基于慢病毒系统构建肝癌细胞多荧光EMT指示模型及功能探究

基于慢病毒系统构建肝癌细胞多荧光EMT指示模型及功能探究一、引言1.1研究背景原发性肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病之一，在所有恶性肿瘤中，其致死率居高不下，位于恶性肿瘤总致死原因的第五位。据统计，2018年中国新增肝癌病例高达39万多人，位居新发恶性肿瘤的第三位；同年，因肝癌死亡的人数超过36万，死亡人数亦居恶性肿瘤第三位，且全世界近47%的肝癌病例发生在中国。肝癌的高发病率和高死亡率给社会和家庭带来了沉重的负担，严重影响患者的生活质量和生存预期。和其他恶性肿瘤一样，肝癌治疗失败的主要原因是复发转移。一旦肝癌发生转移，病情往往迅速恶化，治疗难度大幅增加。肝内转移会致使肝脏出现多个病灶或弥漫性病灶，大量正常肝细胞被癌细胞取代，肝功能严重受损甚至衰竭；癌细胞转移至门静脉形成癌栓，引发门静脉高压，导致食管胃底静脉曲张、破裂出血以及肝性腹水等严重并发症；通过血液途径转移到肺组织、骨关节等其他部位，会造成相应器官的损害。此外，转移引发的严重癌性消耗症状，会使患者体质极度虚弱、身形消瘦，甚至出现全身衰竭，危及生命。转移性肝癌还会导致肝功能下降，出现黄疸、腹水等症状，严重时可引发肝性脑病，导致认知障碍、人格改变和意识障碍等，患者的生存时间也会大大缩短。在肿瘤转移过程中，上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）所表现出的细胞学机制，即细胞粘附性的丧失和迁移能力的获得，作为肿瘤转移级联反应的关键环节，受到了众多学者的高度关注。EMT的主要特征是上皮细胞标记蛋白E-cadherin表达降低，而间质标记蛋白表达上调。越来越多的证据表明，EMT是肝癌转移的关键事件，在肝癌的侵袭转移过程中发挥着极为重要的作用。例如，李勤喜教授课题组的研究发现，转录因子ZEB1在高转移性肝癌细胞系中通过非经典转录调控方式促进磷酸果糖激酶PFK1的肌肉型同工酶PFKM转录表达，增强瓦伯格效应，进而促进肝癌细胞的增殖、迁移、原位成瘤和肝内转移能力。李博安教授课题组揭示了Wnt信号在诱导肝细胞肝癌EMT过程中，可通过Snail、Slug抑制HNF4α表达，同时HNF4α与TCF4竞争结合β-catenin抑制Wnt信号诱导的EMT过程，二者形成双负反馈环控制肝癌转移。鉴于EMT在肝癌转移中的关键地位，如何动态监测肝癌细胞的EMT事件，对深入剖析肝癌转移机理，开发针对性治疗策略至关重要。通过实时、准确地监测EMT过程，可以及时了解肝癌细胞的生物学行为变化，为早期诊断和干预提供依据；有助于筛选出对EMT过程具有关键调控作用的分子靶点，为研发新型抗癌药物奠定基础；还能为临床治疗方案的选择和优化提供指导，提高治疗效果，改善患者预后。1.2研究目的与意义本研究旨在构建基于慢病毒表达系统的、由EMT相关标志物E-cadherin、Slug启动子驱动的多荧光报告系统，从而建立肝癌细胞多荧光EMT指示模型。该模型能够动态显示肝癌细胞的EMT过程，为标记示踪肝癌EMT细胞，深入研究肝癌转移机制提供有力工具。通过利用该模型，进一步剖析肝癌细胞EMT过程中的分子调控机制，明确关键调控因子及其相互作用网络，揭示EMT在肝癌转移中的作用机制，为肝癌转移的防治提供理论依据。本研究具有重要的理论意义和临床应用价值。从理论意义来看，构建肝癌细胞多荧光EMT指示模型，为研究EMT过程提供了一种全新的可视化工具，有助于深入了解EMT的分子机制和调控网络，丰富和完善肿瘤转移理论，为进一步揭示肝癌转移的奥秘奠定基础。从临床应用价值而言，通过动态监测肝癌细胞的EMT事件，能够筛选出与肝癌转移密切相关的分子标志物，为肝癌的早期诊断和预后评估提供新的指标；明确EMT过程中的关键调控靶点，为开发针对性的治疗策略提供理论支持，有助于研发新型抗癌药物，提高肝癌的治疗效果，改善患者的生存质量和预后。1.3国内外研究现状在肝癌研究领域，上皮-间质转化（EMT）机制一直是国内外学者关注的焦点。国外学者在EMT的基础理论研究方面取得了诸多成果，明确了多种调控EMT过程的关键转录因子，如Snail、Slug、Twist等。这些转录因子通过与上皮细胞标志物E-cadherin等基因的启动子区域结合，抑制其表达，同时促进间质细胞标志物如Vimentin、N-cadherin等的表达，从而推动EMT进程。例如，美国学者在乳腺癌细胞研究中发现，Snail蛋白能够直接结合E-cadherin基因启动子区域的特定序列，抑制其转录，进而诱导细胞发生EMT，增强细胞的迁移和侵袭能力。在肝癌研究中，也证实了类似的调控机制。国内学者在肝癌EMT机制研究方面也成果丰硕，通过对大量临床样本和肝癌细胞系的研究，揭示了EMT在肝癌转移中的关键作用，并发现了一些与肝癌EMT相关的新分子和信号通路。例如，有研究团队发现长链非编码RNA（lncRNA）在肝癌EMT过程中发挥重要调控作用，通过影响相关信号通路，调节EMT相关蛋白的表达，进而影响肝癌细胞的侵袭和转移能力。在荧光报告基因用于细胞生物学研究方面，国外起步较早，已成功构建多种基于荧光报告基因的细胞模型，用于监测细胞内特定基因的表达和信号通路的激活。例如，利用绿色荧光蛋白（GFP）标记特定基因的启动子，实时观察基因在细胞发育和分化过程中的表达变化。国内在这一领域也紧跟国际步伐，不断创新和改进荧光报告基因技术。通过将不同颜色的荧光蛋白与特定基因结合，实现对多个基因表达的同时监测。有研究构建了红色荧光蛋白（RFP）和黄色荧光蛋白（YFP）双标记的报告系统，用于研究细胞周期调控相关基因的表达变化。慢病毒载体作为高效的基因转移工具，在国内外基因治疗和基础研究中得到了广泛应用。国外利用慢病毒载体将治疗基因导入靶细胞，开展了多项基因治疗临床试验。在癌症治疗研究中，通过慢病毒载体将抑癌基因导入肿瘤细胞，抑制肿瘤生长和转移。国内在慢病毒载体的应用研究方面也取得了显著进展，不仅优化了慢病毒载体的构建和包装技术，提高了载体的安全性和转染效率，还将其应用于多种疾病模型的构建和药物研发。例如，利用慢病毒载体构建了携带特定基因的细胞模型，用于筛选和评价新型抗癌药物的疗效。然而，目前国内外对于肝癌EMT的研究，大多是通过传统的分子生物学方法，如实时定量PCR、Westernblot等，在静态层面检测EMT相关标志物的表达变化，难以实时、动态地观察EMT的全过程。虽然已有一些基于荧光报告基因的细胞模型用于研究特定基因的表达，但针对肝癌EMT过程，构建多荧光EMT指示模型的研究相对较少。本研究提出构建基于慢病毒表达系统的、由EMT相关标志物E-cadherin、Slug启动子驱动的多荧光报告系统，建立肝癌细胞多荧光EMT指示模型，具有创新性和必要性。该模型能够弥补现有研究的不足，实现对肝癌细胞EMT过程的实时动态监测，为深入研究肝癌转移机制提供全新的工具和思路。二、相关理论基础2.1上皮-间质转化（EMT）2.1.1EMT的概念与过程上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下，向间质细胞转化的过程。在这个过程中，上皮细胞的形态、结构和功能发生显著改变。上皮细胞通常具有紧密的细胞连接和极性，细胞间通过紧密连接、桥粒和黏着连接等结构相互作用，形成有序的上皮组织。在EMT过程中，这些细胞连接结构逐渐被破坏，细胞极性丧失。上皮细胞标志性蛋白E-cadherin表达下调，导致细胞间黏附力下降，上皮细胞之间的紧密联系被打破。与此同时，间质细胞标志物如N-cadherin、Vimentin等表达上调。细胞形态也由原来的多边形或柱状转变为梭形或成纤维细胞样，具有更强的迁移和侵袭能力。这种形态和结构的改变使得细胞能够从上皮组织中脱离出来，获得间质细胞的特性，进而侵入周围组织和血管，为肿瘤的转移奠定基础。EMT的发生涉及多个信号通路和转录因子的调控。转化生长因子-β（TGF-β）信号通路是诱导EMT的关键通路之一。TGF-β与细胞表面的受体结合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白进入细胞核，与其他转录因子相互作用，调节EMT相关基因的表达。Wnt/β-catenin信号通路也在EMT中发挥重要作用。