DB41-T 1727-2018 饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法

DB41/T17272018饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中氨基酸测定的高效液相色谱法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料中氨基酸含量的测定。本标准测定氨基酸的种类包括：天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样方法GB/T20195动物饲料试样的制备3原理饲料样品经酸水解或氧化水解后，氨基酸被游离出来，经衍生化反应具有紫外或荧光吸收的衍生物，通过高效液相色谱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的规定。4.1乙腈：色谱纯4.2甲醇：色谱纯4.3乙酸铵：色谱纯4.4三氟乙酸：色谱纯4.5苯异硫氰酸酯（PITC）：纯度≥99%4.6三乙胺：纯度≥99%4.7氨基酸标准品：纯度≥98%4.86mol/L盐酸溶液：量取500mL盐酸，用水稀释至1000mL4.90.1mol/L盐酸溶液：量取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL4.10衍生化试剂：取苯异硫氰酸酯25μL、三乙胺25μL，加入乙腈950μL，混匀，现用现配4.110.1mol/L乙酸铵溶液（pH=6.5）：称取7.71g乙酸铵，溶于900mL水中，用乙酸调节pH至6.5，用水定容至1000mL4.12流动相A：称取0.77g乙酸铵，溶于900mL水中，加入0.5mL三氟乙酸，用水定容至1000mL，经0.45μm滤膜过滤，超声脱气15min4.13流动相B：量取900mL乙腈，加入0.5mL三氟乙酸，用水定容至1000mL，经0.45μm滤膜过滤，超声脱气15min4.14氨基酸标准储备溶液（1mg/mL）：分别精确称取各种氨基酸标准品10mg，置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，摇匀，4℃保存，有效期3个月4.15氨基酸标准工作溶液：分别吸取氨基酸标准储备溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的系列标准工作溶液，4℃保存，有效期1个月5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或荧光检测器5.2色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）或性能相当者5.3分析天平：感量0.1mg5.4恒温水浴锅：控温精度±1℃5.5离心机：转速≥4000r/min5.6涡旋混合器5.7氮吹仪5.8超声波清洗器5.9真空干燥箱5.10微量进样器：10μL、50μL、100μL5.110.45μm微孔滤膜5.1210mL具塞刻度试管5.1310mL、25mL、50mL容量瓶5.141mL、5mL、10mL移液管6试样的制备与保存按照GB/T14699.1规定的方法采集有代表性的饲料样品，按照GB/T20195规定的方法制备试样。试样应通过0.5mm筛，混合均匀后装入密封容器中，于4℃条件下保存，备用。7分析步骤7.1试样处理7.1.1酸水解法（适用于除色氨酸、胱氨酸外的氨基酸测定）精确称取0.2g~0.5g试样（精确至0.0001g）于10mL具塞刻度试管中，加入6mol/L盐酸溶液10mL，充氮气30s后立即密封，置于110℃±1℃恒温水浴锅中水解22h~24h。取出冷却至室温，将水解液转移至50mL容量瓶中，用少量水洗涤试管数次，合并洗涤液，用水定容至刻度，摇匀。准确吸取1.0mL水解液于10mL具塞刻度试管中，在40℃水浴中用氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸溶液1.0mL溶解残渣，待衍生化。7.1.2氧化水解法（适用于含硫氨基酸的测定）精确称取0.2g~0.5g试样（精确至0.0001g）于10mL具塞刻度试管中，加入过甲酸溶液2mL，室温下氧化16h。加入48%氢溴酸溶液0.3mL终止氧化反应，在40℃水浴中用氮气吹干。加入6mol/L盐酸溶液10mL，充氮气30s后立即密封，置于110℃±1℃恒温水浴锅中水解22h~24h。取出冷却至室温，将水解液转移至50mL容量瓶中，用少量水洗涤试管数次，合并洗涤液，用水定容至刻度，摇匀。准确吸取1.0mL水解液于10mL具塞刻度试管中，在40℃水浴中用氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸溶液1.0mL溶解残渣，待衍生化。7.2衍生化反应取7.1.1或7.1.2处理后的试样溶液1.0mL于10mL具塞刻度试管中，加入衍生化试剂1.0mL，涡旋混合30s，室温下反应20min。在40℃水浴中用氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸溶液1.0mL溶解残渣，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液供高效液相色谱分析。7.3色谱条件7.3.1流动相：流动相A与流动相B梯度洗脱，梯度程序见表1。表1梯度洗脱程序|时间/min|流动相A/%|流动相B/%||||||0|95|5||5|90|10||15|80|20||25|70|30||35|60|40||45|50|50||50|95|5||60|95|5|7.3.2流速：1.0mL/min7.3.3柱温：30℃7.3.4进样量：10μL7.3.5检测波长：254nm（紫外检测器）或激发波长250nm、发射波长395nm（荧光检测器）7.4测定分别吸取氨基酸标准工作溶液和试样溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按7.3规定的色谱条件进行测定，记录色谱图。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，从标准曲线上查出试样溶液中氨基酸的浓度。8结果计算试样中氨基酸的含量以质量分数ω计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算：ω=(c×V×n)/(m×1000)(1)式中：c——从标准曲线上查出的试样溶液中氨基酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；n——稀释倍数；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。10检出限和定量限本方法中各种氨基酸的检出限为5mg/kg，定量限为15mg/kg。11质量控制每批样品测定时应同时进行空白试验和加标回收试验。空白试验应无干扰峰，加标回收率应在85%~115%之间。12