《药学基础化学实验（第2版）》分析化学课件 分析化学-柱色谱基本操作实验-药分新稿

柱色谱基本操作实验药物分析教研室实验目的1掌握柱色谱法的原理及一般操作技术2熟悉柱色谱法中干、湿法装柱及上样的注意事项3了解色谱法的种类一、色谱法简介1903年俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法:将植物色素的提取液从顶端注入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组份互相分离形成不同颜色的谱带。茨维特一、色谱法简介里夏德·库恩（RichardKuhn）保罗·卡勒（PaulKarrer）1937年诺贝尔化学奖1938年诺贝尔化学奖维生素结构一、色谱法简介

色谱法亦称色层法，层析法等，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一，还可定量分析。

色谱法分类固定相、流动相的物理状态操作形式分离原理液—固色谱法气—固色谱法气—液色谱法液—液色谱法柱色谱法（columnchromatography）薄层色谱法（TLC）纸色谱法（paperchromatography）气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法排阻色谱操作形式柱色谱法（columnchromatography）二、柱色谱法原理混合物吸附剂(固定相)洗脱剂(流动相)柱色谱分离示意图：二、柱色谱法原理吸附剂的性质：均匀、表面积大、不反应、吸附能力不同试样化合物的结构：化合物的吸附性和它们的极性成正比洗脱剂的极性：溶解度适中、不反应、易获取回收影响分离效果主要因素：吸附色谱三要素硅胶柱1、硅胶(silica

gel)它的吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键的羟基。它们可以与试样和洗脱剂分子中的极性基团或不饱和键产生氢键缔合而起吸附作用。三、吸附色谱三要素—吸附剂活性羟基在硅胶表面较小的孔穴中较多，水与硅胶表面的羟基形成水合硅醇，使其失去活性。因此需加热除去水分。最佳活化条件为105℃—110℃，加热30分钟。如果将硅胶在200℃以上长时间加热后，则硅原子上结合的羟基发生脱水而形成硅氧烷型，这种不含羟基的硅氧烷型的硅胶吸附性极差。200℃加热硅胶，通常视为酸性吸附剂。一般用来分离一些酸性和中性有机物。如有机酸、萜类、氨基酸、甾类和一些甙类。但是，对某些酸性弱的试样，在色层中有分解的危险。如在硅胶中拌入15%左右的硝酸银，这种加硝酸银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性，因此，常用它分离一些不饱和化合物。此外，对于碱性物质可发生不可逆吸附。因此，对一些碱性物质在使用硅胶进行层析时，有必要进行预实验。三、吸附色谱三要素—吸附剂2、氧化铝(alumina

)氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的活性分为五级。三、吸附色谱三要素—吸附剂活性氧化铝含水量（%）硅胶含水量（%）I00II35III815IV1025V1538三、吸附色谱三要素—吸附剂酸性氧化铝(pH5~4)，适用于分离酸性化合物和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨基酸类等。中性氧化铝(pH=7.

5)，适用与分离生物碱、挥发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。

碱性氧化铝(pH9~10)

，适用于碱性，如生物碱和中性化合物的分离。

三、吸附色谱三要素—吸附剂聚酰胺的吸附性是由子分了中含有许多酰胺基，在水溶液中能与酚羟基发生氢键缔合而吸附，因此，聚酰胺是分离酚性物质和黄酮、蒽醌及其苷类最有效的吸附剂。要从聚酰胺柱上洗脱被吸附的酚性物质，是用一种溶剂分子顶替被吸附的酚性化合物，溶剂这种解吸性质的强弱，一般是按下列顺序增强：水、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、稀氨水或稀氢氧化钠水液、甲酰胺。3、聚酰胺（polyamide）三、吸附色谱三要素—吸附剂洗脱过程:流动相与被分离分子竞争占据吸附剂表局面活性中心的过程。三、吸附色谱三要素—洗脱剂

