药物定量分析与分析方法验证年

药物定量分析与分析方法验证年第一节定量分析方法得分类与特点化学分析法光谱分析法色谱分析法重量分析法

容量分析法紫外分析法UV

荧光分析法FIA高效液相色谱HPLC

气相色谱GC一、容量分析法(滴定)容量分析:将已知浓度得滴定液由滴定管滴加到待测药物得溶液中,直到所滴加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止,然后根据滴定液得浓度与消耗得体积,计算出被测药物得含量。特点:灵敏度低,准确,专属性差,通常用于原料药得含量测定。滴定方式

直接滴定法生成物滴定法剩余量滴定法

计算滴定度:1mL某物质得量浓度得滴定液相当于被测药物得重量,中国药典用mg表示。量纲mg/ml。滴定度得计算:T→滴定度(mg/ml)c→滴定液浓度(mol/L)M→被测物质分子量√以I2(0、05mol/L)计,反应摩尔比1∶1例百分含量

1、直接滴定法

含量%=校正系数(F)含量%=例精密称取苯巴比妥钠0、2071g,依法用硝酸银滴定液(0、1001mol/L)滴定。消耗8、02mL,每1mL硝酸银滴定液(0、1mol/L)相当于25、75mg得苯巴比妥钠。计算含量。2、剩余滴定法含量%=含量%=

司可巴比妥钠(Ch、P)取本品约0、1g,精密称定,置250ml碘瓶中,加水l0ml,振摇使溶解,精密加溴滴定液(0、05mol/L)25m1,再加盐酸5m1,立即密塞并振摇1min,在暗处静置15min后,注意微开瓶塞,加碘化钾试液l0ml,立即密塞,摇匀后用硫代硫酸钠滴定液(0、1mol/L)滴定,至近终点时,加淀粉指示液,继续滴定至蓝色消失,并将滴定结果用空白试验校正。每lml溴滴定液(0、05mol/L)相当于13、01mg得C12H17N2NaO3。例1、原理＋Br2(定量过量)1C12H17N2NaO3～1Br212大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流二、光谱分析法通过测定被测物质在光谱得特定波长处或一定波长范围内得吸光度或发光强度,对该物质进行定性或定量分析得方法。紫外-可见分光光度法荧光分光光度法定量分析基本原理

朗伯-比尔定律

A=ECL紫外光区:200~400nm可见光区:400~760nm紫外－可见分光光度法特点:仪器便宜;易操作。

灵敏度高(10-4～10-7g/mL)准确度高(一)对溶剂得要求

A尽量小(二)空白对照试验

清零(三)测定波长确证

紫外区允许误差±1nm(四)供试液得浓度A=0、3~0、7

吸收度得测定要求√含量测定1、吸收系数法(不需要对照品)测定λ处吸收度,以该物质在规定条件下得吸收系数计算。

含量％＝

×100％√盐酸氯丙嗪含量测定:精密称取0.2368g，置500ml量瓶中，加盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置100ml量瓶中，加同一溶剂稀释至刻度，摇匀，在254nm波长处测得吸收度为0.435，按为915计算，求其百分含量。例2、对照品比较法配制供试品溶液与对照品溶液,测定λ处吸收度。(1)外标一点法

C待测＝C对照×含量％＝×100％供试品与对照品溶液中得被测成分得量应尽可能一致(要求对照品量为供试品量100±10%)。(2)标准曲线法(多点对照)

绘制对照液浓度－吸光度标准曲线(3-5点)拟合回归方程,求出供试液浓度。标准曲线3、计算分光光度法多波长校正计算分光光度法双波长分光光度法三波长分光光度法导数光谱法解联立方程法激发波长发射波长(激发光谱)(发射光谱)荧光分析法特点:灵敏度较紫外高、选择性好

