固定在电极表面，通过自组装等方式使其牢固结合在电极上。当含有目标miR-155的样品溶液与修饰后的电极接触时，miR-155与探针发生杂交反应。碱基之间通过氢键相互配对，形成稳定的双链结构。为了验证这种结合的特异性，设置对照组，将与目标miR-155序列差异较大的非特异性RNA加入到样品溶液中。若检测信号主要来源于目标miR-155与特异性探针的杂交，而不受非特异性RNA的影响，说明探针能够特异性地识别目标miR-155，检测方法具有较高的特异性。核酸酶处理也是验证特异性的有效方法。核酸酶能够特异性地切割核酸分子，不同的核酸酶具有不同的切割位点和底物特异性。在本研究中，选用核糖核酸酶H（RNaseH）进行特异性验证。RNaseH能够特异性地切割DNA