DB35-T 896-2009 食品中碱性桃红T含量的测定 液相色谱-荧光检测法

DB35T8962009食品中碱性桃红T含量的测定液相色谱荧光检测法1范围本标准规定了食品中碱性桃红T含量的液相色谱荧光检测方法。本标准适用于糖果、蜜饯、果酱、饮料、调味品等食品中碱性桃红T含量的测定。本方法的检出限为0.05mg/kg，定量限为0.15mg/kg。2原理试样中的碱性桃红T经甲醇水溶液提取，固相萃取柱净化后，采用液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。碱性桃红T在酸性条件下形成阳离子，经C18色谱柱分离，在激发波长540nm、发射波长580nm条件下产生特征荧光，根据保留时间和荧光强度进行定性和定量分析。3试剂和材料除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1甲醇：色谱纯。3.2乙腈：色谱纯。3.3甲酸：色谱纯。3.4乙酸铵：色谱纯。3.5碱性桃红T标准品：纯度≥98%。3.6碱性桃红T标准储备溶液：准确称取碱性桃红T标准品10.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备溶液，于4℃避光保存，有效期3个月。3.7碱性桃红T标准工作溶液：吸取适量标准储备溶液，用甲醇水（1:1，v/v）逐级稀释成0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的标准工作溶液，现用现配。3.8提取液：甲醇水（7:3，v/v）。3.9净化洗脱液：甲醇水（8:2，v/v）。3.100.1%甲酸水溶液：取1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。3.115mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵，用水溶解并定容至1000mL。3.12固相萃取柱：C18柱，500mg/6mL，或相当者。3.13微孔滤膜：0.22μm，有机相。4仪器和设备4.1液相色谱仪：配备荧光检测器。4.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。4.3超声波清洗器：功率250W，频率40kHz。4.4离心机：转速≥4000r/min。4.5旋转蒸发仪。4.6氮吹仪。4.7固相萃取装置。4.8涡旋混合器。4.9pH计：精度±0.02。4.10组织匀浆机。4.11色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者。5试样制备与保存5.1固体试样糖果、蜜饯等固体试样，取代表性样品约200g，用组织匀浆机匀浆，装入洁净容器中，密封后于18℃冷冻保存。5.2半固体试样果酱、调味酱等半固体试样，取代表性样品约200g，充分搅拌均匀，装入洁净容器中，密封后于4℃冷藏保存。5.3液体试样饮料等液体试样，取代表性样品约200mL，充分摇匀，装入洁净容器中，密封后于4℃冷藏保存。6分析步骤6.1试样提取6.1.1固体和半固体试样称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入20mL提取液，涡旋混合2min，超声提取20min，以4000r/min离心5min，将上清液转移至100mL容量瓶中。残渣重复提取一次，合并上清液，用提取液定容至刻度，摇匀备用。6.1.2液体试样称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入20mL提取液，涡旋混合2min，超声提取15min，以4000r/min离心5min，将上清液转移至100mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，摇匀备用。6.2净化6.2.1固相萃取柱活化依次用5mL甲醇、5mL水活化固相萃取柱，保持柱体湿润。6.2.2上样取10mL提取液，以1mL/min的流速通过固相萃取柱。6.2.3淋洗用5mL水淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液。6.2.4洗脱用5mL净化洗脱液洗脱固相萃取柱，收集洗脱液于10mL刻度试管中。6.2.5浓缩将洗脱液在40℃水浴中氮吹至近干，用1.0mL甲醇水（1:1，v/v）溶解残渣，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱分析。6.3.1色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者。6.3.2流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈。6.3.3梯度洗脱程序：0min时，A相90%，B相10%；10min时，A相70%，B相30%；15min时，A相50%，B相50%；20min时，A相90%，B相10%；25min时，A相90%，B相10%。6.3.4流速：1.0mL/min。6.3.5柱温：30℃。6.3.6进样量：10μL。6.3.7荧光检测器：激发波长540nm，发射波长580nm。6.4标准曲线的绘制分别吸取0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的碱性桃红T标准工作溶液各10μL，按6.3规定的色谱条件进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。6.5试样测定取6.2.5处理后的试样溶液10μL，按6.3规定的色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，根据标准曲线计算试样中碱性桃红T的含量。7结果计算试样中碱性桃红T的含量按式（1）计算：X=(c×V×f)/m式中：X——试样中碱性桃红T的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c——从标准曲线上查得的试样溶液中碱性桃红T的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；f——稀释倍数；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9回收率在糖果、蜜饯、果酱、饮料、调味品