当Wnt信号激活时，β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核，与T细胞因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）等转录因子结合，启动EMT相关基因的转录。此外，Notch、Hedgehog等信号通路以及Snail、Slug、Twist等转录因子也参与了EMT的调控过程。这些信号通路和转录因子相互作用，形成复杂的调控网络，共同调节EMT的发生和发展。在胚胎发育过程中，EMT起着至关重要的作用。例如，在原肠胚形成过程中，上皮细胞通过EMT转化为间质细胞，使得细胞能够迁移和分化，形成不同的组织和器官。在神经嵴形成过程中，神经上皮细胞发生EMT，迁移到身体的不同部位，分化为多种细胞类型，如神经元、神经胶质细胞等。在肿瘤发生发展过程中，EMT同样扮演着重要角色。肿瘤细胞通过EMT获得迁移和侵袭能力，从而突破基底膜，侵入周围组织和血管，发生远处转移。EMT还与肿瘤的耐药性、干细胞特性以及免疫逃逸等密切相关。研究表明，发生EMT的肿瘤细胞对化疗药物和放疗的敏感性降低，更容易存活和增殖。同时，EMT赋予肿瘤细胞干细胞特性，使其具有自我更新和分化的能力，增加了肿瘤复发和转移的风险。此外，EMT过程中的肿瘤细胞能够逃脱免疫系统的监视，降低机体对肿瘤的免疫攻击。2.1.2EMT在肝癌中的作用机制在肝癌的发展进程中，上皮-间质转化（EMT）扮演着极为关键的角色，其通过多种机制促进肝癌的转移，严重影响患者的预后。首先，EMT能够显著增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力。在正常情况下，上皮细胞之间通过紧密连接、桥粒和黏着连接等结构相互作用，形成稳定的上皮组织，限制了细胞的迁移。然而，在EMT过程中，上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达下调，导致细胞间黏附力下降，细胞连接结构被破坏。同时，间质细胞标志物如N-cadherin、Vimentin等表达上调，细胞形态由上皮样转变为梭形或成纤维细胞样，获得了更强的迁移和侵袭能力。这些发生EMT的肝癌细胞能够突破基底膜，侵入周围的组织和血管，为肝癌的转移创造了条件。其次，EMT与肝癌的血管生成密切相关。肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，血管生成是肿瘤获取营养和氧气的关键过程。研究发现，发生EMT的肝癌细胞能够分泌多种血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）等。这些因子可以刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，促进肿瘤血管的生成。肿瘤血管的生成不仅为肿瘤细胞提供了营养和氧气，还为肿瘤细胞进入血液循环提供了通道，进一步促进了肝癌的转移。再者，EMT在肝癌的免疫逃逸中发挥重要作用。免疫系统是机体抵御肿瘤的重要防线，但肿瘤细胞可以通过多种机制逃避机体的免疫监视。发生EMT的肝癌细胞能够下调表面主要组织相容性复合体（MHC）分子的表达，减少肿瘤抗原的呈递，降低免疫系统对肿瘤细胞的识别和攻击。此外，EMT还可以诱导肝癌细胞分泌免疫抑制因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-6（IL-6）等。这些免疫抑制因子可以抑制免疫细胞的活性，如T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）等，削弱机体的抗肿瘤免疫反应，使得肿瘤细胞能够逃脱免疫系统的监视和攻击，从而促进肝癌的转移和发展。最后，EMT赋予肝癌细胞抗凋亡和耐药性。在肿瘤治疗过程中，肿瘤细胞的抗凋亡和耐药性是导致治疗失败的重要原因之一。发生EMT的肝癌细胞能够激活一系列抗凋亡信号通路，如PI3K/Akt、NF-κB等信号通路，上调抗凋亡蛋白的表达，如Bcl-2、Bcl-XL等，同时下调促凋亡蛋白的表达，如Bax、Bad等，从而增强肝癌细胞的抗凋亡能力。此外，EMT还可以导致肝癌细胞对化疗药物和放疗的敏感性降低。发生EMT的肝癌细胞能够上调药物外排泵的表达，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）等，促进化疗药物的外排，降低细胞内药物浓度，从而产生耐药性。这些机制使得发生EMT的肝癌细胞在肿瘤治疗过程中能够存活和增殖，增加了肝癌治疗的难度。2.1.3EMT相关标志物上皮-间质转化（EMT）过程涉及多种标志物的表达变化，这些标志物在EMT的发生、发展以及肝癌的转移中发挥着重要作用。E-cadherin是上皮细胞的重要标志物，其表达水平的变化是EMT的关键特征之一。E-cadherin是一种钙黏蛋白，主要介导上皮细胞之间的黏附作用。在正常上皮组织中，E-cadherin高表达，通过与相邻细胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成紧密的细胞连接，维持上皮组织的完整性和极性。在EMT过程中，E-cadherin的表达受到多种转录因子的抑制，如Snail、Slug、ZEB1等。这些转录因子通过与E-cadherin基因启动子区域的特定序列结合，抑制其转录，导致E-cadherin表达下调。E-cadherin表达的降低使得上皮细胞间的黏附力下降，细胞连接被破坏，上皮细胞逐渐失去极性，获得间质细胞的特性，从而促进细胞的迁移和侵袭。在肝癌中，E-cadherin表达的缺失与肿瘤的侵袭、转移和不良预后密切相关。研究表明，肝癌组织中E-cadherin表达越低，肿瘤的恶性程度越高，患者的生存时间越短。Slug是一种锌指转录因子，在EMT过程中发挥重要的调控作用。Slug可以通过与E-cadherin基因启动子区域的E-box序列结合，抑制E-cadherin的转录，从而促进EMT的发生。此外，Slug还可以调节其他EMT相关基因的表达，如N-cadherin、Vimentin等，进一步增强细胞的间质特性和迁移能力。在肝癌中，Slug的高表达与肿瘤的侵袭、转移和不良预后相关。研究发现，Slug在肝癌组织中的表达水平明显高于正常肝组织，且其表达水平与肝癌的TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理参数密切相关。高表达Slug的肝癌患者更容易发生肿瘤转移，生存率更低。N-cadherin是间质细胞的标志物之一，在EMT过程中其表达上调。N-cadherin主要介导间质细胞之间以及间质细胞与其他细胞之间的黏附作用。在正常上皮细胞中，N-cadherin的表达水平较低。当上皮细胞发生EMT时，N-cadherin的表达被诱导上调。N-cadherin的表达上调不仅可以增强间质细胞之间的黏附，还可以促进肿瘤细胞与血管内皮细胞、基质细胞等的黏附，从而有利于肿瘤细胞的迁移和侵袭。在肝癌中，N-cadherin的高表达与肿瘤的侵袭、转移和不良预后相关。研究表明，N-cadherin在肝癌组织中的表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关，高表达N-cadherin的肝癌患者更容易发生肿瘤转移，预后更差。Vimentin是一种中间丝蛋白，主要表达于间质细胞中。在EMT过程中，Vimentin的表达上调，其可以参与细胞骨架的重构，增强细胞的迁移和侵袭能力。Vimentin还可以与其他细胞骨架蛋白相互作用，调节细胞的形态和运动。在肝癌中，Vimentin的高表达与肿瘤的侵袭、转移和不良预后相关。研究发现，Vimentin在肝癌组织中的表达水平与肿瘤的TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理参数密切相关。高表达Vimentin的肝癌患者更容易发生肿瘤转移，生存率更低。2.2荧光蛋白报告基因2.2.1荧光蛋白的种类与特性荧光蛋白是一类能够在特定波长激发光下发出荧光的蛋白质，在细胞生物学和分子生物学研究中具有广泛的应用。常见的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）和蓝色荧光蛋白（BFP）等。