2025年生物技术人员考试题(附答案)

2025年生物技术人员考试题(附答案)一、单项选择题（每题2分，共20分）1.以下关于CRISPR-Cas13系统的描述，错误的是：A.主要靶向RNA分子B.可用于RNA病毒的快速检测C.相比Cas9更易引发DNA脱靶效应D.可实现转录后水平的基因表达调控答案：C（解析：Cas13靶向RNA，脱靶效应主要发生在RNA层面，DNA脱靶风险低于Cas9）2.合成生物学中，“生物砖（BioBrick）”的核心设计原则是：A.标准化连接接口B.增强基因表达强度C.提高宿主兼容性D.简化代谢途径答案：A（解析：生物砖通过定义统一的酶切位点（如EcoRI、XbaI、SpeI、PstI）实现模块间的标准化组装）3.流式细胞术检测中，FITC荧光素的激发光和发射光波长组合最可能是：A.488nm激发，525nm发射B.561nm激发，580nm发射C.640nm激发，670nm发射D.355nm激发，450nm发射答案：A（解析：FITC（异硫氰酸荧光素）典型激发波长488nm，发射波长525nm左右）4.关于碱基编辑技术（BaseEditing），以下表述正确的是：A.需要诱导DNA双链断裂（DSB）B.只能实现C→T或A→G的单碱基转换C.依赖Cas9的HNH结构域活性D.脱靶效应主要发生在RNA水平答案：B（解析：当前主流碱基编辑器（CBE和ABE）分别介导C→T和A→G转换，无需DSB，Cas9采用切口酶（nCas9）或失活形式（dCas9））5.工业酶制剂生产中，提高重组酶热稳定性的常用策略是：A.增加二硫键数目B.降低蛋白质分子量C.减少α-螺旋比例D.提高酸性氨基酸含量答案：A（解析：二硫键可稳定蛋白质空间结构，是提高热稳定性的经典手段）6.单细胞RNA测序（scRNA-seq）中，常用的细胞捕获技术不包括：A.微流控芯片（如10xGenomics）B.激光捕获显微切割（LCM）C.荧光激活细胞分选（FACS）D.原位杂交（ISH）答案：D（解析：原位杂交是检测RNA定位的技术，不用于单细胞捕获）7.重组蛋白在大肠杆菌中表达时，形成包涵体的主要原因是：A.宿主蛋白酶活性过高B.目标蛋白折叠速率快于伴侣蛋白辅助速率C.培养基渗透压过低D.启动子强度不足答案：B（解析：异源蛋白快速合成时，未及时折叠的中间体相互聚集形成包涵体）8.以下哪项是CAR-T细胞治疗实体瘤的主要挑战？A.细胞因子释放综合征（CRS）B.肿瘤微环境抑制（TME）C.靶抗原脱靶效应D.制备周期过长答案：B（解析：实体瘤的免疫抑制微环境（如Treg细胞、PD-L1高表达、基质屏障）是CAR-T疗效的主要障碍）9.代谢工程中，“动态调控”策略的核心目的是：A.提高目标产物合成速率B.平衡细胞生长与产物合成C.降低副产物生成量D.增强宿主对有毒产物的耐受性答案：B（解析：通过条件响应型调控元件（如代谢物传感器），在对数期优先保证细胞生长，稳定期启动产物合成）10.关于蛋白质定向进化技术，以下描述错误的是：A.易错PCR用于引入随机突变B.DNA改组（DNAshuffling）可重组不同突变体C.高通量筛选是关键步骤D.适用于所有蛋白质功能优化答案：D（解析：膜蛋白、多亚基蛋白等因表达或检测困难，定向进化技术应用受限）二、填空题（每空1分，共20分）1.基因编辑工具中，______（系统）可实现RNA的定点切割或修饰，其效应蛋白通常具有______结构域。答案：CRISPR-Cas13；HEPN（高等真核生物和原核生物核苷酸结合）2.合成生物学中，常用的模式微生物包括大肠杆菌、______和______（列举两种）。答案：酿酒酵母；谷氨酸棒杆菌（或蓝细菌、枯草芽孢杆菌等）3.单克隆抗体制备的关键技术是______，其原理是通过______使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。