基于疏水性抗肿瘤药物载体的可注射超分子水凝胶：构建、性能与应用探索

基于疏水性抗肿瘤药物载体的可注射超分子水凝胶：构建、性能与应用探索一、引言1.1研究背景与意义癌症作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病之一，一直是医学和生命科学领域的研究重点。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，死亡病例996万例。化学药物治疗作为癌症综合治疗的重要手段之一，在癌症治疗中发挥着关键作用。然而，许多临床上常用的抗肿瘤药物，如紫杉醇、多柔比星等，都具有疏水性。这些疏水性抗肿瘤药物在水中的溶解度极低，这极大地限制了它们在体内的有效递送和治疗效果。传统的疏水性抗肿瘤药物剂型，如静脉注射的有机溶剂溶液，存在诸多弊端。一方面，有机溶剂本身可能对人体产生毒副作用，例如紫杉醇注射液中的聚氧乙烯蓖麻油会引起过敏反应、神经毒性和心血管毒性等不良反应。另一方面，这些药物在体内的分布缺乏靶向性，在到达肿瘤组织之前，容易被正常组织摄取，导致药物在肿瘤部位的浓度较低，而在正常组织中的浓度相对较高，从而增加了药物的全身毒性，降低了治疗指数。为了解决疏水性抗肿瘤药物的递送难题，科研人员开发了多种药物载体，如脂质体、纳米粒、胶束等。这些载体能够通过物理包埋或化学结合的方式将疏水性药物包裹其中，提高药物的溶解度和稳定性，改善药物的药代动力学和药效学性质。然而，这些传统载体仍然存在一些局限性，如载药量有限、药物释放难以精确控制、体内循环时间较短以及缺乏对肿瘤微环境的响应性等。超分子水凝胶作为一种新型的软材料，近年来在药物递送领域展现出了巨大的应用潜力。超分子水凝胶是由小分子或聚合物通过非共价相互作用（如氢键、疏水相互作用、π-π堆积、主客体相互作用等）自组装形成的三维网络结构，其内部充满大量的水分子。与传统的共价交联水凝胶相比，超分子水凝胶具有独特的优势：一是其非共价相互作用赋予了水凝胶良好的自愈合性能和刺激响应性，能够对外界环境的变化（如温度、pH值、离子强度、光照等）做出快速响应，实现药物的可控释放；二是超分子水凝胶的制备过程相对温和，不需要使用有毒的交联剂，有利于保持药物的活性；三是超分子水凝胶具有良好的生物相容性和可降解性，能够在体内逐渐降解并被代谢排出体外，减少了对人体的潜在危害。可注射超分子水凝胶则进一步拓展了超分子水凝胶的应用范围。可注射超分子水凝胶在注射前为流动性良好的溶液状态，能够通过注射器轻松地注射到体内的特定部位，如肿瘤组织、手术切除部位等。在注射后，由于受到体内环境因素（如体温、pH值、离子强度等）的影响，水凝胶能够迅速发生溶胶-凝胶转变，在原位形成具有一定强度和稳定性的水凝胶网络结构。这种原位凝胶化的特性使得可注射超分子水凝胶能够紧密贴合肿瘤组织，减少药物的泄漏和扩散，提高药物在肿瘤部位的局部浓度，实现对肿瘤的精准治疗。同时，可注射超分子水凝胶还可以作为药物储库，持续缓慢地释放药物，延长药物的作用时间，减少给药次数，提高患者的顺应性。构建基于疏水性抗肿瘤药物载体的可注射超分子水凝胶具有重要的科学意义和临床应用价值。从科学意义上讲，深入研究超分子水凝胶的自组装机制、结构与性能关系以及药物负载和释放行为，有助于丰富和完善超分子化学和生物材料学的理论体系，为开发新型智能药物递送系统提供新的思路和方法。从临床应用价值来看，这种可注射超分子水凝胶有望成为一种高效、安全、靶向性强的疏水性抗肿瘤药物递送平台，显著提高疏水性抗肿瘤药物的治疗效果，降低药物的毒副作用，为难治性癌症的治疗提供新的策略和手段，具有广阔的市场前景和社会效益。1.2研究目的与内容本研究旨在构建一种基于疏水性抗肿瘤药物载体的可注射超分子水凝胶，通过对其自组装机制、结构性能、药物负载与释放行为以及体内外抗肿瘤效果的深入研究，开发出一种高效、安全、具有良好应用前景的疏水性抗肿瘤药物递送系统。具体研究内容如下：可注射超分子水凝胶的构建：筛选合适的小分子或聚合物作为构筑基元，通过合理设计分子结构，利用非共价相互作用（如氢键、疏水相互作用、π-π堆积、主客体相互作用等），制备具有良好生物相容性、可注射性和原位凝胶化性能的超分子水凝胶。例如，选择具有特定官能团的环糊精衍生物与两亲性聚合物进行主客体相互作用自组装，或者设计含有多个氢键位点的小分子多肽通过氢键驱动自组装形成水凝胶网络结构。水凝胶的结构与性能研究：运用多种先进的分析技术，如核磁共振光谱（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和流变学测试等，对超分子水凝胶的化学结构、微观形貌、网络结构以及力学性能、流变性能、自愈合性能、刺激响应性等进行全面表征和深入分析。探索非共价相互作用的类型、强度以及分子结构与水凝胶性能之间的内在关系，为水凝胶的性能优化提供理论依据。疏水性抗肿瘤药物的负载与释放行为研究：将疏水性抗肿瘤药物（如紫杉醇、多柔比星等）负载到超分子水凝胶中，研究药物的负载方式（如物理包埋、化学结合等）、载药量、包封率以及药物在不同环境条件下（如不同pH值、温度、酶浓度等）的释放行为。建立药物释放模型，分析药物释放的机制，为实现药物的可控释放提供技术支持。例如，利用水凝胶对肿瘤微环境中特定刺激（如低pH值、高浓度谷胱甘肽等）的响应性，设计智能释药系统，使药物在肿瘤部位精准释放，提高药物的治疗效果。水凝胶载药系统的体内外抗肿瘤效果评价：在体外，采用多种肿瘤细胞系（如乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2等）进行细胞实验，研究水凝胶载药系统对肿瘤细胞的摄取、细胞毒性、增殖抑制、凋亡诱导等作用，初步评估其抗肿瘤活性。在体内，建立合适的肿瘤动物模型（如小鼠皮下移植瘤模型、原位肿瘤模型等），通过瘤内注射、静脉注射等给药方式，考察水凝胶载药系统在体内的药代动力学、组织分布、肿瘤靶向性以及抗肿瘤疗效。同时，通过血液学指标、组织病理学检查等方法，评价水凝胶载药系统的安全性和生物相容性，为其临床应用提供实验依据。1.3国内外研究现状近年来，基于疏水性抗肿瘤药物载体构建可注射超分子水凝胶成为了生物医学材料领域的研究热点，国内外众多科研团队围绕这一方向展开了深入研究，取得了一系列具有重要价值的成果。在国外，斯坦福大学EricAppel助理教授等人开发了一种脂质体纳米复合水凝胶（LNHs），这种水凝胶是可注射型的，能够实现蛋白质药物的可编程释放。他们利用脂肪族十二烷基侧链修饰高分子量的纤维素聚合物形成具有后插入功能的HPMC-C12，随后将脂质体纳米颗粒和HPMC-C12混合，疏水的烷基侧链插入脂质膜，实现多价和动态聚合物-颗粒交联相互作用，最终形成超分子水凝胶。该水凝胶具有剪切稀化和自愈合能力，可作为可注射药物库应用于体内，并且通过调节蛋白质和脂质体之间的静电相互作用，实现了对蛋白质药物释放行为的精确控制，有望在体外和体内精确协调生物线索。国内在这一领域也取得了显著进展。例如，上海药物所李亚平团队、上海科技大学张鹏程团队联合设计构建了一种包载细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂阿贝西利（Abe）的可注射超分子多肽水凝胶Abe-NF(g)，该水凝胶由吲哚胺2,3-双加氧酶-1（IDO-1）抑制剂NLG919-多肽偶联物自组装形成的纳米纤维自发缠绕而成，用于三阴性乳腺癌（TNBC）局部新辅助免疫治疗。原位注射后，Abe-NF(g)能够在肿瘤组织中滞留至少7天，作为药物储库持续释放Abe和NLG919，改善肿瘤与主要器官之间的药物分布比例。足够的Abe肿瘤暴露量能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（ICD），促进树突状细胞成熟，诱导巨噬细胞的经典活化，并促进CTL分泌白介素2，激活机体的抗肿瘤免疫应答。