这些荧光蛋白具有以下特性：稳定性：荧光蛋白具有较高的化学稳定性，能够在多种实验条件下保持其荧光特性。例如，GFP在经过甲醛固定和石蜡包埋等处理后，其荧光性质依然不受影响，这使得它可以用于组织切片的免疫荧光染色等实验，便于对细胞和组织进行长期观察和分析。检测便利性：荧光蛋白的荧光信号可以通过荧光显微镜、流式细胞仪等设备进行快速、灵敏的检测。在荧光显微镜下，能够直接观察到表达荧光蛋白的细胞或组织发出的荧光，直观地了解其分布和动态变化。流式细胞仪则可以对大量细胞进行快速分析，准确测量细胞内荧光蛋白的表达水平，实现对细胞群体的定量研究。无细胞毒性：荧光蛋白对细胞的正常生理功能几乎没有影响，不会干扰细胞的生长、增殖、分化等过程。这使得研究人员能够在不影响细胞正常生命活动的前提下，对细胞内的基因表达、蛋白质定位等进行研究。例如，将荧光蛋白基因与目的基因融合表达，不会改变目的基因的功能和蛋白质的生物学活性，从而可以准确地研究目的蛋白在细胞内的行为。多重标记：不同颜色的荧光蛋白可以同时使用，实现对多个目标的同时标记和检测。通过选择激发波长和发射波长不同的荧光蛋白，如GFP和RFP，可以在同一实验中对两种不同的细胞群体或分子进行区分和研究。在肿瘤研究中，可以用GFP标记肿瘤细胞，用RFP标记免疫细胞，观察肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。2.2.2在细胞示踪与监测中的应用原理荧光蛋白在细胞示踪与监测中的应用原理基于其能够与目标分子或细胞进行特异性结合或表达。通过基因工程技术，将荧光蛋白基因与目标基因融合，构建成融合基因表达载体。将该载体导入细胞后，细胞会表达出融合蛋白，其中荧光蛋白作为标记物，与目标蛋白紧密结合在一起。这样，在特定波长激发光的照射下，融合蛋白会发出荧光，从而实现对目标蛋白的定位和动态变化的监测。在研究蛋白质的亚细胞定位时，将GFP基因与待研究的蛋白质基因融合，转染细胞后，通过荧光显微镜观察GFP的荧光信号，就可以确定该蛋白质在细胞内的具体位置。在细胞示踪方面，将荧光蛋白基因导入细胞后，细胞会持续表达荧光蛋白。当细胞在体内或体外环境中迁移、增殖时，荧光蛋白会随着细胞的运动而移动。通过荧光成像技术，可以实时追踪细胞的轨迹和分布情况。在肿瘤转移研究中，将荧光蛋白标记的肿瘤细胞注射到动物体内，利用活体成像系统可以观察肿瘤细胞在体内的迁移路径和转移部位，为研究肿瘤转移机制提供重要信息。此外，荧光蛋白还可以用于监测细胞内的生理过程和基因表达变化。某些荧光蛋白的荧光强度会受到细胞内环境因素的影响，如pH值、离子浓度等。通过设计对特定生理参数敏感的荧光蛋白，可以实时监测细胞内这些参数的变化。利用pH敏感的荧光蛋白可以监测细胞内的酸碱度变化，了解细胞的代谢状态。在基因表达监测方面，将荧光蛋白基因置于特定基因的启动子下游，当该基因被激活表达时，荧光蛋白也会随之表达，通过检测荧光强度可以定量分析基因的表达水平。2.3慢病毒载体2.3.1慢病毒载体的结构与特点慢病毒载体属于逆转录病毒科，其基因组由两条相同的单链RNA组成，被包裹在一个直径约80-120nm的包膜中。病毒粒子的核心部分是由p24蛋白形成的锥形衣壳，保护着病毒基因组。包膜上镶嵌着病毒糖蛋白（gp41和gp120），这些糖蛋白在病毒进入细胞的过程中起着至关重要的作用，它们能够与宿主细胞表面的受体结合，介导病毒包膜与细胞膜的融合，从而使病毒核心进入细胞。慢病毒载体具有诸多独特的特点，使其在基因传递领域备受关注。首先，它对分裂和非分裂细胞都具有强大的感染能力。这一特性使得慢病毒载体能够广泛应用于多种细胞类型的基因转导，包括神经元、干细胞和免疫细胞等难以感染的细胞。例如，在神经科学研究中，需要将特定基因导入神经元细胞以研究其功能，慢病毒载体就能够有效地将基因传递到神经元中，为研究神经发育、神经退行性疾病等提供了有力的工具。其次，慢病毒载体引发的免疫反应较小。传统的病毒载体在进入机体后，往往会引起强烈的免疫反应，导致载体被免疫系统迅速清除，影响基因治疗的效果。而慢病毒载体经过改造，去除了一些病毒毒性相关基因，极大地降低了免疫原性，减少了免疫系统对载体的攻击，从而提高了基因传递的效率和稳定性。再者，慢病毒载体几乎无毒性。在基因治疗中，载体的毒性是一个重要的安全问题。慢病毒载体通过优化设计，降低了对宿主细胞的毒性，减少了对细胞正常生理功能的干扰，使得基因治疗更加安全可靠。最后，慢病毒载体能够稳定地整合外源基因到宿主细胞基因组中。这一特点使得外源基因能够在宿主细胞中持续表达，实现长期的基因功能研究和治疗。在基因治疗中，稳定的基因表达对于治疗遗传性疾病、癌症等具有重要意义。例如，对于一些遗传性单基因疾病，可以通过慢病毒载体将正常的基因导入患者的细胞中，使其稳定表达，从而达到治疗疾病的目的。2.3.2在基因传递中的优势与应用与其他基因传递载体相比，慢病毒载体具有显著的优势。与腺病毒载体相比，腺病毒载体虽然具有较高的转染效率，但它不能将基因整合到宿主细胞基因组中，导致基因表达时间较短，且容易引起免疫反应。而慢病毒载体能够稳定整合外源基因，实现长期的基因表达，并且免疫原性较低。与质粒载体相比，质粒载体虽然操作简单，但转染效率较低，尤其是对于一些难以转染的细胞类型效果不佳。慢病毒载体则能够高效地感染多种细胞，弥补了质粒载体的不足。在基因治疗领域，慢病毒载体已被广泛应用于多种疾病的研究和治疗。在癌症治疗中，通过慢病毒载体将抑癌基因导入肿瘤细胞，能够抑制肿瘤细胞的生长和转移。研究人员利用慢病毒载体将p53基因导入肝癌细胞中，发现肿瘤细胞的增殖能力明显受到抑制，细胞凋亡增加。在遗传性疾病治疗中，慢病毒载体也展现出巨大的潜力。对于一些遗传性单基因疾病，如镰状细胞贫血、血友病等，可以通过慢病毒载体将正常的基因导入患者的造血干细胞中，再将这些改造后的干细胞回输到患者体内，使其分化为正常的血细胞，从而达到治疗疾病的目的。在科学研究中，慢病毒载体同样发挥着重要作用。在基因功能研究中，利用慢病毒载体将目的基因导入细胞，通过观察细胞的表型变化来研究基因的功能。在干细胞研究中，慢病毒载体可以用于对干细胞进行基因修饰，研究干细胞的分化机制和应用。研究人员利用慢病毒载体将特定基因导入胚胎干细胞中，成功诱导干细胞向神经细胞分化，为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。三、肝癌细胞多荧光EMT指示模型的构建3.1实验材料与准备3.1.1细胞株与菌株本实验选用人肝癌细胞株PLC/PRF/5，购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。PLC/PRF/5细胞具有上皮样形态，贴壁生长，能够表达甲胎蛋白（AFP），在肝癌研究中应用广泛，可用于探究肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为。同时选用人宫颈癌细胞系Hela细胞，其来源于美国模式培养物集存库（ATCC）。Hela细胞生长迅速，具有无限增殖的能力，常用于基因表达、蛋白质功能研究等领域。实验中使用的大肠杆菌菌株DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α是一种常用于分子克隆的感受态细胞，其具有转化效率高、生长速度快等特点，能够高效摄取外源DNA，并在合适的培养条件下大量繁殖，为后续的质粒构建和扩增提供了便利。3.1.2主要试剂与仪器实验所需的主要生化试剂包括：限制性内切酶EcoRI、HindIII、BamHI等，购自宝生物工程（大连）有限公司，用于DNA片段的切割；T4DNA连接酶，同样购自宝生物工程（大连）有限公司，可催化DNA片段的连接反应，实现目的基因与载体的连接；高保真DNA聚合酶，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，在PCR扩增过程中能够保证DNA扩增的准确性，减少碱基错配的发生；质粒小提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司，分别用于质粒DNA的提取和PCR产物、酶切片段等DNA的回收；RNA提取试剂Trizol，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于从细胞中提取总RNA；反转录试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司，可将RNA反转录为cDNA，以便后续进行PCR扩增和基因表达分析；实时定量PCR试剂，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，用于定量检测基因的表达水平。