答案：细胞融合（或杂交瘤技术）；聚乙二醇（PEG）或电融合4.蛋白质结晶的常用方法包括______、______和气相扩散法（需列举两种非气相扩散法）。答案：坐滴法；悬滴法（或批量法、微透析法）5.病毒载体中，______（载体）因能整合至宿主基因组且免疫原性较低，常用于基因治疗；______（载体）因容量大（约35kb）且不整合，适合短期表达。答案：慢病毒；腺相关病毒（AAV）（注：此处需注意，AAV实际容量约4.7kb，正确应为腺病毒载体容量大，可能题目存在笔误，根据最新知识调整答案为：慢病毒；腺病毒）6.实时荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreen法通过检测______的荧光信号定量，TaqMan探针法通过检测______的荧光信号定量。答案：双链DNA结合；探针水解后释放7.干细胞分类中，______干细胞具有发育成完整个体的能力，______干细胞可分化为三胚层所有细胞类型。答案：全能；多能（或胚胎干细胞）8.酶工程中，固定化酶的常用方法包括______、______和包埋法（需列举两种化学方法）。答案：共价结合法；交联法9.生物信息学中，______数据库主要存储蛋白质三维结构信息，______数据库用于基因表达谱分析（需写全称）。答案：蛋白质数据库（ProteinDataBank,PDB）；基因表达综合数据库（GeneExpressionOmnibus,GEO）10.工业发酵中，溶氧（DO）控制的常用策略包括调节______和______（需列举两种操作参数）。答案：搅拌转速；通气量（或罐压、补料速率）三、简答题（每题8分，共40分）1.简述CRISPR-Cas9、BaseEditor（BE）和PrimeEditor（PE）在作用机制上的主要区别。答案：CRISPR-Cas9：通过sgRNA引导Cas9蛋白至靶DNA位点，利用Cas9的HNH和RuvC结构域切割形成双链断裂（DSB），依赖非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）修复，实现基因敲除或定点插入/删除。BaseEditor（BE）：融合失活或切口酶形式的Cas9（dCas9/nCas9）与脱氨酶（如APOBEC1或TadA），无需DSB，直接催化靶位点单碱基（C→T或A→G）脱氨基，通过DNA修复实现单碱基转换。PrimeEditor（PE）：利用nCas9与逆转录酶（RT）融合蛋白，结合pegRNA（包含引物结合位点和编辑模板），通过nCas9切割DNA单链形成切口，以pegRNA为模板进行逆转录，实现任意单碱基替换、小片段插入或删除，无需DSB和供体DNA。2.说明CAR-T细胞的结构组成及各部分功能。答案：CAR（嵌合抗原受体）结构主要包括：（1）胞外区：含单链抗体（scFv），负责特异性识别肿瘤细胞表面抗原（如CD19）。（2）铰链区：连接胞外区与跨膜区，维持空间构象，常用CD8α或IgG的铰链结构。（3）跨膜区：锚定CAR至T细胞膜，多采用CD3ζ、CD8α或CD28的跨膜结构域。（4）胞内区（信号传导区）：-第一信号域：CD3ζ，传递T细胞激活的基础信号；-共刺激信号域：如CD28、4-1BB（CD137）或OX40，增强T细胞增殖、存活和效应功能。完整CAR-T通过scFv识别抗原后，通过胞内区传递双重信号，激活T细胞对肿瘤的杀伤作用。3.设计一个利用代谢工程改造大肠杆菌生产β-胡萝卜素的方案，需说明关键步骤及理论依据。