2.溶剂(洗脱剂)在层析中，如采用氧化铝或硅胶为吸附剂，则所用的溶剂应先从极性低的(对吸附剂亲和力小的)开始，以后逐渐增加极性大的溶剂。常用的流动相按其极性增强顺序排列：石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸。三、吸附色谱三要素—洗脱剂在实际操作中，使用混合溶剂作为洗脱剂，一般要比单独使用一种溶剂为洗脱剂的时候多些，因为混合溶剂往往能起到单一溶剂所不能起到的微妙分离效果，但在使用时要绝对避免用两个极端洗脱力的混合剂，这是因为洗脱力强的溶剂发生溶剂化效应，从而降低混合溶剂的作用，达不到理想的分离效果。三、吸附色谱三要素—洗脱剂一般选择极性大的溶剂与极性小的溶剂进行不同比例混合作为洗脱剂层析时，如被分离的物质含有羧基或氨基等极性强的官能团，容易发生色带扩散和拖尾现象，为了防止这种现象达到有效分离：在分离含有羧基的试样时，可加少量的醋酸；

在分离含有氨基试样时，可加少量的氨水、吡啶、二已胺等溶剂，以控制它们的解离，消除拖尾，提高层析效能。

三、吸附色谱三要素—洗脱剂

3.试样成分的性质在给定的条件下，各个成分的分离情况，与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下列顺序增加：三、吸附色谱三要素—试样Cl-,Br,I<C=C<-OCH3<-CO2R<C=O,-CHO<-SH-<-NH2<-OH<-CO2H四、仪器与试剂1.仪器：玻璃色谱（层析）柱、锥形瓶、烧杯、量筒、玻璃漏斗、玻璃棒、胶头滴管、蒸发皿、药勺。2.试剂：柱层析硅胶（200-300目）、石油醚。3.样品：油溶叶黄素（叶黄素、β-胡萝卜素、植物油）。五、实验方法装柱加样洗脱收集鉴定干法装柱湿法装柱洗脱溶剂组分荧光薄层鉴定干法加样湿法加样

柱色谱操作：五、实验方法1.装柱：（1）干法装柱：称取约25ml柱层析硅胶通过漏斗形成细流状缓慢加入到柱内，同时不断轻轻敲打色谱柱身使硅胶填压紧实、硅胶表面平整。色谱柱下端出口连上真空泵抽气，关闭活塞，并从上端沿内壁缓慢加入石油醚，打开活塞待硅胶刚好全部润湿，立即关闭活塞。抜掉抽气管，并从色谱柱上端沿内壁缓慢加入石油醚，并保留约3cm高液面。（2）湿法装柱：称取约25ml柱层析硅胶置于烧杯中，加入约100ml石油醚浸润，待溶胀后并搅拌均匀。接着通过漏斗倒入色谱柱中，再用少量石油醚洗涤烧杯，将残留的硅胶全部转移至色谱柱中。转移完毕，打开下端活塞，不断轻轻敲打色谱柱身，加压使硅胶紧实，并保留约3cm高液面。

五、实验方法2.加样：（1）干法加样：取一胶头滴管尖端量的样品，用少量约1ml石油醚溶剂使其全部溶解后，滴加在蒸发皿中3ml体积的柱层析硅胶上，再用药勺搅拌均匀，残留的样品也要溶解滴加在硅胶上拌匀。待样品搅拌挥尽溶剂，成粉状后，通过漏斗均匀地加入到色谱柱中，再用少量石油醚洗涤蒸发皿上的残留样品并重复操作全部转移至色谱柱中，尽量使样品带平整。接着打开活塞使溶剂液面边缘降至硅胶表面后，沿内壁缓慢加一滴管石油醚清洗内壁，待溶剂液面边缘降至硅胶表面后，关闭活塞，缓慢沿内壁向其中加入石油醚约15cm高，打开活塞进行样品化学成分的分离。五、实验方法（2）湿法加样：取一胶头滴管尖端量的样品，用少量约1ml石油醚溶剂使其全部溶解后，沿色谱柱内壁缓慢加入，注意不要破坏硅胶表面的平整。打开活塞使样品溶剂液面边缘降至硅胶表面，关闭活塞，再用少量的石油醚洗涤残留样品，将残留的样品按上述操作步骤全部转移至色谱柱中，再打开活塞使溶剂液边缘面降至硅胶表面。继续沿内壁缓慢加一滴管石油醚清洗内壁，待溶剂液面边缘降至硅胶表面后，关闭活塞，缓慢沿内壁向其中加入石油醚约15cm高，打开活塞进行样品化学成分的分离。五、实验方法实验结果拍照附图：拌样结果照片干法装柱结果照片干法上样结果照片分离结果照片结果：分离结果现象。干法装柱干法上样注意事项装柱时应该注意吸附剂均匀，不能有气泡，裂缝，溶剂不能流干，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等