然而，目前基于疏水性抗肿瘤药物载体构建的可注射超分子水凝胶仍存在一些问题亟待解决。一方面，部分水凝胶的力学性能较差，在体内易受到外力作用而发生变形或破裂，影响药物的持续稳定释放和治疗效果；另一方面，水凝胶的载药效率和药物释放的精准调控还需要进一步优化。例如，一些水凝胶虽然能够负载疏水性药物，但载药量较低，无法满足临床治疗的需求；在药物释放方面，虽然已有一些智能响应性水凝胶被报道，但对于复杂的体内环境，其响应的特异性和准确性仍有待提高。此外，水凝胶在体内的长期安全性和生物相容性评价还不够完善，缺乏大规模的临床研究数据支持，这也在一定程度上限制了其临床应用。二、超分子水凝胶与疏水性抗肿瘤药物概述2.1超分子水凝胶的基本概念与特性2.1.1超分子水凝胶的定义与结构特点超分子水凝胶是一类通过非共价相互作用自组装形成的三维网络结构，其中充满大量的水分子。与传统的共价交联水凝胶不同，超分子水凝胶的形成主要依赖于分子间的非共价相互作用，如氢键、疏水相互作用、π-π堆积、主客体相互作用等。这些非共价相互作用赋予了超分子水凝胶独特的结构特点和性能。从结构上看，超分子水凝胶的基本构筑基元可以是小分子、聚合物或生物大分子。这些构筑基元通过非共价相互作用相互连接，形成纳米级的纤维、管状或片状结构，然后这些纳米结构进一步相互缠绕、交联，最终形成宏观的三维网络结构。例如，在一些基于小分子的超分子水凝胶中，小分子通过氢键作用形成线性或环状的低聚物，这些低聚物再通过疏水相互作用和π-π堆积进一步组装成纳米纤维，纳米纤维之间相互交织形成水凝胶网络。而在基于聚合物的超分子水凝胶中，聚合物链上的特定基团（如疏水基团、氢键位点等）通过非共价相互作用与其他聚合物链或小分子发生相互作用，从而实现自组装形成水凝胶。超分子水凝胶的三维网络结构具有高度的动态性和可逆性。由于非共价相互作用的强度相对较弱，在外界条件（如温度、pH值、离子强度、光照等）发生变化时，这些相互作用可以发生解离和重新组合，使得水凝胶的网络结构能够相应地发生改变。这种动态可逆的结构特点赋予了超分子水凝胶一些独特的性能，如自愈合性能和刺激响应性。当超分子水凝胶受到外力破坏时，非共价相互作用会发生部分解离，但在去除外力后，这些相互作用可以重新形成，使水凝胶恢复其原有的结构和性能，表现出良好的自愈合能力。同时，超分子水凝胶能够对外界环境的刺激做出响应，如在特定的温度、pH值或离子强度条件下，水凝胶的溶胶-凝胶状态可以发生转变，或者其网络结构发生变化，从而实现对药物释放等过程的调控。2.1.2超分子水凝胶的制备方法与原理超分子水凝胶的制备方法多种多样，主要可以分为物理方法和化学方法两大类，每种方法都有其独特的原理和适用范围。物理方法：物理方法制备超分子水凝胶主要是利用分子间的非共价相互作用，在一定条件下使构筑基元自发地组装形成水凝胶网络。常见的物理方法包括冷却法、溶剂挥发法、超声法、搅拌法等。以冷却法为例，对于一些具有温度响应性的构筑基元，如某些两亲性分子或聚合物，在高温下它们能够溶解在水中形成均匀的溶液，但当温度降低时，分子间的疏水相互作用增强，促使它们发生自组装，形成水凝胶网络结构。溶剂挥发法则是通过缓慢挥发溶剂，使溶液中的构筑基元浓度逐渐增加，当达到一定浓度时，分子间的非共价相互作用促使它们聚集并形成水凝胶。超声法和搅拌法是通过施加外部机械力，促进构筑基元之间的相互作用，加速水凝胶的形成。这些物理方法制备过程相对简单、温和，不需要使用有毒的交联剂，有利于保持药物的活性和水凝胶的生物相容性。化学方法：化学方法制备超分子水凝胶主要是通过化学反应来实现构筑基元之间的交联，形成稳定的水凝胶网络。其中，点击化学是一种常用的化学制备方法，它利用一些高效、特异性的化学反应，如铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）、巯基-烯点击反应等，将含有特定官能团的构筑基元连接起来。例如，在CuAAC反应中，含有叠氮基团的分子与含有炔基的分子在铜催化剂的作用下能够快速、定量地发生反应，形成稳定的三唑环结构，从而实现分子间的交联。除了点击化学，还有一些其他的化学反应也可用于超分子水凝胶的制备，如利用二硫键的形成与断裂来实现分子间的交联与解交联。在氧化条件下，含有巯基的分子可以发生氧化反应，形成二硫键，从而将分子连接起来形成水凝胶网络；而在还原条件下，二硫键可以被还原断裂，使水凝胶网络发生解离。化学方法制备的超分子水凝胶通常具有较高的稳定性和力学强度，但在制备过程中可能需要使用一些化学试剂，需要注意其对水凝胶生物相容性和药物活性的影响。2.1.3超分子水凝胶作为药物载体的优势超分子水凝胶作为一种新型的药物载体，与传统的药物载体相比，具有诸多显著的优势，使其在药物递送领域展现出巨大的应用潜力。良好的生物相容性：超分子水凝胶的构筑基元通常具有良好的生物相容性，如天然的多糖、多肽、蛋白质等，或者经过修饰后具有生物相容性的合成分子。这些构筑基元通过非共价相互作用形成的水凝胶网络，在体内不会引起明显的免疫反应和毒性。例如，基于透明质酸的超分子水凝胶，透明质酸是一种广泛存在于生物体内的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，以其为构筑基元制备的超分子水凝胶能够在体内与组织和细胞良好地相互作用，减少对机体的不良影响。可调节性强：超分子水凝胶的性能可以通过多种方式进行调节，以满足不同药物递送的需求。一方面，可以通过改变构筑基元的分子结构和组成，调节水凝胶的物理化学性质，如力学性能、溶胀性能、降解性能等。例如，通过调整聚合物链的长度、侧链基团的种类和数量，可以改变水凝胶的交联密度和网络结构，从而调控其力学性能和溶胀性能。另一方面，超分子水凝胶的非共价相互作用使其对环境因素（如温度、pH值、离子强度、光照等）具有响应性，通过设计对特定环境因素敏感的水凝胶体系，可以实现药物的可控释放。比如，设计pH响应性的超分子水凝胶，在正常生理pH条件下，水凝胶结构稳定，药物释放缓慢；而在肿瘤微环境的酸性条件下，水凝胶的网络结构发生变化，加速药物的释放，实现对肿瘤组织的靶向给药。能控制药物释放：超分子水凝胶可以作为药物的储库，实现药物的持续、缓慢释放。药物可以通过物理包埋、化学结合或吸附等方式负载到水凝胶网络中。在体内，由于水凝胶的溶胀、降解以及与周围环境的相互作用，药物会逐渐从水凝胶中释放出来。通过调节水凝胶的结构和性能，可以精确控制药物的释放速率和释放时间。例如，增加水凝胶的交联密度可以减缓药物的释放速度，延长药物的作用时间；而引入特定的刺激响应性基团，则可以使药物在特定的刺激条件下快速释放，提高药物的治疗效果。此外，超分子水凝胶还可以实现多种药物的共负载和协同释放，为联合治疗提供了可能。2.2疏水性抗肿瘤药物的特点与挑战2.2.1常见疏水性抗肿瘤药物种类及作用机制疏水性抗肿瘤药物在癌症治疗领域占据重要地位，它们以独特的化学结构和作用机制，为对抗癌症提供了有力的武器。以下将详细介绍几种常见的疏水性抗肿瘤药物及其作用机制。紫杉醇（Paclitaxel）：紫杉醇是从红豆杉属植物树皮中提取得到的一种二萜类化合物，作为临床上广泛应用的经典疏水性抗肿瘤药物，它主要作用于细胞微管系统。微管是细胞骨架的重要组成部分，在细胞分裂过程中起着关键作用。紫杉醇能够特异性地与微管蛋白结合，促进微管蛋白二聚体的聚合，抑制微管的解聚，从而稳定微管结构。这种稳定作用导致细胞周期停滞在G2/M期，使癌细胞无法正常进行有丝分裂，最终诱导癌细胞凋亡。紫杉醇对多种癌症，如卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等，都具有显著的治疗效果，是这些癌症化疗方案中的重要组成部分。多柔比星（Doxorubicin）：多柔比星属于蒽环类抗生素，具有广谱的抗肿瘤活性。其作用机制较为复杂，主要通过嵌入DNA双链之间，形成药物-DNA复合物，干扰DNA的复制和转录过程。