答案：关键步骤及依据：（1）异源合成途径引入：克隆来源于欧文氏菌（Erwiniauredovora）的crtE（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶）、crtB（八氢番茄红素合酶）、crtI（八氢番茄红素脱氢酶）基因，构建至大肠杆菌表达载体（如pET系列），使大肠杆菌从自身甲羟戊酸（MVA）或2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径的FPP（法尼基焦磷酸）合成GGPP（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸），进而生成八氢番茄红素并转化为β-胡萝卜素。（2）前体供应强化：过表达MEP途径关键酶（如dxs、ispA），或引入MVA途径（如来自酿酒酵母的tHMG1、mvaS、mvaE），提高IPP（异戊烯焦磷酸）和DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）的供应，增加GGPP合成量。（3）反馈抑制解除：通过定点突变或替换启动子，消除途径中关键酶（如DXS）的反馈抑制（如受硫胺素抑制）。（4）产物积累优化：敲除大肠杆菌内源性类胡萝卜素降解酶（如不存在则无需），或引入脂滴形成相关基因（如perilipin）促进β-胡萝卜素在胞内储存，减少毒性积累。（5）动态调控：使用代谢物响应型启动子（如基于β-胡萝卜素的传感器），在对数期优先合成前体，稳定期启动crt基因表达，平衡生长与合成。4.比较一代测序（Sanger）、二代测序（NGS）和三代测序（TGS）的技术特点及应用场景。答案：（1）一代测序（Sanger）：-技术特点：基于双脱氧核苷酸（ddNTP）链终止法，通过毛细管电泳分离不同长度片段，读取序列；读长1000-1500bp，准确率>99.99%，通量低（单次反应1个样本）。-应用场景：小片段测序（如基因克隆验证、突变检测）、SNP分型、低通量精准测序。（2）二代测序（NGS）：-技术特点：基于边合成边测序（如Illumina的桥式PCR+荧光标记dNTP）或焦磷酸测序（如454），通过大规模平行测序实现高通量（单runbillionsofreads）；读长50-300bp（Illumina）或400-700bp（454已淘汰），准确率99%-99.9%。-应用场景：全基因组测序（WGS）、转录组测序（RNA-seq）、外显子测序（WES）、ChIP-seq等大规模项目。（3）三代测序（TGS）：-技术特点：单分子实时测序（如PacBio的SMRT，基于零模波导孔检测DNA聚合酶合成时的荧光）或纳米孔测序（如OxfordNanopore，基于核酸通过纳米孔时的电流变化）；读长>10kb（PacBio）或理论无上限（Nanopore），准确率90%-99.9%（需纠错）。-应用场景：复杂基因组组装（如高度重复区域）、长读长RNA测序（全长转录本）、表观遗传修饰（如甲基化）检测。5.简述基因治疗中腺相关病毒（AAV）载体的优缺点及优化策略。答案：优点：-低免疫原性：野生型AAV感染后不易引发强烈免疫反应；-广泛宿主范围：不同血清型（如AAV2、AAV9）可靶向特定组织（如肝脏、神经）；-长期表达：以episome形式存在（非整合），可实现持续数月至数年的基因表达；-安全性高：无致病性，天然病毒无毒性基因。缺点：-包装容量小（~4.7kb），无法装载大基因（如DMD基因>100kb）；-体内存在预存抗体：部分人群因自然感染携带抗AAV抗体，影响转导效率；-随机整合风险：虽主要以episome存在，但仍有极低概率整合至宿主基因组（如AAVS1位点）；-生产难度高：需辅助病毒（如腺病毒）或辅助质粒，纯化工艺复杂。