免疫学考试重点问答及实验技巧

免疫学考试重点问答及实验技巧一、免疫学核心知识问答（一）免疫系统功能与免疫应答类型1.免疫系统的三大功能及其生理/病理意义是什么？免疫系统通过免疫防御（抵御病原体入侵，如抗细菌、病毒感染）、免疫监视（识别并清除突变细胞或病毒感染细胞，预防肿瘤发生）、免疫自稳（清除衰老/损伤细胞，维持内环境稳态）维持机体平衡。功能异常时，防御过强可致超敏反应（如哮喘），监视不足易诱发肿瘤，自稳失调会引发自身免疫病（如类风湿关节炎）。2.固有免疫与适应性免疫的本质区别有哪些？固有免疫是先天遗传的防御机制，应答速度快（数小时内），无抗原特异性，无免疫记忆，由巨噬细胞、中性粒细胞、补体等介导；适应性免疫是后天接触抗原后形成的特异性免疫，应答慢（数天），具有高度特异性和记忆性，由T/B淋巴细胞及抗体、细胞因子等介导，二者协同发挥抗感染、抗肿瘤作用。（二）免疫分子与细胞活化3.补体系统的三条激活途径有何差异？补体激活分三条途径：经典途径：由抗原-抗体复合物（IgG/IgM）激活C1q启动，依赖抗体，参与体液免疫效应阶段；MBL途径：由甘露糖结合凝集素（MBL）识别病原体表面甘露糖残基，激活MASP酶启动，不依赖抗体，是固有免疫的早期防御；旁路途径：由C3b直接结合病原体表面（如脂多糖）启动，无需抗体，是补体激活的“备用途径”，持续监控病原体入侵。4.T细胞完全活化需要哪些信号？为何“双信号”缺一不可？T细胞活化需双信号：第一信号：TCR识别抗原肽-MHC复合物，CD4/CD8共受体辅助，传递抗原特异性信号；第二信号：共刺激分子（如CD28与B7分子）结合，传递“活化许可”信号。若仅第一信号，T细胞会进入无能状态（失能）或凋亡，无法启动免疫应答；双信号共同作用下，T细胞才会增殖分化为效应细胞（如Th1、Th17），并分泌IL-2等细胞因子维持活化。（三）免疫病理与临床应用5.四型超敏反应的介导分子、效应细胞及典型疾病分别是什么？超敏反应（变态反应）分四型：Ⅰ型（速发型）：IgE介导，肥大细胞/嗜碱性粒细胞释放组胺等介质，典型疾病如过敏性鼻炎（花粉过敏）、支气管哮喘；Ⅱ型（细胞毒型）：IgG/IgM结合靶细胞表面抗原，补体/吞噬细胞/NK细胞介导杀伤，如输血反应（ABO血型不符）、自身免疫性溶血性贫血；Ⅲ型（免疫复合物型）：抗原-抗体复合物沉积于血管/组织，激活补体引发炎症，如类风湿关节炎（关节腔IgG-类风湿因子复合物沉积）、系统性红斑狼疮（抗核抗体复合物沉积）；Ⅳ型（迟发型）：T细胞介导（Th1/CTL），24~72小时后出现反应，如结核菌素试验（结核杆菌感染后迟发超敏）、接触性皮炎（化妆品/金属过敏）。二、免疫学实验核心技巧与实操要点（一）ELISA实验：从“背景控制”到“结果精准”ELISA基于抗原-抗体特异性结合与酶促显色，核心是减少非特异性结合。操作关键步骤：1.包被优化：抗原/抗体包被浓度（通常0.1~10μg/ml）需预实验确定，4℃过夜包被后用PBST洗涤3次（每次3min）；2.封闭充分：5%脱脂牛奶或BSA（磷酸化抗原用BSA）封闭1~2h（37℃），阻断板孔剩余位点；3.抗体孵育：一抗（如抗人IgG）4℃过夜（或37℃1h），二抗（酶标抗体）室温1h，均需用封闭液稀释（避免蛋白非特异吸附）；4.洗涤彻底：每次加样后用PBST洗涤3次（浸泡1min，甩干后拍干），残留抗体/酶会导致背景升高。