具体来说，多柔比星的蒽环结构能够插入DNA的碱基对之间，破坏DNA的正常双螺旋结构，阻碍DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用，从而抑制DNA的复制和RNA的转录，使癌细胞无法合成蛋白质和进行细胞分裂。此外，多柔比星还可以通过产生自由基，引发氧化应激反应，损伤癌细胞的细胞膜、蛋白质和DNA等生物大分子，进一步诱导癌细胞凋亡。多柔比星常用于治疗白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤。喜树碱（Camptothecin）：喜树碱是从喜树中分离得到的一种生物碱，其作用靶点是拓扑异构酶I。拓扑异构酶I在DNA的复制、转录和修复等过程中发挥着重要作用，它能够通过切割和重新连接DNA单链，调节DNA的拓扑结构。喜树碱能够与拓扑异构酶I-DNA复合物紧密结合，形成稳定的三元复合物，抑制拓扑异构酶I对DNA单链的切割和重新连接活性。当DNA复制叉遇到这种稳定的三元复合物时，会导致DNA双链断裂，激活细胞内的DNA损伤修复机制。如果DNA损伤无法得到有效修复，细胞就会启动凋亡程序，从而达到抑制癌细胞生长的目的。喜树碱及其衍生物在临床上主要用于治疗结直肠癌、胃癌、肺癌等多种实体瘤。2.2.2疏水性导致的药物递送难题疏水性抗肿瘤药物虽然在癌症治疗中具有重要作用，但其疏水性特性却给药物递送带来了诸多难题，严重影响了药物的治疗效果和临床应用。溶解度低：疏水性抗肿瘤药物在水中的溶解度极低，这使得它们难以直接制成水溶液剂型用于注射或口服给药。例如，紫杉醇在水中的溶解度仅为0.03μg/mL，多柔比星的溶解度也相对较低。低溶解度导致药物在制剂过程中容易出现沉淀、结晶等问题，难以保证药物的均匀分散和稳定存在。为了提高药物的溶解度，传统方法通常是使用有机溶剂或表面活性剂，但这些添加剂往往会带来毒副作用，如紫杉醇注射液中使用的聚氧乙烯蓖麻油会引起过敏反应、神经毒性和心血管毒性等，限制了药物的临床应用。稳定性差：由于疏水性药物与水分子之间的相互作用较弱，在水溶液中容易受到外界环境因素（如温度、pH值、光照等）的影响，导致药物的稳定性下降。药物可能会发生降解、氧化、水解等化学反应，从而降低药物的活性和疗效。例如，多柔比星在光照和高温条件下容易发生降解，导致其抗肿瘤活性降低。此外，疏水性药物在储存过程中也容易出现晶型转变、团聚等现象，进一步影响药物的稳定性和质量。生物利用度低：疏水性抗肿瘤药物的低溶解度和稳定性差，使得它们在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程受到阻碍，导致生物利用度较低。药物难以有效地穿过生物膜进入血液循环系统，并且在体内容易被快速清除，无法在肿瘤组织中达到有效的治疗浓度。例如，口服给药时，疏水性药物在胃肠道中的溶解和吸收过程受到限制，大部分药物可能未被吸收就被排出体外。静脉注射时，药物也容易被网状内皮系统（RES）摄取，导致药物在肿瘤部位的分布不足。生物利用度低不仅降低了药物的治疗效果，还可能需要增加药物剂量，从而进一步增加药物的毒副作用。缺乏靶向性：传统的疏水性抗肿瘤药物剂型在体内的分布缺乏靶向性，药物在到达肿瘤组织之前，容易被正常组织摄取，导致药物在肿瘤部位的浓度较低，而在正常组织中的浓度相对较高。这不仅降低了药物对肿瘤细胞的杀伤作用，还增加了药物对正常组织的毒副作用，影响患者的生活质量。例如，多柔比星在体内广泛分布于心脏、肝脏、肾脏等组织，容易引起心脏毒性、肝肾功能损害等不良反应。因此，如何提高疏水性抗肿瘤药物的靶向性，使其能够精准地作用于肿瘤组织，是药物递送领域亟待解决的关键问题之一。三、基于疏水性抗肿瘤药物载体的可注射超分子水凝胶构建3.1构建策略与设计思路3.1.1载体材料的选择与依据构建基于疏水性抗肿瘤药物载体的可注射超分子水凝胶，载体材料的选择至关重要，它直接影响水凝胶的性能以及药物的负载和释放效果。在众多可用于水凝胶构建的材料中，环糊精和多肽因其独特的性质成为理想的选择。环糊精（Cyclodextrin,CD）是一类由D-吡喃型葡萄糖单体通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状低聚糖，主要包括α、β和γ三种类型，分别由6、7和8个葡萄糖基构成。环糊精具有独特的内疏水外亲水的空腔结构，这种结构使其能够与多种疏水性药物分子形成包合物，增加药物的溶解度和稳定性。例如，β-环糊精的空腔尺寸适中，能够有效地包合许多疏水性抗肿瘤药物，如紫杉醇、多柔比星等。通过将药物分子包封在环糊精的空腔内，可以减少药物与水分子的接触，降低药物的水解和氧化程度，从而提高药物的稳定性。此外，环糊精及其衍生物具有良好的生物相容性和低毒性，在体内能够被缓慢代谢和排泄，不会对机体产生明显的毒副作用，这为其在药物递送领域的应用提供了安全保障。多肽作为另一类重要的载体材料，由氨基酸通过肽键连接而成，具有高度的生物相容性和可降解性。多肽的氨基酸序列和结构可以通过人工设计和合成进行精确调控，从而赋予多肽多种功能。在超分子水凝胶的构建中，多肽可以通过分子间的氢键、疏水相互作用、π-π堆积等非共价相互作用自组装形成纳米纤维、管状或片状结构，进而构建成三维水凝胶网络。例如，含有特定氨基酸序列的多肽可以通过氢键作用形成β-折叠结构，这些β-折叠结构进一步相互聚集和缠绕，形成稳定的水凝胶网络。多肽的可降解性使得水凝胶在体内能够逐渐分解，释放出负载的药物，避免了长期残留对机体的潜在危害。同时，多肽还可以通过修饰引入特定的功能基团，如靶向基团、刺激响应性基团等，实现对肿瘤组织的靶向递送和药物的可控释放。例如，将肿瘤靶向肽与多肽载体连接，可以使水凝胶载药系统特异性地富集在肿瘤组织中，提高药物的治疗效果；引入对肿瘤微环境敏感的刺激响应性基团，如对低pH值、高浓度谷胱甘肽等敏感的基团，可以使水凝胶在肿瘤微环境中发生结构变化，加速药物的释放，实现对肿瘤的精准治疗。环糊精和多肽与超分子结构具有良好的适配性。环糊精的主客体包合作用可以作为超分子相互作用的一种重要形式，参与水凝胶的构建。例如，环糊精可以与含有互补基团的聚合物或小分子发生主客体相互作用，形成超分子聚合物或超分子复合物，进而通过这些超分子结构的进一步组装形成水凝胶。多肽的非共价相互作用特性使其能够与其他分子或材料协同作用，构建复杂的超分子水凝胶体系。例如，多肽可以与环糊精结合，利用两者的优势，实现对药物的高效负载和精准释放。同时，多肽和环糊精还可以与其他纳米材料（如纳米粒子、纳米纤维等）复合，构建多功能的超分子水凝胶载药系统，拓展其在癌症治疗中的应用范围。3.1.2超分子相互作用在水凝胶构建中的应用超分子相互作用是构建可注射超分子水凝胶的关键，它决定了水凝胶的自组装过程、结构稳定性以及性能特点。在超分子水凝胶的构建中，氢键、疏水作用、π-π堆积、主客体相互作用等多种超分子相互作用发挥着重要作用。氢键是一种常见且重要的超分子相互作用，它在水凝胶的自组装过程中起着关键的驱动作用。氢键是由氢原子与电负性较大的原子（如氮、氧、氟等）之间形成的一种弱相互作用，但多个氢键的协同作用可以产生强大的结合力，促使分子间发生自组装。在基于多肽的超分子水凝胶中，多肽链上的酰胺基团（-CONH-）可以通过氢键相互作用形成β-折叠、α-螺旋等二级结构。这些二级结构进一步通过氢键相互连接和堆叠，形成纳米纤维状的聚集体，最终相互缠绕形成三维水凝胶网络。例如，含有重复氨基酸序列（如丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸）的多肽，通过酰胺基团之间的氢键作用，能够形成稳定的β-折叠结构，这些β-折叠结构在溶液中逐渐聚集和生长，形成纳米纤维，纳米纤维之间通过氢键进一步交联，形成具有一定强度和稳定性的水凝胶。氢键的动态可逆性赋予了水凝胶良好的自愈合性能。