优化策略：-载体工程：开发杂合血清型（如AAV-DJ）或靶向肽修饰的AAV，提高组织特异性；-大容量载体：构建双AAV载体（splitAAV），通过同源重组或剪接恢复大基因；-抗体中和规避：使用免疫抑制疗法（如糖皮质激素）或筛选低免疫原性的新型血清型；-生产工艺改进：采用无辅助病毒的HEK293细胞包装系统，结合亲和层析提高纯化效率；-整合控制：通过基因编辑技术敲除AAV的Rep基因，降低整合风险。四、案例分析题（每题15分，共30分）案例1：某公司计划开发一款基于CRISPR的新冠病毒快速检测试剂盒，要求检测时间<30分钟，灵敏度达1拷贝/μL，特异性区分Omicron变异株与其他冠状病毒（如流感病毒、普通冠状病毒）。请设计技术方案并说明关键验证步骤。答案：技术方案设计：（1）靶标选择：选取Omicron变异株的特异性突变区域（如刺突蛋白S基因的R346T、K444T等高频突变位点），同时选择新冠病毒保守区（如N基因）作为内参，避免假阴性。（2）检测系统构建：采用CRISPR-Cas12或Cas13系统（优先Cas13，因靶向RNA无需反转录）：-对于RNA检测：样本经简单裂解后，加入逆转录酶（若选Cas12需先RT）或直接利用Cas13的RNA切割活性；-设计crRNA：针对Omicron特异性区域设计向导RNA，确保与其他冠状病毒的同源序列无交叉；-报告系统：使用荧光标记的ssDNA/RNA探针（如FAM-BHQ），Cas蛋白切割靶标后激活反式切割活性，降解探针释放荧光。（3）反应体系优化：-等温扩增：结合RPA（重组酶聚合酶扩增）或LAMP（环介导等温扩增），在37-42℃下快速扩增靶RNA（15-20分钟），提高灵敏度至1拷贝/μL；-时间控制：将扩增与CRISPR检测合并为单管反应，总时间<30分钟；-抗干扰设计：添加RNase抑制剂防止RNA降解，优化Mg²+浓度和缓冲液pH以提高酶活性。关键验证步骤：（1）特异性验证：-检测Omicron各亚分支（BA.2、BA.5等）及其他冠状病毒（如SARS-CoV-1、MERS、流感病毒）、人类基因组DNA，确认无交叉反应；-通过错配实验（crRNA与非靶标序列存在1-3个碱基错配时无荧光信号）验证特异性。（2）灵敏度验证：-用梯度稀释的Omicron假病毒（10⁰-10⁶拷贝/μL）进行检测，确定最低检测限（LOD）是否达1拷贝/μL；-计算临床样本的阳性符合率（需检测至少100例已知阳性样本）。（3）稳定性验证：-测试不同保存条件（4℃、室温、37℃加速老化）下试剂盒的性能，确保有效期内活性稳定；-分析批间差（不同批次试剂盒检测同一样本的CV值<15%）。（4）临床验证：-在真实临床样本（咽拭子、鼻拭子）中测试，对比RT-PCR结果，计算准确率、灵敏度、特异度（要求均>95%）；-评估样本处理流程（如裂解液是否兼容不同样本类型）的鲁棒性。案例2：某实验室在利用CHO细胞生产重组人促红细胞生成素（EPO）时，发现产物糖基化异常（唾液酸含量低，半乳糖暴露），导致体内半衰期缩短。请分析可能原因并提出解决方案。答案：可能原因分析：（1）细胞株问题：CHO细胞内源性糖基转移酶（如唾液酸转移酶ST3Gal3、ST6Gal1）表达不足，或关键酶（如半乳糖转移酶GalT）活性过高，导致半乳糖未被充分唾液酸化。（2）培养条件影响：-培养基成分：葡萄糖浓度过高可能导致代谢副产物（乳酸、氨）积累，抑制糖基转移酶活性；-培养环境：pH波动（<6.8或>7.4）、溶氧不足（DO<30%）影响细胞代谢和糖基化相关基因表达；-培养时间：收获时间过早（对数期），细胞未完成充分的糖基化修饰。（3）基因工程操作：EPO基因插入位点影响宿主细胞糖基化相关基因的表达（如插入至沉默染色质区域）；或载体设计中使用的启动子（如CMV）导致EPO过表达，超出细胞糖基化能力。（4）其他因素：细胞传代次数过高导致表型漂移，或病毒污染（如支原体）干扰细胞代谢。