常见问题解决：背景高：延长封闭时间（如2h）、增加洗涤次数（4次）、降低抗体浓度（梯度稀释至1:5000~1:____）；阴性对照显色：更换新的封闭液/洗涤液，操作时严格分区（加样枪头、板孔避免交叉污染）。（二）WesternBlot：“条带清晰”的秘密WB用于蛋白定性/半定量，核心是蛋白分离与转膜效率。操作黄金法则：1.样品制备：RIPA裂解液（加蛋白酶抑制剂）冰上裂解细胞，超声破碎（大蛋白需），BCA定量确保上样量均一（20~50μg/孔）；2.电泳分离：根据蛋白分子量选择胶浓度（如30kD选12%胶，100kD选8%胶），积层胶50V，分离胶100V，确保蛋白线性分离；3.转膜技巧：PVDF膜用甲醇激活（激活疏水基团），湿法转膜时“三明治”结构（滤纸-胶-膜-滤纸）无气泡，恒压转膜（如300mA，60min，根据蛋白大小调整时间）；4.封闭与孵育：磷酸化蛋白用5%BSA封闭（牛奶含内源性蛋白干扰），一抗4℃过夜（如抗GAPDH1:____），二抗室温1h（HRP标记，1:5000）。疑难杂症破解：无条带：检查转膜电流（胶是否染色？膜上有Marker吗？）、一抗是否失效（换用新抗体）、显影液是否新鲜（现配现用）；条带模糊：上样前离心样品（去除沉淀）、转膜时用滤纸紧密贴合（排除气泡）、调整曝光时间（从10s到5min梯度曝光）。（三）流式细胞术：“数据可靠”的设门逻辑流式通过荧光信号分析细胞表型，核心是活细胞制备与抗体滴定。实操核心步骤：1.细胞制备：胰酶消化贴壁细胞（避免机械损伤），70μm筛网过滤（去除聚集细胞），台盼蓝拒染法检测活率（>90%）；2.抗体选择：同型对照（如IgG-FITC）设门，避免非特异结合；多色染色时，选择光谱重叠少的荧光素（如FITC、PE、APC）；3.胞内染色：固定（4%多聚甲醛）→破膜（TritonX-100）→封闭（5%BSA）→一抗孵育（如抗NF-κBp65），步骤需充分（破膜不充分会导致抗体无法进入胞内）；4.上机分析：先设FSC/SSC门圈出“单细胞群”（排除细胞碎片、双细胞），再分析荧光阳性率，补偿调节（单染管逐一调整）。常见失误修正：细胞聚集：加DNase（50μg/ml）消化DNA黏连，或用EDTA替代胰酶；阳性率低：抗体梯度滴定（如1:50、1:100、1:200），选择阳性峰明显、背景低的浓度；补偿错误：多色染色时，用单染阳性细胞调节各通道补偿（如FITC单染管调PE通道的补偿）。（四）免疫组化：“定位准确”的染色艺术IHC用于组织抗原定位，核心是抗原修复与脱片控制。操作关键细节：1.组织处理：中性甲醛固定（避免酸性固定液破坏抗原），石蜡切片厚度3~5μm，60℃烤片2h（防脱片）；2.抗原修复：热修复（柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波炉高火5min+中火10min）或酶修复（胰蛋白酶，37℃10min），根据抗体说明书选择；3.封闭与孵育：3%H₂O₂阻断内源性过氧化物酶（10min），5%正常血清封闭（30min），一抗4℃过夜（如抗Ki-67，1:200），二抗（生物素化）室温30min；4.显色与复染：DAB显色（显微镜下控制时间，出现棕黄色即终止），苏木精复染核（10~30s），梯度乙醇脱水，中性树胶封片。典型问题解决：脱片：烤片时间延长至3h，修复液温度降至95℃（避免高温破坏黏附）；背景高：封闭血清与二抗种属一致（如兔抗一抗用山羊血清封闭），稀释一抗（如1:500）；无阳性信号：更换修复液（如EDTA缓冲液pH8.0），确认一抗孵育条件（是否需抗原修复？）。结语：免疫