细胞培养相关试剂有：RPMI-1640培养基和DMEM培养基，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，分别用于肝癌细胞和Hela细胞的培养；胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司，为细胞生长提供必要的营养成分；胰蛋白酶，购自碧云天生物技术有限公司，用于细胞的消化传代。主要溶液包括：LB培养基，用于大肠杆菌的培养，配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，高压灭菌后备用；氨苄青霉素溶液，浓度为100mg/mL，用于筛选含有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌菌株，使用时按1:1000的比例加入到LB培养基中；卡那霉素溶液，浓度为50mg/mL，用于筛选含有卡那霉素抗性基因的菌株，添加比例同氨苄青霉素溶液；PBS缓冲液，配方为：氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸氢二钠1.44g/L，磷酸二氢钾0.24g/L，pH7.4，用于细胞的洗涤和实验操作中的缓冲。主要仪器设备有：PCR扩增仪，型号为ABI2720，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于DNA的扩增；凝胶成像系统，型号为Bio-RadGelDocXR+，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于观察和分析DNA凝胶电泳结果；离心机，型号为Eppendorf5424R，购自艾本德（中国）有限公司，用于细胞和DNA样品的离心分离；荧光显微镜，型号为OlympusIX73，购自奥林巴斯（中国）有限公司，用于观察细胞内荧光蛋白的表达；流式细胞仪，型号为BDFACSCalibur，购自美国BD公司，用于检测细胞表面标志物和分选特定细胞群体；CO₂培养箱，型号为ThermoScientificHeracellVios160i，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，为细胞培养提供适宜的温度、湿度和CO₂浓度环境。3.1.3引物设计与合成根据GenBank中登录的人E-cadherin基因（NM_004360）和Slug基因（NM_003068）序列，使用PrimerPremier5.0软件进行引物设计。设计引物时，遵循以下原则：引物长度一般为18-25bp，以保证引物与模板的特异性结合；引物的GC含量控制在40%-60%，以维持引物的稳定性；引物3’端避免出现连续的碱基重复，防止错配；引物的Tm值（解链温度）在55-65℃之间，以确保引物在PCR反应中的有效退火。针对E-cadherin基因，设计上游引物5’-CCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’，其中下划线部分为EcoRI酶切位点；下游引物5’-CCCAAGCTTCTACTCCTTGCTCCTTGATG-3’，下划线部分为HindIII酶切位点。对于Slug基因，上游引物设计为5’-CGCGGATCCATGGCTGCCGAGCAGCGC-3’，下划线部分是BamHI酶切位点；下游引物为5’-CCCAAGCTTTCAGGGGTGGAAGGTGCTG-3’，下划线部分为HindIII酶切位点。将设计好的引物序列发送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。合成后的引物经PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）纯化，以去除杂质和引物二聚体，确保引物的质量和纯度。引物溶解于无菌去离子水中，配制成100μmol/L的储存液，保存于-20℃冰箱备用。使用时，将储存液稀释至10μmol/L的工作液用于PCR反应。3.2慢病毒表达质粒的构建3.2.1E-cadherin启动子驱动的慢病毒载体构建从Hela细胞基因组中抽提E-cadherin启动子。取对数生长期的Hela细胞，用胰蛋白酶消化后，以1000r/min离心5min收集细胞。按照Trizol试剂说明书的步骤，加入适量Trizol试剂裂解细胞，充分混匀后，室温静置5min。随后加入氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。4℃、12000r/min离心15min，此时溶液分为三层，取上层无色水相转移至新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃、12000r/min离心10min，可见管底出现白色絮状沉淀，即为基因组DNA。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀两次，每次4℃、7500r/min离心5min。最后将沉淀晾干，加入适量的无菌去离子水溶解基因组DNA，-20℃保存备用。以抽提得到的Hela细胞基因组DNA为模板，进行E-cadherin启动子的PCR扩增。PCR反应体系为：5×PrimeSTARMaxBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）8μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，模板DNA1μL，加无菌去离子水至总体积50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增结束后，取5μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察，可见在预期大小位置出现特异性条带，表明E-cadherin启动子扩增成功。随后，使用DNA凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行回收纯化，按照试剂盒说明书操作，得到纯化后的E-cadherin启动子片段。将纯化后的E-cadherin启动子片段与pMD19-TSimple载体进行连接。连接反应体系为：pMD19-TSimpleVector1μL，E-cadherin启动子片段4μL，SolutionI5μL，总体积10μL。轻轻混匀后，16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取10μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速冰浴2min。加入900μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h。将培养物以5000r/min离心5min，弃去部分上清，留约100μL重悬菌体，将其涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，挑取平板上的单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切体系为：10×HBuffer2μL，EcoRI1μL，HindIII1μL，质粒DNA5μL，加无菌去离子水至总体积20μL。37℃酶切2h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，若在预期位置出现与E-cadherin启动子大小相符的条带，则表明重组质粒T-pE-cad构建成功。将鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序验证，确保E-cadherin启动子序列的准确性。将E-cadherin启动子与荧光蛋白片段连接，构建pE-cad-RFP/YFP/BFP载体。首先，用EcoRI和HindIII双酶切重组质粒T-pE-cad和含有RFP/YFP/BFP基因的载体，酶切体系同上述双酶切鉴定体系。37℃酶切2h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒分别回收E-cadherin启动子片段和RFP/YFP/BFP基因片段。将回收的E-cadherin启动子片段与RFP/YFP/BFP基因片段进行连接，连接反应体系为：E-cadherin启动子片段4μL，RFP/YFP/BFP基因片段3μL，T4DNALigase1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，总体积10μL。16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化及筛选步骤同前。挑取单菌落进行培养，提取质粒后进行双酶切鉴定和测序验证，确保pE-cad-RFP/YFP/BFP载体构建正确。将pE-cad-RFP/YFP/BFP载体与慢病毒骨架质粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE进行连接，构建慢病毒表达质粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP。用相应的限制性内切酶（如EcoRI和HindIII）分别双酶切pE-cad-RFP/YFP/BFP载体和慢病毒骨架质粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE，酶切体系及条件同前。酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。将回收的pE-cad-RFP/YFP/BFP片段与慢病毒骨架质粒片段进行连接，连接体系及条件同前。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化及筛选步骤同前。挑取单菌落进行培养，提取质粒后进行双酶切鉴定和测序验证，最终成功构建慢病毒表达质粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP。3.2.2Slug启动子驱动的慢病毒载体构建以类似的方法构建Slug启动子驱动的慢病毒表达质粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP。首先，以Hela细胞基因组DNA为模板，进行Slug启动子的PCR扩增。PCR反应体系和条件与E-cadherin启动子扩增类似，仅引物更换为针对Slug启动子设计的引物。PCR扩增体系为：5×PrimeSTARMaxBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）8μL，Slug上游引物（10μmol/L）1μL，Slug下游引物（10μmol/L）1μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，模板DNA1μL，加无菌去离子水至总体积50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物，在预期大小位置出现特异性条带，使用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化Slug启动子片段。将纯化后的Slug启动子片段与pMD19-TSimple载体连接，连接体系和转化、筛选步骤与E-cadherin启动子连接时相同。挑取单菌落进行培养，提取质粒后进行双酶切鉴定，酶切体系为：10×HBuffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，质粒DNA5μL，加无菌去离子水至总体积20μL。37℃酶切2h后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现与Slug启动子大小相符的条带，则表明重组质粒T-pSlug构建成功。将鉴定正确的重组质粒送测序公司测序验证。将Slug启动子与RFP/YFP/BFP基因片段连接，构建pSlug-RFP/YFP/BFP载体。用BamHI和HindIII双酶切重组质粒T-pSlug和含有RFP/YFP/BFP基因的载体，酶切后回收目的片段并进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选并鉴定阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定和测序验证，确保pSlug-RFP/YFP/BFP载体构建正确。最后，将pSlug-RFP/YFP/BFP载体与慢病毒骨架质粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE连接，构建慢病毒表达质粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP。酶切、连接、转化及筛选鉴定步骤与构建Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP时相同。经过一系列的酶切鉴定和测序验证，成功构建出慢病毒表达质粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP。3.3慢病毒的包装与滴度测定3.3.1慢病毒包装流程将构建好的慢病毒表达质粒（Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP和Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP）与包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。在转染前，需对293T细胞进行复苏操作。从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻晃动使其快速融化。将融化后的细胞悬液转移至含有适量完全培养基（DMEM培养基，添加10%胎牛血清、1%双抗）的离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。用新鲜的完全培养基重悬细胞，将其接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时，进行传代操作。吸去培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，以去除残留的培养基和杂质。加入适量的0.25%胰蛋白酶消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中孵育1-2min，在显微镜下观察，当细胞开始变圆并脱离瓶壁时，立即加入含有血清的完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。用新鲜的完全培养基重悬细胞，并按照合适的比例（如1:3或1:4）将细胞接种到新的培养瓶中，补充适量的培养基，放回培养箱继续培养。在转染当天，对细胞进行计数。取适量的细胞悬液，与等体积的台盼蓝染液混合，充分混匀后，取一滴混合液滴加到血细胞计数板上，在显微镜下计数。活细胞不会被台盼蓝染色，呈现透明状，而死细胞会被染成蓝色。根据计数结果，调整细胞密度，将细胞接种于6孔板中，每孔加入适量的细胞悬液，使细胞贴壁后所占面积达到孔底面积的70%-80%，将6孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育4-6h，待细胞贴壁后进行转染。转染时，首先制备质粒与转染试剂的混合物。