解决方案：（1）细胞株优化：-过表达唾液酸转移酶基因（如ST3Gal3）：通过慢病毒转染或CRISPR激活（CRISPRa）技术，提高细胞内ST3Gal3的表达水平；-敲低半乳糖转移酶（GalT）：使用siRNA或CRISPR敲除GalT基因，减少半乳糖的过度添加；-筛选高糖基化能力的CHO细胞亚株：通过流式细胞术分选高表达唾液酸转移酶的细胞克隆。（2）培养条件优化：-培养基调整：添加唾液酸前体（如N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac）或UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸等糖核苷酸前体，提高底物供应；-控制代谢副产物：采用灌流培养或补料分批培养（Fed-batch），维持葡萄糖浓度在2-5g/L，及时移除乳酸（<20mM）和氨（<5mM）；-优化环境参数：维持pH7.0-7.2，DO40%-60%，温度33-37℃（降低温度可延长培养时间，促进糖基化）。（3）工艺改进：-延长培养时间：在平台期（细胞活力开始下降前）收获，确保糖基化修饰完成；-共表达分子伴侣：如内质网分子伴侣（Calnexin）或高尔基体蛋白（如MannII），协助EPO的正确折叠和运输；-使用化学分子：添加丁酸钠（0.5-1mM）抑制组蛋白去乙酰化酶，激活糖基转移酶基因表达。（4）检测与监控：-建立糖基化质量控制标准：通过HPLC（高效液相色谱）或毛细管电泳（CE）检测唾液酸含量（目标：每分子EPO含8-14个唾液酸）；-实时监控关键酶活性：通过qPCR检测ST3Gal3、GalT等基因的mRNA水平，或通过Westernblot检测蛋白表达量；-支原体检测：定期使用PCR或荧光染色法检测，确保无支原体污染（支原体可降解唾液酸）。五、论述题（20分）论述合成生物学在“双碳”（碳达峰、碳中和）目标中的应用潜力及面临的挑战。答案：合成生物学通过设计和构建人工生物系统，可在碳捕获、转化和利用环节发挥关键作用，是实现“双碳”目标的重要技术支撑。其应用潜力主要体现在以下方面：一、应用潜力1.二氧化碳固定与转化-人工固碳途径开发：自然光合作用的固碳效率（约1-2%）较低，合成生物学可设计更高效的固碳途径。例如，德国马普所构建的“CETCH循环”（化学-酶促固碳循环），通过17种酶将CO₂转化为甲酸，效率是卡尔文循环的5倍；美国JBEI开发的“ReductiveGlycinePathway”可在厌氧条件下固碳，适用于工业发酵环境。-微生物合成高附加值产品：利用蓝细菌、大肠杆菌或酵母等工程菌，将CO₂转化为生物燃料（如乙醇、丁醇）、生物塑料（如聚羟基脂肪酸酯PHA）、化学品（如丙酮、异戊二烯）。例如，LanzaTech公司的工程产甲烷菌可将工业尾气（含CO、CO₂）转化为乙醇，已实现万吨级量产。2.生物质资源化利用-木质纤维素高效降解：通过合成生物学改造纤维素酶（如内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶）的分泌系统，或构建“纤维小体”（Cellulosome）人工复合体，提高秸秆、木屑等农林废弃物的降解效率，转化为可发酵糖（如葡萄糖），进一步生产生物燃料或生物基化学品。-油脂微生物合成：工程微藻（如莱茵衣藻）或酵母（如解脂耶氏酵母）可将废弃油脂、糖类转化为三酰甘油（TAG），用于生物柴油生产，减少对化石燃料的依赖。3.甲烷等温室气体减排-甲烷氧化菌改造：甲烷（CH₄）的温室效应是CO₂的28倍，合成生物学可增强甲烷氧化菌（如Methylococcuscapsulatus）的甲烷单加氧酶（MMO）活性，将CH₄转化为甲醇或其他含氧化合物；或构建“甲烷-CO₂”转化链，减少农业（如反刍动物肠道）和能源行业的甲烷排放。-氧化亚氮（N₂O）分解：通过工程菌表达N₂O还原