当水凝胶受到外力破坏时，氢键会发生部分断裂，但在去除外力后，氢键可以重新形成，使水凝胶恢复其原有的结构和性能。疏水作用也是超分子水凝胶构建中不可或缺的超分子相互作用。疏水作用是指非极性分子或基团在水溶液中为了减少与水分子的接触面积而相互聚集的趋势。在两亲性分子或聚合物构建的超分子水凝胶中，疏水作用起着关键的驱动自组装的作用。例如，含有疏水链段和亲水链段的两亲性聚合物，在水溶液中，疏水链段会相互聚集形成疏水核心，而亲水链段则伸向水相，形成胶束状结构。随着聚合物浓度的增加或外界条件的改变（如温度、pH值等），这些胶束会进一步相互聚集和融合，形成三维的水凝胶网络。在基于环糊精的超分子水凝胶中，环糊精与疏水性药物分子或其他疏水性客体分子之间的包合作用也涉及疏水作用。环糊精的疏水空腔为疏水性分子提供了一个相对稳定的环境，疏水性分子进入环糊精的空腔内，通过疏水作用与环糊精相互结合，形成包合物。这些包合物可以进一步参与水凝胶的构建，增强水凝胶的稳定性和载药能力。π-π堆积是指具有π电子云的平面分子或基团之间通过相互作用而发生的堆积现象。在含有芳香族基团的分子或聚合物构建的超分子水凝胶中，π-π堆积发挥着重要作用。例如，含有苯环、萘环等芳香族基团的多肽或小分子，通过π-π堆积作用，能够形成有序的超分子结构。这些超分子结构可以进一步组装形成纳米纤维、纳米管等形态，最终构建成三维水凝胶网络。π-π堆积作用不仅可以增强分子间的相互作用力，提高水凝胶的稳定性，还可以调节水凝胶的光学、电学等性能。例如，在一些具有荧光特性的超分子水凝胶中，π-π堆积作用可以影响荧光分子的聚集状态和荧光发射性能，从而实现对水凝胶荧光信号的调控，为水凝胶在生物成像和传感领域的应用提供了可能。主客体相互作用是超分子化学中一种重要的特异性相互作用，它基于主体分子（如环糊精、冠醚、杯芳烃等）与客体分子之间的特异性识别和结合。在超分子水凝胶的构建中，主客体相互作用可以用于精确控制水凝胶的自组装过程和结构。以环糊精为例，环糊精作为主体分子，能够与含有互补结构的客体分子（如金刚烷、二茂铁等）发生特异性的主客体相互作用。当将含有环糊精的聚合物与含有客体分子的小分子或聚合物混合时，环糊精与客体分子之间会发生主客体相互作用，形成超分子聚合物或超分子复合物。这些超分子结构可以通过进一步的交联或聚集，形成水凝胶网络。主客体相互作用的特异性和可逆性使得水凝胶具有良好的刺激响应性。例如，通过引入对特定刺激（如温度、pH值、离子强度等）敏感的主客体对，可以使水凝胶在外界刺激下发生主客体解离或结合，从而导致水凝胶的溶胶-凝胶转变或网络结构变化，实现对药物释放等过程的精确调控。3.2具体构建实例与方法3.2.1以α-环糊精与聚乙二醇-聚己内酯两亲性嵌段聚合物构建超分子水凝胶以α-环糊精与聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）两亲性嵌段聚合物构建超分子水凝胶的过程较为精细，需要严格控制各材料比例和反应条件，以确保获得性能优良的水凝胶。首先，准备材料。α-环糊精作为主体分子，其独特的环状结构为后续的主客体相互作用提供基础。PEG-PCL两亲性嵌段聚合物中，PEG段具有良好的亲水性，PCL段则具有疏水性，这种结构特点使其在水凝胶构建中发挥关键作用。将α-环糊精和PEG-PCL按照一定的摩尔比进行称量，一般α-环糊精与PEG-PCL的摩尔比为[X:Y]（具体比例根据实验优化确定，不同比例会影响水凝胶的性能，如交联密度、溶胀性能等）。将两者分别溶解于去离子水中，形成一定浓度的溶液，α-环糊精溶液浓度通常为[Z1]mg/mL，PEG-PCL溶液浓度为[Z2]mg/mL。在搅拌条件下，将PEG-PCL溶液缓慢滴加到α-环糊精溶液中，滴加速度控制在[V]mL/min，以保证分子间充分相互作用。滴加完毕后，继续搅拌反应[反应时间1]小时，使α-环糊精与PEG-PCL通过主客体相互作用形成聚准轮烷结构。此过程中，α-环糊精的疏水空腔与PEG-PCL的疏水PCL段发生特异性结合，形成稳定的主客体复合物。随着反应进行，聚准轮烷结构逐渐增多并相互缠绕，开始形成初步的网络结构。为进一步稳定水凝胶结构，向反应体系中加入适量的交联剂。常用的交联剂如戊二醛，戊二醛的添加量一般为PEG-PCL质量的[交联剂比例]%。在加入交联剂后，继续搅拌反应[反应时间2]小时。交联剂戊二醛中的醛基与PEG-PCL或α-环糊精上的羟基发生化学反应，形成共价键，从而将聚准轮烷结构交联起来，构建成三维的超分子水凝胶网络。反应结束后，将得到的水凝胶溶液置于透析袋中，在去离子水中透析[透析时间]天，以去除未反应的单体、交联剂和其他杂质。每天更换透析液3-4次，确保杂质充分去除。透析完成后，得到纯净的超分子水凝胶。负载紫杉醇时，在制备水凝胶的过程中，当PEG-PCL溶液滴加到α-环糊精溶液并搅拌反应一段时间后，将紫杉醇的有机溶液缓慢加入到反应体系中。紫杉醇的加入量根据所需载药量确定，一般为水凝胶总质量的[紫杉醇比例]%。继续搅拌反应[负载反应时间]小时，使紫杉醇充分被包埋在水凝胶网络中。紫杉醇分子由于其疏水性，会被包裹在PEG-PCL的疏水PCL段形成的疏水微区以及α-环糊精的疏水空腔内，从而实现药物的负载。负载完成后，按照上述方法进行交联、透析等步骤，得到负载紫杉醇的超分子水凝胶。通过这种方式制备的负载紫杉醇的超分子水凝胶，具有良好的药物包封率和稳定性，能够有效地将紫杉醇递送至肿瘤部位。3.2.2可注射超分子多肽水凝胶用于三阴性乳腺癌治疗的构建可注射超分子多肽水凝胶用于三阴性乳腺癌治疗的构建过程精妙复杂，各组分协同作用，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的策略。构建这种水凝胶的关键组分包括吲哚胺2,3-双加氧酶-1（IDO-1）抑制剂NLG919、β-折叠形成多肽（CGVVQQHKD）以及细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂阿贝西利（Abe）。首先，通过二硫键将NLG919与β-折叠形成多肽（CGVVQQHKD）中的半胱氨酸残基偶联。具体步骤为：将NLG919和β-折叠形成多肽（CGVVQQHKD）按照一定摩尔比（如[M:N]）溶解在含有适量二硫苏糖醇（DTT）的缓冲溶液中，DTT的作用是促进二硫键的形成。在一定温度（如37℃）下搅拌反应[偶联反应时间]小时，使NLG919与多肽成功偶联，构建成前药NLG-HKD。在水溶液中，NLG-HKD由于分子间的非共价相互作用，如氢键、疏水相互作用等，开始自组装形成纳米纤维。其自组装机制为：多肽部分通过氢键形成β-折叠结构，这些β-折叠结构相互聚集，而NLG919的疏水部分则相互靠近，形成纳米纤维的疏水核心，从而稳定纳米纤维结构。接着，将阿贝西利（Abe）加入到含有NLG-HKD纳米纤维的溶液中。Abe由于其疏水性，会被包载于NLG-HKD纳米纤维的疏水核心中。包载过程中，Abe与NLG-HKD纳米纤维之间通过疏水相互作用和范德华力等相互作用结合。包载了Abe的纳米纤维进一步相互缠绕，形成了超分子水凝胶Abe-NF(g)。在这个过程中，纳米纤维之间的缠绕是通过多种非共价相互作用实现的，如氢键、π-π堆积等，这些相互作用使得纳米纤维形成三维的网络结构，从而形成水凝胶。IDO-1抑制剂NLG919在水凝胶中起着关键的免疫调节作用。三阴性乳腺癌肿瘤微环境中存在免疫抑制现象，IDO-1的高表达会导致免疫抑制性代谢产物犬尿氨酸的产生增加，从而抑制T细胞的活性。NLG919能够抑制IDO-1的活性，减少犬尿氨酸的产生，打破肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强机体的抗肿瘤免疫应答。β-折叠形成多肽（CGVVQQHKD）不仅作为NLG919的载体，其自身形成的β-折叠结构和纳米纤维网络为水凝胶提供了稳定的框架。同时，多肽的生物相容性良好，有利于水凝胶在体内的应用。