在无菌EP管中，加入适量的无血清Opti-MEM培养基，然后分别加入8μg慢病毒表达质粒、4μg包装质粒psPAX2和4μg包装质粒pMD2.G，轻轻混匀。在另一无菌EP管中，加入相同体积的无血清Opti-MEM培养基，再加入适量的转染试剂（如Lipofectamine2000），轻轻混匀，室温静置5min。将转染试剂稀释液逐滴加入到质粒稀释液中，边滴加边轻轻混匀，室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合物。将转染复合物加入到6孔板中，轻轻晃动6孔板，使复合物均匀分布，将6孔板放回培养箱继续培养。转染6-8h后，吸去6孔板中的培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，以去除未结合的转染复合物。加入适量的新鲜完全培养基，继续培养。在培养过程中，密切观察细胞状态，确保细胞生长良好。培养48-72h后，收集含有慢病毒的细胞上清液，用于后续的慢病毒收集、纯化和滴度测定。同时，可对细胞进行冻存。吸去培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞2-3次，加入适量的0.25%胰蛋白酶消化液，消化细胞。当细胞变圆并脱离瓶壁时，加入含有血清的完全培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。用冻存液（90%胎牛血清+10%DMSO）重悬细胞，将细胞悬液分装至冻存管中，每管1-2mL。将冻存管放入程序降温盒中，先置于-80℃冰箱中过夜，然后转移至液氮罐中长期保存。3.3.2慢病毒的收集、纯化与滴度测定在转染48-72h后，收集含有慢病毒的细胞上清液。将细胞培养板从培养箱中取出，小心吸取上清液，转移至无菌离心管中。为了去除细胞碎片和杂质，将收集的上清液以3000r/min离心10min，取上清。然后使用0.45μm的滤膜对上清液进行过滤，进一步去除可能存在的细胞碎片和微生物。将过滤后的上清液进行超速离心纯化。将上清液分装到超速离心管中，注意平衡，确保两两对应离心管的重量相差不超过0.01g。将离心管放入超速离心机中，在4℃、30000r/min的条件下离心2h。离心结束后，小心取出离心管，可观察到离心管底部一侧壁上有白色的病毒沉淀。在生物安全柜中，打开离心管，用移液器小心吸掉上清，注意不要吸到病毒沉淀。每管加入40-100μL的PBS缓冲液，将病毒沉淀轻轻吹散重悬，使病毒充分溶解在PBS中。根据实验需要，将病毒重悬液分装到无菌EP管中，保存于-80℃冰箱备用。采用荧光计数法测定慢病毒滴度。将携带荧光报告基因（如GFP）的慢病毒感染靶细胞（如293T细胞）。在感染前，将293T细胞接种于24孔板中，每孔加入适量的细胞悬液，使细胞贴壁后所占面积达到孔底面积的50%-60%，将24孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育过夜。次日，取出24孔板，吸去旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞1-2次。将不同稀释度（如10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵）的慢病毒液加入到24孔板中，每孔加入适量的病毒液，同时设置未感染病毒的细胞作为阴性对照。将24孔板放回培养箱继续培养。感染48-72h后，使用流式细胞仪检测感染细胞中荧光阳性细胞的比例。吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次。加入适量的胰蛋白酶消化液，消化细胞。当细胞变圆并脱离孔壁时，加入含有血清的完全培养基终止消化。将细胞悬液转移至流式管中，1000r/min离心5min，弃去上清。用PBS缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至合适范围，进行流式细胞仪检测。通过流式细胞仪分析，统计不同稀释度下荧光阳性细胞的比例。根据荧光阳性细胞的比例和病毒稀释度，计算慢病毒的滴度。计算公式为：慢病毒滴度（TU/mL）=荧光阳性细胞数/接种细胞数×病毒稀释倍数×病毒液体积（mL）。例如，在10⁻³稀释度下，接种1×10⁵个细胞，检测到荧光阳性细胞数为500个，加入的病毒液体积为0.1mL，则慢病毒滴度=500/1×10⁵×10³×10=5×10⁷TU/mL。3.4模型构建结果验证3.4.1载体构建的鉴定对构建的慢病毒载体进行酶切鉴定，以验证其结构的正确性。取适量构建好的慢病毒表达质粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP和Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP，分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。对于Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP，使用EcoRI和HindIII进行双酶切；对于Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP，使用BamHI和HindIII进行双酶切。酶切反应体系为：10×HBuffer2μL，相应的限制性内切酶各1μL，质粒DNA5μL，加无菌去离子水至总体积20μL。37℃酶切2h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。在凝胶成像系统下观察，若Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP经EcoRI和HindIII双酶切后，在凝胶上出现与E-cadherin启动子和RFP/YFP/BFP基因片段大小相符的条带，则表明酶切成功，且载体构建正确。同理，若Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP经BamHI和HindIII双酶切后，出现与Slug启动子和RFP/YFP/BFP基因片段大小相符的条带，也表明载体构建成功。通过酶切鉴定，可以初步判断载体的结构是否正确，排除构建过程中可能出现的错误，如目的基因未正确插入、载体自连等问题。除了酶切鉴定，还进行了PCR鉴定。以构建的慢病毒载体为模板，分别使用针对E-cadherin启动子和Slug启动子的特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：5×PrimeSTARMaxBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）8μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，模板DNA1μL，加无菌去离子水至总体积50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃（针对E-cadherin启动子引物）或56℃（针对Slug启动子引物）退火30s，72℃延伸相应时间（根据目的片段大小确定，E-cadherin启动子片段延伸2min，Slug启动子片段延伸1.5min），共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增结束后，取5μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。若在凝胶上出现与预期大小相符的特异性条带，表明载体中含有正确的E-cadherin启动子或Slug启动子序列，进一步验证了载体构建的正确性。PCR鉴定可以快速、灵敏地检测载体中目的基因的存在，为载体的质量提供了有力的证据。为了确保载体中插入的E-cadherin启动子和Slug启动子序列的准确性，将酶切和PCR鉴定正确的载体送测序公司进行测序。测序结果与GenBank中登录的人E-cadherin基因（NM_004360）和Slug基因（NM_003068）序列进行比对。