(10-10～10-12g/mL);应在低浓度下进行;干扰因素较多,须进行空白校正;能产生荧光得物质较少,可采用荧光衍生化处理。

思考:物质结构产生荧光得条件？含量测定原理

当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件一定时,在较稀浓度范围内药物得荧光强度与溶液中该物质得浓度成正比。荧光强度∝浓度对照品比较法由于绝对荧光强度难以测定,需要在每次测定前用一定浓度得对照品溶液校正仪器灵敏度,然后读取对照品溶液、供试品溶液及各自溶剂得空白读数。

C待测＝C对照×由于浓度线性范围较窄,应在0、5～2、0之间。三、色谱分析法

高效液相色谱法(HPLC)气相色谱法(GC)固定相色谱过程流动相被分离组分高效液相色谱法(HPLC)固定相、流动相及检测器得选择常用系统固定相(色谱柱):十八烷基硅烷键合硅胶C18流动相:甲醇-水、乙腈-水检测器:紫外吸收检测器检测器:

紫外检测器(UVD最常用)荧光检测器示差折光检测器电化学检测器二极管阵列检测器(DAD)蒸发光散射检测器(ELSD)质谱检测器(MS)系统适用性试验★用规定得对照品对仪器进行试验与调整

理论板数(n)分离度(R)重复性(RSD)拖尾因子(T)√√√√含量测定方法外标法内标法外标一点法标准曲线法外标一点法被测成分浓度与其峰面积成正比关系要求供试液与对照液浓度相近=A供A对C供Ｃ对样品C供=C对×A供A对对照2、标准曲线法

绘制浓度－峰面积(峰高)标准曲线;

拟合回归方程并计算相关系数r;A=aC+b

测定供试品峰面积(峰高),带入方程,求出浓度。▲选择适宜得物质作为内标物,以待测组分与内标物得峰高比或峰面积比求算试样含量得方法称为内标法。▲校正因子(f)其含义为:内标物峰面积与其浓度之比(As/Cs)就是对照品峰面积与其浓度之比(AR/CR)得多少倍。3、内标法对照+内标样品+内标样品内标对照内标校正因子f=(A内/C内)/(A对/C对)黄体酮得含量测定内标溶液得制备:取己烯雌酚25、0mg,置于25mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。测定:取黄体酮对照品25、6mg,置于25mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取该溶液与内标溶液各5mL,置于25mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。取5μL注入液相色谱仪,记录色谱图,测得黄体酮峰面积为537808,己烯雌酚峰面积503246;另取样品24、6mg,按同法测定。记录色谱图,测得黄体酮峰面积为519397,己烯雌酚峰面积497048,求黄体酮得百分含量。(101、8%)例

色谱柱:填充柱与毛细管柱检测器:

氢火焰离子化检测器(FID)电子捕获检测器(ECD)

气相色谱法(GC)色谱系统系统适用性试验:同HPLC法含量测定:以内标法为主,操作及计算方法同HPLC法第二节药品质量标准分析方法验证一、目得

证明所用得分析方法适合相应得检验要求。

(一)起草新药质量标准时(二)改变生产工艺时改变制剂处方修订原分析方法时二、用途三、需验证得分析项目鉴别检查:杂质定量或限度检查含量测定:原料药或制剂中有效成分及制剂中其她成分(如降解产物、防腐剂等)。四、验证指标准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性√(一)准确度

测定结果与真实值或参考值接近程度用百分回收率表示。

测定回收率R(recovery)得具体方法可采用“回收试验法”与“加样回收试验法”。

原料药:用已知浓度得对照品测定,或将本法测定结果与另一已建立准确度得方法得测定结果相比。1、含量测定方法得准确度制剂:采用在空白辅料中加入原料药对照品得方法。

如不能得到制剂得全部组分,可向制剂中加入已知量得被测物进行测定,或与另一个已建立准确度得方法比较结果。2、杂质定量测定得准确度向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物,可用本法测定结果与另一成熟得方法进行比较。数据要求:

规定得范围内,至少用9次测定结果评价,如制备三个不同浓度样品各测三次。(二)精密度同一均匀样品,经多次取样测定,所得结果之间得接近程度。标准偏差相对标准偏差*重复性同人、仪器、时间*中间精密度同室,但不同人、仪器、时间*重现性不同地方协同检验(三)专属性(选择性)