阿贝西利（Abe）作为细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂，能够抑制肿瘤细胞的增殖。它通过阻断细胞周期从G1期向S期的过渡，使肿瘤细胞停滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞的分裂和生长。在水凝胶中，Abe与NLG919协同作用，Abe诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（ICD），释放肿瘤相关抗原，激活机体的免疫细胞，而NLG919则改善肿瘤微环境的免疫抑制状态，两者共同促进细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的浸润和活化，增强对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用。四、可注射超分子水凝胶的性能研究4.1结构与形貌表征4.1.1X-射线衍射（XRD）分析X-射线衍射（XRD）分析是研究可注射超分子水凝胶晶体结构和分子排列的重要手段，其原理基于X射线与晶体的相互作用。当一束X射线照射到晶体上时，晶体中的原子会对X射线产生散射。由于晶体中原子呈周期性排列，这些散射波会发生干涉现象。根据布拉格定律，当满足条件2d\sin\theta=n\lambda时（其中n为整数，代表衍射级数；\lambda是入射X射线的波长；d是晶体中的晶面间距；\theta是X射线的入射角），散射波会发生相长干涉，在特定的角度\theta处产生衍射峰。通过测量衍射峰的角度和强度，就可以计算出晶面间距d，从而推断出晶体的原子排列和晶格参数等信息。对于可注射超分子水凝胶，XRD分析能够揭示其分子在三维空间中的排列方式，判断水凝胶中是否存在结晶区域以及结晶程度的高低。以[具体水凝胶体系]为例，对制备的超分子水凝胶进行XRD测试。在XRD图谱中，通常可以观察到一些特征衍射峰。若图谱中出现尖锐且强度较高的衍射峰，表明水凝胶中存在有序的晶体结构，这些峰对应的晶面间距d值可以反映分子间的排列距离和方式。例如，在[具体水凝胶体系]的XRD图谱中，在2\theta=[具体角度1]处出现了一个强衍射峰，通过布拉格定律计算得到对应的晶面间距d=[具体d值1]，这可能是由于水凝胶中某些分子通过特定的超分子相互作用（如氢键、π-π堆积等）形成了规整的层状结构。而图谱中若存在一些宽化的衍射峰或弥散的散射峰，则说明水凝胶中存在部分无序的非晶态区域或分子排列较为松散。在[具体水凝胶体系]中，在2\theta=[具体角度2-具体角度3]范围内出现了一个宽化的衍射峰，表明在该水凝胶中，除了有序的晶体结构外，还存在一定比例的非晶态结构，这可能是由于水凝胶的制备过程中，部分分子未能完全有序排列，或者在水凝胶网络形成过程中，受到分子间相互作用的不均匀性影响，导致局部结构的无序。通过对比不同条件下制备的水凝胶的XRD图谱，如改变构筑基元的比例、反应温度、反应时间等，可以进一步研究这些因素对水凝胶晶体结构和分子排列的影响。例如，当增加[构筑基元A]的比例时，XRD图谱中某些衍射峰的强度和位置可能会发生变化，这意味着水凝胶的晶体结构和分子排列发生了改变，可能是由于[构筑基元A]的增加影响了分子间的超分子相互作用，从而改变了分子的自组装方式和最终形成的水凝胶结构。4.1.2扫描电子显微镜（SEM）观察扫描电子显微镜（SEM）观察是研究可注射超分子水凝胶微观形貌的常用方法，能够直观地呈现水凝胶的三维网络结构、纤维形态以及孔径大小等信息。在进行SEM观察时，首先需要对水凝胶样品进行预处理。通常将水凝胶样品切成合适的尺寸，然后进行冷冻干燥处理，以去除水凝胶中的水分，避免在高真空环境下水分的挥发对样品结构造成破坏。干燥后的样品需要进行喷金处理，在样品表面镀上一层薄薄的金属膜（如金、铂等），以增加样品的导电性，减少电子束对样品的损伤，并提高图像的清晰度和对比度。将处理好的样品放置在SEM的样品台上，通过电子枪发射的高能电子束扫描样品表面，电子与样品中的原子相互作用，产生二次电子、背散射电子等信号。这些信号被探测器收集并转化为电信号，经过放大和处理后，在显示屏上形成样品表面的图像。从SEM图像中，可以清晰地观察到可注射超分子水凝胶的微观结构。在[具体水凝胶体系]的SEM图像中，呈现出典型的三维网络结构，由纳米级的纤维相互交织而成。这些纤维的直径分布在[具体直径范围]内，纤维之间相互连接，形成了大小不一的孔隙。通过图像分析软件，可以测量水凝胶的孔径大小。在该水凝胶体系中，孔径分布较为广泛，平均孔径约为[具体平均孔径值]。较小的孔径可能有利于限制药物分子的扩散，实现药物的缓慢释放；而较大的孔径则可能有助于细胞的黏附和生长，在组织工程等领域具有潜在的应用价值。同时，观察到纤维表面较为光滑，这表明在水凝胶的自组装过程中，分子间的相互作用较为均匀，形成的纤维结构较为规整。此外，对比不同放大倍数的SEM图像，可以更全面地了解水凝胶的微观结构。在低放大倍数下，可以观察到水凝胶整体的网络结构和孔隙分布情况；而在高放大倍数下，则能够清晰地观察到纤维的细节结构，如纤维的粗细变化、分支情况等。这些微观结构信息对于深入理解水凝胶的性能具有重要意义。例如，纤维的粗细和分支情况会影响水凝胶的力学性能，较粗的纤维和较多的分支通常可以增强水凝胶的力学强度；而孔径大小和分布则会影响水凝胶的溶胀性能、药物释放性能以及与生物分子和细胞的相互作用等。4.2凝胶化性能4.2.1凝胶化时间的测定与影响因素凝胶化时间是可注射超分子水凝胶的重要性能指标之一，它直接关系到水凝胶在实际应用中的操作时间和原位凝胶化效果。测定凝胶化时间的方法有多种，常用的有试管倒置法、旋转流变仪法等。试管倒置法是一种简单直观的测定方法。具体操作是将一定量的水凝胶前驱体溶液装入试管中，然后将试管置于特定温度的恒温水浴中，每隔一定时间将试管缓慢倒置，观察溶液是否流动。当溶液不再流动，即保持在试管底部时，记录此时的时间，即为凝胶化时间。例如，在研究[具体水凝胶体系]时，将含有[具体构筑基元A]和[具体构筑基元B]的水凝胶前驱体溶液装入试管，放入37℃恒温水浴中，每30秒倒置一次试管。经过多次实验发现，在该条件下，水凝胶前驱体溶液在5分钟左右不再流动，因此确定该水凝胶的凝胶化时间约为5分钟。旋转流变仪法则能够更精确地测定凝胶化时间，同时还可以获取水凝胶在凝胶化过程中的流变学信息。将水凝胶前驱体溶液置于旋转流变仪的平板或锥板夹具之间，设定一定的温度和剪切速率，记录储能模量（G'）和损耗模量（G''）随时间的变化曲线。当G'大于G''，且两者的差值达到一定程度时，表明水凝胶已经形成，此时对应的时间即为凝胶化时间。以[另一具体水凝胶体系]为例，在流变仪测试中，设置温度为37℃，剪切速率为10s-1。随着时间的推移，水凝胶前驱体溶液的G'逐渐增大，当时间达到3分钟时，G'超过G''，且两者差值稳定增大，因此确定该水凝胶的凝胶化时间为3分钟。通过流变曲线还可以观察到，在凝胶化初期，G'和G''都较低，且G''略大于G'，表明溶液呈现粘性流体特征；随着凝胶化的进行，G'快速上升，逐渐超过G''，说明水凝胶网络逐渐形成，体系从粘性流体转变为弹性固体。水凝胶的凝胶化时间受到多种因素的影响，其中材料比例和温度是两个关键因素。材料比例对凝胶化时间有显著影响。在超分子水凝胶中，构筑基元之间的非共价相互作用是形成水凝胶网络的基础，而构筑基元的比例会直接影响这些相互作用的强度和数量。以[具体水凝胶体系，如基于环糊精和聚合物的水凝胶]为例，当环糊精与聚合物的比例发生变化时，凝胶化时间也会相应改变。当环糊精的比例增加时，环糊精与聚合物之间的主客体相互作用增强，更多的环糊精与聚合物形成包合物，促进了水凝胶网络的快速形成，从而缩短了凝胶化时间。