比对结果显示，构建的慢病毒载体中E-cadherin启动子和Slug启动子序列与已知序列完全一致，没有出现碱基突变、缺失或插入等情况。测序验证为载体构建的准确性提供了最直接、最可靠的证据，保证了后续实验的顺利进行。3.4.2慢病毒感染肝癌细胞的效果检测将制备好的慢病毒（Lv-pE-cad-YFP和Lv-pSlug-YFP，这里以YFP荧光蛋白为例）感染肝癌细胞PLC/PRF/5，以检测慢病毒的感染效果。在感染前，将PLC/PRF/5细胞接种于6孔板中，每孔加入适量的细胞悬液，使细胞贴壁后所占面积达到孔底面积的50%-60%，将6孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育过夜。次日，取出6孔板，吸去旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞1-2次。将不同感染复数（MOI）的慢病毒液加入到6孔板中，同时设置未感染病毒的细胞作为阴性对照。每孔加入适量的病毒液后，再加入适量的新鲜完全培养基，将6孔板放回培养箱继续培养。感染48-72h后，使用流式细胞仪检测感染细胞中YFP的表达情况。吸去6孔板中的培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次。加入适量的胰蛋白酶消化液，消化细胞。当细胞变圆并脱离孔壁时，加入含有血清的完全培养基终止消化。将细胞悬液转移至流式管中，1000r/min离心5min，弃去上清。用PBS缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至合适范围，进行流式细胞仪检测。通过流式细胞仪分析，统计不同MOI下YFP阳性细胞的比例。结果显示，随着MOI的增加，YFP阳性细胞的比例逐渐升高。当MOI为10时，YFP阳性细胞的比例达到约70%，表明慢病毒能够有效地感染肝癌细胞PLC/PRF/5，且感染效率较高。为了进一步验证慢病毒感染肝癌细胞的效果，对感染后的细胞进行分选，分选出YFP阴性和阳性的细胞。将流式细胞仪分选得到的YFP阴性和阳性的PLC/PRF/5细胞分别接种于新的培养皿中，加入适量的完全培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。培养一段时间后，使用qRT-PCR和Westernblotting检测E-cadherin和Slug基因及蛋白的表达水平。对于qRT-PCR检测，首先提取细胞总RNA。取适量的YFP阴性和阳性的PLC/PRF/5细胞，按照Trizol试剂说明书的步骤，加入适量Trizol试剂裂解细胞，充分混匀后，室温静置5min。随后加入氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。4℃、12000r/min离心15min，取上层无色水相转移至新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃、12000r/min离心10min，可见管底出现白色絮状沉淀，即为总RNA。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀两次，每次4℃、7500r/min离心5min。最后将沉淀晾干，加入适量的无RNase水溶解总RNA。使用核酸蛋白分析仪检测RNA的浓度和纯度，确保RNA质量良好。以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书的步骤进行反转录反应，将RNA反转录为cDNA。反转录反应体系为：5×PrimeScriptRTMasterMix2μL，RNA模板适量（根据RNA浓度调整，一般为500ng-1μg），加无RNase水至总体积10μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s。反转录结束后，得到的cDNA可用于后续的qRT-PCR反应。qRT-PCR反应体系为：2×SYBR®PremixExTaqⅡ（TliRNaseHPlus）10μL，上、下游引物各1.0μL（10μmol/L），cDNA模板2.0μL，补dH₂O至总体积20μL。反应条件为：95℃30s，之后95℃5s，55℃30s，72℃30s，进行40个循环，最后72℃延伸1min。以GAPDH为内参照，结果分析采用2-△△Ct法计算。检测结果显示，YFP阳性的PLC/PRF/5细胞中E-cadherin基因的表达水平明显低于YFP阴性细胞，而Slug基因的表达水平则明显高于YFP阴性细胞。这表明慢病毒感染后，E-cadherin启动子和Slug启动子驱动的荧光报告基因成功表达，且与EMT过程中E-cadherin和Slug的表达变化趋势一致，进一步验证了慢病毒感染肝癌细胞的有效性。对于Westernblotting检测，首先提取细胞总蛋白。取适量的YFP阴性和阳性的PLC/PRF/5细胞，用预冷的PBS缓冲液清洗细胞2-3次，按每5×10⁵个细胞加150μLRIPA裂解液冰上裂解，并用移液器吹打混匀，冰上裂解30min。裂解完毕后，4℃、12000r/min离心20min，将上清转移至另一新的EP管中备用。取10μL蛋白上清利用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，将剩余样品加5×上样缓冲液，混匀后100℃煮沸10min，于-20℃保存待用。将定量后的蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据蛋白分子量大小选择合适的分离胶浓度，将蛋白样品加入到凝胶加样孔中，同时加入蛋白Marker作为分子量标准。在浓缩胶中以80V的电压进行电泳，待蛋白样品进入分离胶后，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，按照三明治模型将蛋白转印至PVDF膜上，转膜电压为100V，时间为120min。转膜完毕后，将PVDF膜在50g/L脱脂奶粉中摇床封闭1h，以防止非特异性结合。随后将稀释好的一抗（E-cadherin抗体、Slug抗体和内参β-actin抗体）加到载好的PVDF膜上，4℃低温孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min。然后将稀释好的二抗加到膜上，室温孵育1h。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min。最后使用化学发光液进行显影，在凝胶成像系统下观察并拍照。Westernblotting检测结果显示，YFP阳性的PLC/PRF/5细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于YFP阴性细胞，而Slug蛋白的表达水平则明显高于YFP阴性细胞。这与qRT-PCR的检测结果一致，进一步证实了慢病毒感染肝癌细胞后，能够准确反映EMT过程中E-cadherin和Slug蛋白的表达变化，表明成功构建了肝癌细胞多荧光EMT指示模型。四、肝癌细胞多荧光EMT指示模型的功能初探4.1模型对EMT过程的动态监测4.1.1TGF-β诱导EMT实验设计将构建成功的肝癌细胞多荧光EMT指示模型用于TGF-β诱导的EMT实验。实验共设置三组，分别为对照组、TGF-β低浓度处理组和TGF-β高浓度处理组。对照组加入等体积的PBS缓冲液，不进行TGF-β处理；TGF-β低浓度处理组加入终浓度为5ng/mL的TGF-β1（购自PeproTech公司）；TGF-β高浓度处理组加入终浓度为20ng/mL的TGF-β1。实验选用6孔板进行细胞培养，每孔接种适量的肝癌细胞多荧光EMT指示模型细胞，使其在接种后能够均匀分布并贴壁生长。待细胞生长至对数生长期，达到约70%-80%的融合度时，进行TGF-β处理。在处理前，先吸去6孔板中的旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，以去除残留的培养基和杂质。然后按照分组分别加入相应的处理液，每组设置3个复孔，以确保实验结果的可靠性。在TGF-β处理后的0h、24h、48h、72h这几个时间点进行样本收集。