在有其她成分(杂质、降解产物、辅料等)可能存在时,该分析方法对待测组分准确而专属得测定能力。

鉴别反应、杂质检查、含量测定方法均应考察。

鉴别反应:用不含被测成分得供试品,应呈负反应。含量测定与杂质检查:试样中加入杂质或辅料,考察就是否干扰。加速破坏试验(强光照射、高温、高湿、酸碱水解、氧化),研究可能得降解产物与降解途径,检查色谱分离情况。(四)检测限LOD

样品中待测组分能被检测出得最低量。就是限度试验参数,无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。非仪器分析法-目视法能观察到实验现象得最低浓度为检测限仪器分析法

色谱法:按信噪比(S/N)3:1或2:1时得相应浓度或进样量为检测限。分光光度法:用空白样品进行分析,求得方法背景响应值得标准偏差S空。(五)定量限LOQ

样品中被测组分能被定量测定得最低量(应达到一定得准确度与精密度)。常用%、ppm、ppb表示非仪器分析法

用已知浓度得样品确定定量限,将测定结果计算准确度与精密度仪器分析法按信噪比10:1时得相应浓度或进样量为定量限NLOD:S/N=3LOQ:S/N=10检测限与定量限得区别在于

1、检测限就是以信噪比(2:1)来确定,而定量限就是以信噪比(10:1)来确定。

2、定量限规定得最低浓度应符合一定得精密度与准确度要求。

(六)线性

就是指在一定范围内,样品浓度与检测结果得线性关系。

线性回归

y＝a+bx相关系数

r越接近1越好(七)范围

指在达到一定精密度、准确度与线性得条件下,该方法适用得高低浓度或量得区间。适宜检测范围原料或制剂测试浓度的80%~120%含量均匀度70%~130%溶出量下限80%~上限120%标准曲线得高低浓度范围即为线性范围(八)耐用性

指测定条件稍有变动时,测定结果不受影响得承受程度。

就是衡量实验室与工作人员之间在正常情况下实验结果重现性得尺度。鉴别:仅需专属性、检测限、耐用性检测限

定量限含量与溶出度测定仅不需2、定量仅“检测限”视情况而定专属性检测限耐用性1、限量

仅需杂质检查验证内容得选择:定量限量耐用性范围线性定量限检测限专属性精密度+++－－++++－－－++－－++++－++++－－－++－－准确度含量测定杂质测定鉴别

项目内容举例

化学鉴别法-三氯化铁反应专属性:空白试剂,应显阴性反应检测限:减少供试品取样量耐用性:改变试液得浓度、用量、酸碱度、加热温度、反应时间等。

专属性:阿司匹林原料药进行加速破坏;阿司匹林粗品。线性与范围:0、04、0、08、0、10、0、12、0、16mg/ml系列标准溶液,以峰面积A为纵坐标,浓度为横坐标,回归方程y=a+bx。阿司匹林片得含量测定准确度与精密度:取对照品8、10、12mg各3份,分别置100ml量瓶中,各加入处方量得混合辅料,照拟定方法测定。计算回收率与精密度。耐用性:取粗品与降解产物溶液,改变色谱条件并于不同时间进样,主峰与杂质峰应能达到基线分离。溶液得稳定性。一、需要前处理得样品含金属得有机药物:金属原子不与碳原子直接相连,通常为有机酸及酚得金属盐或配位化合物。富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠、枸橼酸铋钾、葡萄糖酸锌、酒石酸锑钾等。有机金属药物:金属原子直接与碳原子以共价键相连,结合比较牢固。

第三节样品得前处理方法含卤素药物:含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者,而不包括某些有机药物得卤酸盐或氢卤酸盐。

1、酸水解后测定法难溶于水得含金属得有机药物,与适当得无机酸共热,可置换为可溶性盐。

如:硬脂酸镁与定量硫酸共沸、水解生成硬脂酸与硫酸镁,剩余得酸以氢氧化钠滴定。

Mg(C