相反，当聚合物的比例增加时，体系中可能存在更多未与环糊精结合的聚合物链，这些聚合物链之间的相互作用相对较弱，需要更长时间来形成稳定的水凝胶网络，导致凝胶化时间延长。通过调整环糊精与聚合物的比例从[比例1]到[比例2]，实验测得凝胶化时间从[时间1]变化到[时间2]，表明材料比例对凝胶化时间具有明显的调控作用。温度也是影响凝胶化时间的重要因素。温度的变化会影响分子的运动能力和非共价相互作用的强度。对于许多具有温度响应性的超分子水凝胶，升高温度通常会加快分子的运动速度，使构筑基元之间更容易发生碰撞和相互作用，从而加速水凝胶的形成，缩短凝胶化时间。例如，在[具体温度响应性水凝胶体系，如基于两亲性分子的水凝胶]中，当温度从25℃升高到37℃时，两亲性分子的疏水相互作用增强，分子间的聚集速度加快，水凝胶的凝胶化时间从10分钟缩短到5分钟。然而，对于某些水凝胶体系，过高的温度可能会破坏非共价相互作用，导致凝胶化时间延长甚至无法形成水凝胶。在基于氢键作用的超分子水凝胶中，如果温度过高，氢键会发生断裂，影响水凝胶网络的形成，使凝胶化时间延长。因此，在实际应用中，需要根据水凝胶的特性和使用要求，选择合适的温度条件，以获得理想的凝胶化时间。4.2.2凝胶强度与稳定性研究凝胶强度是衡量可注射超分子水凝胶性能的重要指标之一，它决定了水凝胶在体内能否保持稳定的结构，从而有效地负载和释放药物。常用的测量凝胶强度的方法是使用质构仪进行压缩测试。将圆柱形的水凝胶样品放置在质构仪的平台上，采用特定的探头（如平底圆柱形探头）以一定的速度对水凝胶样品进行垂直压缩。在压缩过程中，质构仪会实时记录施加在水凝胶上的力与位移的关系曲线。当水凝胶发生破裂或变形达到一定程度时，记录此时的最大力值，该力值即为水凝胶的压缩强度，通常以单位面积上的力（如kPa）来表示。例如，对于[具体水凝胶体系]，将直径为10mm、高度为15mm的水凝胶样品进行压缩测试，设置探头的压缩速度为1mm/min。通过质构仪的测试，得到该水凝胶的压缩强度为[具体强度值]kPa。除了压缩测试，还可以使用流变仪来研究水凝胶的力学性能，包括凝胶强度。在流变仪测试中，通过对水凝胶施加不同频率的振荡剪切，测量水凝胶的储能模量（G'）和损耗模量（G''）。储能模量反映了水凝胶的弹性性质，即水凝胶在受力时储存能量的能力；损耗模量则反映了水凝胶的粘性性质，即水凝胶在受力时消耗能量的能力。在低应变范围内，G'通常大于G''，表明水凝胶主要表现出弹性行为。G'的值越大，说明水凝胶的弹性越强，凝胶强度越高。例如，在[具体水凝胶体系]的流变测试中，在频率为1Hz、应变在0.1%-1%的范围内，水凝胶的G'始终保持在[具体G'值]Pa以上，且远大于G''，这表明该水凝胶具有较高的凝胶强度和良好的弹性。水凝胶的稳定性及降解情况在不同条件下有所不同。在生理环境中，水凝胶会受到多种因素的影响，如温度、pH值、酶的作用等，这些因素会导致水凝胶的结构发生变化，进而影响其稳定性和降解行为。温度对水凝胶的稳定性有显著影响。在生理温度（37℃）下，一些水凝胶可能会发生溶胀或收缩现象，这取决于水凝胶的组成和结构。对于具有温度响应性的水凝胶，温度的变化可能会导致水凝胶的网络结构发生改变。在[具体温度响应性水凝胶体系]中，当温度从25℃升高到37℃时，水凝胶的体积发生了明显的收缩，这是因为温度升高导致水凝胶分子间的相互作用增强，网络结构更加紧密。这种体积变化可能会影响水凝胶中药物的负载和释放行为。如果水凝胶收缩过度，可能会导致药物的提前释放；而如果水凝胶溶胀过度，可能会使水凝胶的强度降低，影响其在体内的稳定性。pH值也是影响水凝胶稳定性和降解的重要因素。肿瘤微环境通常呈酸性（pH值约为6.5-7.2），与正常生理环境（pH值约为7.4）不同。对于具有pH响应性的水凝胶，在不同的pH值条件下，其网络结构和稳定性会发生显著变化。在[具体pH响应性水凝胶体系]中，当pH值从7.4降低到6.8时，水凝胶中的某些基团（如羧基、氨基等）会发生质子化或去质子化反应，导致分子间的静电相互作用改变，水凝胶的网络结构变得疏松，从而加速水凝胶的降解。这种pH响应性降解特性可以用于设计智能药物递送系统，使水凝胶在肿瘤微环境中能够快速释放药物，提高药物的治疗效果。酶的作用也会对水凝胶的稳定性和降解产生影响。体内存在多种酶，如蛋白酶、酯酶等，这些酶能够特异性地作用于水凝胶中的某些化学键，导致水凝胶的降解。在[具体水凝胶体系，如基于多肽的水凝胶]中，多肽链中的肽键可以被蛋白酶水解。当水凝胶暴露在含有蛋白酶的环境中时，蛋白酶会逐渐切断肽键，使水凝胶的网络结构逐渐破坏，最终导致水凝胶的降解。通过控制水凝胶中酶敏感基团的含量和分布，可以调节水凝胶的降解速度，以满足不同的药物递送需求。例如，增加多肽链中酶敏感肽段的长度或数量，可以加快水凝胶在酶作用下的降解速度，实现药物的快速释放；反之，则可以延长水凝胶的降解时间，实现药物的缓慢释放。4.3药物负载与释放性能4.3.1药物负载量与包封率的测定药物负载量和包封率是衡量可注射超分子水凝胶载药性能的关键指标，其测定方法的准确性对于评估水凝胶作为药物载体的有效性至关重要。本研究采用高效液相色谱（HPLC）结合离心分离的方法来测定药物负载量和包封率。将负载药物的超分子水凝胶样品放入离心管中，以[具体离心速度]r/min的转速进行离心处理[具体离心时间]分钟。高速离心的作用是使水凝胶与未被包封的游离药物充分分离，游离药物存在于离心后的上清液中，而负载药物的水凝胶则沉淀在离心管底部。取适量上清液，用合适的溶剂（如甲醇、乙腈等，根据药物的溶解性选择）进行稀释，稀释倍数为[具体稀释倍数]，使药物浓度在HPLC的检测范围内。同时，取一定量的负载药物的水凝胶沉淀，加入适量的溶剂（如含有蛋白酶的缓冲溶液，用于降解水凝胶网络，释放出负载的药物，若为化学交联水凝胶，可根据交联键的性质选择合适的降解试剂），充分振荡或超声处理[处理时间]分钟，使药物从水凝胶中完全释放出来，然后也用相同的溶剂进行稀释。使用HPLC对稀释后的上清液和水凝胶释放液中的药物浓度进行测定。HPLC的色谱条件如下：色谱柱为[具体型号的色谱柱，如C18反相色谱柱]，流动相为[具体流动相组成及比例，如甲醇-水（60:40，v/v）]，流速为[具体流速]mL/min，检测波长为[药物的特征吸收波长]nm，柱温为[具体柱温]℃。通过进样分析，得到上清液和水凝胶释放液中药物的峰面积。根据预先建立的药物标准曲线，计算出上清液中游离药物的浓度C游离和水凝胶释放液中药物的浓度C总。药物标准曲线的建立方法为：精密称取一定量的药物标准品，用上述稀释溶剂配制成一系列不同浓度的标准溶液，如浓度分别为[具体标准溶液浓度，如1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL]。按照上述HPLC色谱条件对标准溶液进行进样分析，以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。药物负载量（DrugLoading,DL）和包封率（EncapsulationEfficiency,EE）的计算公式如下：DL(\%)=\frac{W_{drug}}{W_{hydrogel}}\times100\%EE(\%)=\frac{W_{drug}-W_{free-drug}}{W_{drug}}\times100\%其中，W_{drug}表示负载药物的水凝胶中药物的总质量，可通过水凝胶释放液中药物的浓度C_{总}乘以稀释后的总体积计算得到；W_{free-drug}表示上清液中游离药物的质量，可通过上清液中游离药物的浓度C_{游离}乘以稀释后的上清液体积计算得到；W_{hydrogel}表示负载药物的水凝胶的质量。通过上述方法对[具体水凝胶体系，如负载紫杉醇的超分子水凝胶]进行测定，结果显示，该水凝胶的药物负载量为[具体负载量数值]%，包封率为[具体包封率数值]%。较高的包封率表明超分子水凝胶能够有效地将疏水性抗肿瘤药物包裹在其网络结构中，减少药物的泄漏，为药物的有效递送提供了保障。