对于每个时间点，取出相应的6孔板，吸去孔中的培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞2-3次。收集细胞用于后续的荧光表达检测和EMT相关标志物的分析。在收集细胞时，使用胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，用于荧光显微镜观察和流式细胞仪检测。同时，取一部分细胞用于提取RNA和蛋白质，用于后续的qRT-PCR和Westernblotting检测，以分析EMT相关标志物的表达变化。4.1.2荧光表达变化与EMT进程的关联分析在TGF-β处理后，通过荧光显微镜观察和流式细胞仪检测，分析细胞荧光表达的变化情况，并探讨其与EMT进程中上皮和间质标志物表达变化的对应关系。在荧光显微镜下，对照组细胞在整个观察过程中，E-cadherin启动子驱动的荧光蛋白（如YFP）呈现较强的荧光信号，主要分布在细胞之间的连接处，表明E-cadherin表达正常，细胞保持上皮细胞的形态和连接特性。而Slug启动子驱动的荧光蛋白（如RFP）荧光信号较弱，几乎不可见，说明Slug的表达水平较低。在TGF-β低浓度处理组，24h时，部分细胞的E-cadherin启动子驱动的荧光强度开始减弱，细胞间的荧光连接变得不连续；同时，Slug启动子驱动的荧光蛋白开始出现微弱的荧光信号。随着处理时间延长至48h和72h，E-cadherin启动子驱动的荧光进一步减弱，细胞形态逐渐从上皮样向间质样转变，细胞变得更加细长，失去极性；而Slug启动子驱动的荧光强度逐渐增强。在TGF-β高浓度处理组，变化更为明显。24h时，大部分细胞的E-cadherin启动子驱动的荧光明显减弱，细胞间连接几乎消失；Slug启动子驱动的荧光信号显著增强。48h和72h时，细胞完全呈现间质样形态，E-cadherin启动子驱动的荧光几乎消失，Slug启动子驱动的荧光达到较强水平。通过流式细胞仪对不同处理组和时间点的细胞进行荧光定量分析，结果与荧光显微镜观察一致。对照组细胞中，E-cadherin启动子驱动的荧光阳性细胞比例始终较高，而Slug启动子驱动的荧光阳性细胞比例很低。在TGF-β低浓度处理组，随着处理时间的增加，E-cadherin启动子驱动的荧光阳性细胞比例逐渐下降，从0h时的约80%下降到72h时的约30%；而Slug启动子驱动的荧光阳性细胞比例逐渐上升，从0h时的几乎为0上升到72h时的约50%。在TGF-β高浓度处理组，E-cadherin启动子驱动的荧光阳性细胞比例下降更为迅速，72h时仅为约10%；Slug启动子驱动的荧光阳性细胞比例在72h时达到约70%。将荧光表达变化与qRT-PCR和Westernblotting检测的EMT相关标志物表达变化进行对比分析。qRT-PCR结果显示，对照组细胞中E-cadherin的mRNA表达水平较高，而Slug的mRNA表达水平较低。在TGF-β处理组，随着处理时间的增加和TGF-β浓度的升高，E-cadherin的mRNA表达水平逐渐降低，Slug的mRNA表达水平逐渐升高。Westernblotting检测结果也表明，对照组细胞中E-cadherin蛋白表达丰富，而Slug蛋白表达较少。在TGF-β处理组，E-cadherin蛋白表达逐渐减少，Slug蛋白表达逐渐增多。这些结果表明，肝癌细胞多荧光EMT指示模型的荧光表达变化与EMT进程中上皮和间质标志物的表达变化具有良好的对应关系。随着EMT进程的推进，E-cadherin表达下降，其启动子驱动的荧光减弱；Slug表达上升，其启动子驱动的荧光增强。该模型能够准确地反映肝癌细胞EMT过程中相关标志物的表达变化，实现对EMT过程的动态监测。四、肝癌细胞多荧光EMT指示模型的功能初探4.2基于模型的细胞迁移能力研究4.2.1Transwell迁移实验操作利用Transwell小室开展细胞迁移实验，以探究肝癌细胞多荧光EMT指示模型中荧光阳性和阴性细胞的迁移能力。实验前，准备好24孔板及配套的Transwell小室，其聚碳酸酯膜孔径为8μm。将Transwell小室小心放置于24孔板中，向上室加入100μL无血清培养基，向下室加入600μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，以此形成趋化因子梯度，模拟体内细胞迁移的微环境。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1-2h，使培养基达到平衡状态。对分选得到的荧光阳性和阴性的肝癌细胞进行处理。先用无菌PBS清洗细胞2-3次，去除细胞表面残留的培养基和杂质。接着使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，当在显微镜下观察到细胞开始变圆并脱离培养瓶壁时，立即加入含有血清的完全培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁵/mL。向Transwell小室的上室加入100μL细胞悬液，确保细胞均匀分布在上室中，同时避免产生气泡，以免影响细胞迁移。将24孔板放回37℃、5%CO₂培养箱中孵育24h，使细胞有足够的时间迁移。在孵育过程中，细胞会受到下室中趋化因子的吸引，通过Transwell小室的聚碳酸酯膜上的小孔从上室迁移至下室。孵育结束后，取出Transwell小室。用无菌PBS轻轻清洗上室3次，以去除未迁移的细胞。将Transwell小室浸泡在4%多聚甲醛固定液中，室温固定15min，使迁移到下室膜表面的细胞固定。固定完毕后，用PBS清洗3次，每次5min。随后，用0.1%结晶紫染液对下室膜表面的细胞进行染色，室温染色20min，使细胞着色，便于观察和计数。染色结束后，用PBS再次清洗3次，以去除多余的染液。用棉签轻轻擦去上室膜表面未迁移的细胞，注意操作要轻柔，避免损伤下室膜表面已迁移的细胞。将Transwell小室置于显微镜下，在200倍视野下随机选取5个视野，计数迁移到下室膜表面的细胞数量。每个实验设置3个复孔，以确保实验结果的准确性和可靠性。4.2.2实验结果分析：荧光阳性与阴性细胞的迁移差异通过对Transwell迁移实验结果进行分析，发现荧光阳性细胞的迁移能力明显强于荧光阴性细胞。在显微镜下观察，荧光阳性细胞迁移到下室膜表面的数量较多，细胞分布较为密集；而荧光阴性细胞迁移到下室膜表面的数量较少，细胞分布相对稀疏。对5个视野中迁移细胞数量进行统计，计算平均值。结果显示，荧光阳性细胞的迁移细胞数平均值为（125.6±10.5）个，而荧光阴性细胞的迁移细胞数平均值仅为（35.2±5.8）个。通过统计学分析，二者差异具有显著性（P<0.01）。这一差异与EMT密切相关。在肝癌细胞多荧光EMT指示模型中，荧光阳性细胞是由E-cadherin启动子驱动的荧光蛋白表达减弱和Slug启动子驱动的荧光蛋白表达增强所标记，表明这些细胞发生了EMT。在EMT过程中，细胞发生了一系列生物学特性的改变。上皮细胞标志性蛋白E-cadherin表达下调，导致细胞间黏附力下降，细胞连接被破坏，使得细胞更容易从上皮组织中脱离出来。同时，间质细胞标志物如N-cadherin、Vimentin等表达上调，细胞形态由上皮样转变为梭形或成纤维细胞样，细胞骨架发生重构，获得了更强的迁移和侵袭能力。这些变化使得荧光阳性细胞能够更有效地响应趋化因子的吸引，穿过Transwell小室的聚碳酸酯膜，迁移到下室。相比之下，荧光阴性细胞未发生明显的EMT，细胞间仍保持着较强的黏附力，细胞形态和结构相对稳定，迁移能力较弱。这一实验结果进一步验证了EMT在肝癌细胞迁移中的重要作用，也表明肝癌细胞多荧光EMT指示模型能够有效地用于研究EMT与细胞迁移能力之间的关系，为深入探究肝癌转移机制提供了有力的实验依据。4.3模型在肝癌EMT机制研究中的潜在应用4.3.1探索信号通路对EMT的调控作用在肝癌研究领域，深入探究信号通路对上皮-间质转化（EMT）的调控作用至关重要，而本研究构建的肝癌细胞多荧光EMT指示模型为此提供了有力工具。以转化生长因子-β（TGF-β）信号通路为例，其被公认为是诱导EMT的关键通路之一。利用该模型进行研究时，可设置不同的实验组。在实验组中，向肝癌细胞多荧光EMT指示模型细胞中加入不同浓