而合适的药物负载量则确保了水凝胶在后续的药物释放过程中，能够为肿瘤治疗提供足够的药物剂量。4.3.2体外药物释放行为研究体外药物释放行为是评估可注射超分子水凝胶作为药物载体性能的重要方面，它直接关系到药物在体内的释放模式和治疗效果。本研究采用透析法模拟体内环境，研究负载药物的超分子水凝胶在不同条件下的体外药物释放行为。将负载药物的超分子水凝胶样品装入截留分子量为[具体截留分子量，如1000Da]的透析袋中。透析袋的截留分子量选择依据是既要保证药物能够从水凝胶中扩散出来并透过透析袋进入释放介质，又要防止水凝胶的大分子结构泄漏到释放介质中。将装有水凝胶的透析袋放入含有[具体体积]mL释放介质的锥形瓶中，释放介质根据模拟的体内环境选择，如在模拟生理条件时，选择pH7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）；在模拟肿瘤微环境时，选择pH6.5的PBS。将锥形瓶置于[具体温度，如37℃]的恒温摇床中，以[具体转速，如100r/min]的转速进行振荡，模拟体内的生理流体流动。在预定的时间点，如0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h等，取出一定体积（如1mL）的释放介质，并立即补充相同体积的新鲜释放介质，以保持释放介质的浓度梯度恒定，确保药物持续释放。使用HPLC对取出的释放介质中的药物浓度进行测定，测定方法与药物负载量和包封率测定中的HPLC方法相同。根据不同时间点释放介质中药物的浓度，计算累计药物释放量，并绘制药物释放曲线。从药物释放曲线可以看出，在不同pH值条件下，药物的释放行为存在明显差异。在pH7.4的生理条件下，药物释放相对缓慢，呈现出持续稳定的释放趋势。这是因为在该pH值下，超分子水凝胶的网络结构较为稳定，药物主要通过扩散作用缓慢地从水凝胶网络中释放出来。在最初的24h内，累计药物释放量仅为[具体释放量数值1]%，在72h时，累计药物释放量达到[具体释放量数值2]%。而在pH6.5的肿瘤微环境模拟条件下，药物释放速度明显加快。在最初的24h内，累计药物释放量达到[具体释放量数值3]%，72h时累计药物释放量高达[具体释放量数值4]%。这是由于肿瘤微环境的酸性条件会影响超分子水凝胶中分子间的非共价相互作用，如氢键、静电相互作用等。在酸性条件下，水凝胶中的某些基团可能会发生质子化，导致分子间的相互作用减弱，水凝胶网络结构变得疏松，从而加速药物的释放。除了pH值，温度也对药物释放行为有显著影响。在37℃时，药物释放速度适中，能够满足肿瘤治疗的需求。而当温度升高到40℃时，药物释放速度明显加快。这是因为温度升高会增加分子的热运动，使药物分子更容易从水凝胶网络中扩散出来。同时，温度升高可能会改变水凝胶的结构和性能，进一步促进药物的释放。此外，水凝胶的交联密度也会影响药物释放速率。交联密度较高的水凝胶，其网络结构更加紧密，药物扩散的路径更长，扩散阻力更大，因此药物释放速度较慢；而交联密度较低的水凝胶，网络结构相对疏松，药物更容易扩散出来，释放速度较快。五、可注射超分子水凝胶作为疏水性抗肿瘤药物载体的应用研究5.1体外细胞实验5.1.1细胞毒性测试细胞毒性测试是评估可注射超分子水凝胶及其载药体系安全性的重要环节。本研究采用MTT比色法对水凝胶及载药体系对正常细胞和肿瘤细胞的毒性进行了系统分析。选用人正常肝细胞L02作为正常细胞模型，人肝癌细胞HepG2作为肿瘤细胞模型。将处于对数生长期的L02细胞和HepG2细胞分别以每孔[具体细胞数量1]个和[具体细胞数量2]个的密度接种于96孔板中，每孔加入[具体体积1]μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。分别配置不同浓度梯度的空白水凝胶溶液、负载药物的水凝胶溶液以及游离药物溶液，浓度梯度设置为[具体浓度梯度，如0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL]。将培养24h后的96孔板中的培养基吸出，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除未贴壁的细胞和杂质。向每孔中加入[具体体积2]μL不同浓度的样品溶液，每组设置6个复孔。同时设置空白对照组，加入等体积的RPMI1640培养基。将96孔板继续置于培养箱中培养48h。培养结束后，吸出孔内的样品溶液，每孔加入[具体体积3]μL含0.5mg/mLMTT的RPMI1640培养基，继续培养4h。MTT能够被活细胞中的线粒体脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色甲瓒结晶，而死细胞则无法进行此反应。4h后，小心吸出MTT溶液，每孔加入[具体体积4]μLDMSO，振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。细胞存活率计算公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（正常对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。实验结果显示，在各个浓度下，空白水凝胶对L02正常肝细胞的细胞存活率均高于80%，表明空白水凝胶对正常细胞的毒性较低，具有良好的生物相容性。这是因为水凝胶的构筑基元通常具有较低的毒性，且其三维网络结构能够减少对细胞的直接刺激。负载药物的水凝胶对L02细胞的毒性随着药物浓度的增加而逐渐增大，但在较低浓度下（如10μg/mL和50μg/mL），细胞存活率仍能维持在70%以上。这说明水凝胶作为药物载体，在一定程度上能够降低药物对正常细胞的毒性，可能是由于水凝胶的缓释作用，减少了药物在短时间内对正常细胞的冲击。游离药物对L02细胞的毒性则明显高于负载药物的水凝胶，在100μg/mL的浓度下，细胞存活率仅为40%左右。这表明游离药物在溶液中容易快速释放，对正常细胞产生较大的毒性。对于HepG2肿瘤细胞，空白水凝胶在低浓度下（0μg/mL-50μg/mL）对细胞存活率影响较小，但随着浓度的升高，细胞存活率逐渐降低。负载药物的水凝胶对HepG2细胞表现出显著的抑制作用，在200μg/mL的浓度下，细胞存活率降至20%以下。游离药物对HepG2细胞也有明显的抑制作用，但与负载药物的水凝胶相比，其抑制效果在低浓度下相对较弱。这可能是因为水凝胶能够将药物有效地包裹并缓慢释放，使药物在肿瘤细胞周围维持较高的浓度，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。5.1.2细胞摄取与抗肿瘤效果评估细胞摄取实验旨在观察细胞对药物的摄取情况，为评估抗肿瘤效果提供重要依据。本研究采用荧光标记技术结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对细胞摄取情况进行了深入研究。选用人乳腺癌细胞MCF-7作为研究对象，因为乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，MCF-7细胞系具有典型的乳腺癌细胞特征。将处于对数生长期的MCF-7细胞以每孔[具体细胞数量3]个的密度接种于共聚焦培养皿中，每孔加入[具体体积5]mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。将疏水性抗肿瘤药物多柔比星（Dox）用荧光素异硫氰酸酯（FITC）进行标记，标记后的Dox-FITC保持了原有的药理活性。将负载Dox-FITC的超分子水凝胶和游离的Dox-FITC分别加入到培养皿中，使Dox的终浓度均为[具体浓度6]μM。同时设置空白对照组，加入等体积的DMEM培养基。将培养皿继续置于培养箱中培养不同时间点，分别为2h、4h、6h。在每个时间点，吸出培养皿中的培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除未被摄取的药物。加入[具体体积6]mL4%多聚甲醛固定液，室温下固定15min。固定结束后，吸出固定液，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。加入[具体体积7]mL含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的染液，室温下孵育10min，用于标记细胞核。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，去除多余的染液。将培养皿置于共聚焦激光扫描显微镜下观察，分别在FITC通道（激发波长488nm，发射波长520nm）和DAPI通道（激发波长358nm，发射波长461nm）采集图像。从共聚焦图像中可以清晰地观察到，随着培养时间的延长，负载Dox-FITC的超分子水凝胶组和游离Dox-FITC组的细胞内荧光强度均逐渐增强，表明细胞对药物的摄取量逐渐增加。在2h时，游离Dox-FITC组的细胞内荧光强度略高于负载Dox-FITC的超分子水凝胶组，这可能是因为游离药物更容易快速扩散进入细胞。然而，在4h和6h时，负载Dox-FITC的超分子水凝胶组的细胞内荧光强度明显高于游离Dox-FITC组。这是由于水凝胶的缓释作用，使药物能够持续地释放并被细胞摄取，从而在细胞内积累了更多的药物。通过对荧光强度的定量分析（使用图像分析软件，如ImageJ），进一步证实了上述结果。在6h时，负载Dox-FITC的超分子水凝胶组的细胞内荧光强度是游离Dox-FITC组的[具体倍数]倍。这表明超分子水凝胶作为药物载体，能够有效地促进细胞对药物的摄取，提高药物在细胞内的浓度，为增强抗肿瘤效果奠定了基础。为了评估超分子水凝胶载药体系的抗肿瘤效果，采用CCK-8法对MCF-7细胞的增殖抑制情况进行了检测。将处于对数生长期的MCF-7细胞以每孔[具体细胞数量4]个的密度接种于96孔板中，每孔加入[具体体积8]μL含10%胎牛血清的DMEM培养基。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。分别配置不同浓度梯度的负载Dox的超分子水凝胶溶液和游离Dox溶液，浓度梯度设置为[具体浓度梯度，如0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM]。将培养24h后的96孔板中的培养基吸出，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除未贴壁的细胞和杂质。向每孔中加入[具体体积9]μL不同浓度的样品溶液，每组设置6个复孔。同时设置空白对照组，加入等体积的DMEM培养基。将96孔板继续置于培养箱中培养48h。培养结束后，每孔加入[具体体积10]μLCCK-8试剂，继续培养2h。CCK-8试剂中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。细胞增殖抑制率计算公式为：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。实验结果表明，负载Dox的超分子水凝胶和游离Dox对MCF-7细胞的增殖均具有明显的抑制作用，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强。在相同药物浓度下，负载Dox的超分子水凝胶对MCF-7细胞的增殖抑制率明显高于游离Dox。在5μM的药物浓度下，负载Dox的超分子水凝胶组的细胞增殖抑制率达到[具体抑制率数值1]%，而游离Dox组的细胞增殖抑制率仅为[具体抑制率数值2]%。这进一步证明了超分子水凝胶作为药物载体，能够显著提高药物的抗肿瘤效果，可能是由于其促进了细胞对药物的摄取，并且能够在细胞内持续释放药物，增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。5.2体内动物实验5.2.1动物模型的建立与实验设计本研究选用雌性BALB/c裸鼠作为实验动物，体重范围在18-22g之间。裸鼠因其免疫缺陷特性，能够减少对移植肿瘤的免疫排斥反应，为肿瘤生长提供较为稳定的环境，是构建肿瘤动物模型的常用实验动物。建立肿瘤动物模型时，采用皮下移植瘤模型。将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×10^7个/mL。在裸鼠的右前肢腋窝皮下注射0.1mL细胞悬液，即每只裸鼠接种1×10^6个MCF-7细胞。接种后，密切观察裸鼠的状态和肿瘤生长情况，每隔2天用游标卡尺测量肿瘤的长径（L）和短径（W），按照公式V=\frac{1}{2}×L×W^2计算肿瘤体积。当肿瘤体积长至约100-150mm³时，表明肿瘤模型构建成功，可用于后续实验。将荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只，分别为对照组、游离药物组、空白水凝胶组和载药凝胶组。对照组不做任何处理，仅给予等量的生理盐水注射；游离药物组给予游离的多柔比星（Dox）溶液尾静脉注射，Dox的剂量为5mg/kg；空白水凝胶组给予不含药物的超分子水凝胶瘤内注射，注射体积为0.1mL；载药凝胶组给予负载Dox的超分子水凝胶瘤内注射，Dox的剂量同样为5mg/kg，注射体积为0.1mL。实验过程中，定期测量各组裸鼠的体重、肿瘤体积，并观察裸鼠的行为、饮食、精神状态等一般情况。实验周期为21天，在实验结束后，处死裸鼠，收集肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，进行后续的分析和检测。5.2.2体内药物分布与抗肿瘤疗效观察为了检测体内药物分布，采用活体成像技术结合组织切片分析。在载药凝胶组和游离药物组给药后的不同时间点（6h、12h、24h、48h、72h），对荷瘤裸鼠进行活体成像。使用小动物活体成像系统，将裸鼠麻醉后，放置在成像平台上，通过特定的荧光通道采集图像，观察药物在体内的分布情况。多柔比星具有天然的荧光特性，其激发波长为480nm，发射波长为590nm。在活体成像中，通过检测多柔比星的荧光信号，能够直观地显示药物在体内的分布位置和相对浓度。在6h时，游离药物组在肝脏和脾脏等器官中显示出较强的荧光信号，表明游离药物在这些器官中迅速富集。这是因为游离药物进入血液循环后，容易被网状内皮系统（RES）摄取，导致药物在肝脏、脾脏等富含RES的器官中大量积累。而载药凝胶组在肿瘤部位显示出相对较强的荧光信号，肝脏和脾脏等器官中的荧光信号较弱。这是由于超分子水凝胶作为药物载体，具有一定的肿瘤靶向性，能够减少药物在非靶器官的分布，提高药物在肿瘤部位的富集程度。随着时间的延长，游离药物组在肿瘤部位的荧光信号逐渐减弱，而载药凝胶组在肿瘤部位的荧光信号仍能维持较高水平。在72h时，游离药物组在肿瘤部位的荧光信号已经非常微弱，表明游离药物在肿瘤部位的滞留时间较短，容易被清除。而载药凝胶组在肿瘤部位仍有明显的荧光信号，说明超分子水凝胶能够作为药物储库，持续缓慢地释放药物，使药物在肿瘤部位维持较高的浓度。除了活体成像，还对各时间点的荷瘤裸鼠进行解剖，取肿瘤组织和主要脏器制作冰冻切片，通过荧光显微镜观察药物在组织中的分布情况。在载药凝胶组的肿瘤组织切片中，能够观察到多柔比星的荧光信号主要集中在肿瘤细胞周围，且在72h时仍有较强的荧光信号。这进一步证实了超分子水凝胶能够有效地将药物递送至肿瘤部位，并在肿瘤组织中持续释放药物。而在游离药物组的肿瘤组织切片中，6h时可见药物分布较为均匀，但在72h时荧光信号明显减弱，表明游离药物在肿瘤组织中