单细胞测序技术在肿瘤和微生物中应用

吉林医药学院学士学位论文单细胞测序技术在肿瘤和微生物中的应用 单细胞测序技术在肿瘤和微生物中应用摘要细胞是人生命活动的基本单位。要了解生命活动的规律，就要对细胞进行更深入研究。近年来单细胞测序技术（Single-cellsequencingtechnology；SCS）的出现恰好克服了传统基因组学难以反映单个细胞遗传信息的缺陷。单细胞测序技术利用单细胞基因组测序、单细胞转录测序、单细胞表观转录组测序等方法对细胞进行更深入的研究，在临床被广泛应用。本文将介绍单细胞技术的研究进展及在临床上如肿瘤和微生物等方面的应用。【关键词】单细胞测序；高通量；细胞间异质性ResearchprogressandapplicationofsinglecellsequencingtechnologyAbstractCellisthebasicunitofhumanlife.Tounderstandthelawsoflife'sactivities,itisnecessarytodomorein-depthresearchoncells.Single-cellsequencingtechnologyinrecentyears;TheemergenceofSCShaspreciselyovercomethedefectthattraditionalgenomicsisdifficulttoreflectthegeneticinformationofasinglecell.Thesingle-cellsequencingtechnologyUSESsingle-cellgenomesequencing,single-celltranscriptionsequencing,single-cellepigenetictranscriptomesequencingandothermethodstoconductfurtherresearchoncells,whichhasbeenwidelyusedinclinicalpractice.Thisarticlewillintroducetheresearchprogressofsinglecelltechnologyanditsclinicalapplicationssuchastumorandmicroorganism.[Keywords]Singlecellsequencing;Researchprogress;Intercellularheterogeneity1引言近年来，随着细胞分子生物学技术的快速发展，单细胞测序技术的研究进展及临床应用逐渐成为医学界的焦点，并在临床疾病的诊断治疗中发挥重要的作用。2单细胞测序技术的发展近些年，随着单细胞测序技术成本的下降，更多的人通过更大的平台进行试验来获取生物体内的遗传信息。单细胞测序技术（singlecellsequencing，SCS）是指在新一代单个细胞测序的水平上，对DNA和RNA进行测序分析。此项技术可以更精确地了解每个细胞之间的表达情况，该技术的出现也克服了传统基因组学研究的短板，可以通过下一代测序（nextgenerationsequencing，NGS）方法来测序单个细胞的基因组。人类基因组、癌症等基因测序大多是从多个细胞中提取DNA来进行的，但细胞间存在差异，实验的结果通常受影响。传统的测序方法，也难以培养样品量稀少的细胞、如人体的微生物、早期发育阶段的胚胎细胞及组织微阵列。因此传统方法存在着一定的局限性。有了这项技术我们就能精准的测量到细胞内的基因表达水平，而且能检测到非编码RNA和微量基因表达因子［1］。在2009年，汤等通过改进扩增方法，首次报道单细胞转录组的测序分析。后来，单细胞mRNA深度测序文库构建方法的也不断优化、通量不断提高[19]。2011年Navin等使用流式细胞分离，利用200个癌细胞来研究癌症的进化，并被“自然方法学”杂志评选为未来几年值得关注的一项技术。测序技术经历了从低通量到高通量的改变。深圳华大基因率先建立单细胞外显子测序技术，已应用于骨髓增殖性肿瘤[3]和肾透明细胞癌[2]的研究。单细胞测序技术在探究胚胎发育和肿瘤发生发展等方面被广泛应用。本文将介绍单细胞分离常用的方法，并阐述单细胞测序技术在瘤细胞上、微生物等方面的应用。3单细胞测序技术的原理单细胞测序技术分为单细胞基因组测序、单细胞转录测序、单细胞表观转录组测序。为获取足够多的DNA，人们可在测序前利用全基因组扩增技术，将DNA扩增。全基因组扩增技术又可分为简并寡核苷酸引物聚合酶链反应，多重置换扩增法和多重退火环状循环扩增法。不同扩增方法所利用的不同的聚合酶，所达到的效果也不同；单细胞转录组测序需先将mRNA逆转录成cDNA，再对cDNA进行扩增。其扩增方法也有很多如末端加尾法、Smart⁃seq、Cell⁃seq和独特分子识别标识的全转录组的方法；单细胞表观转录组测序是表观遗传学在基因水平上的研究，其研究的方法也有很多种。单细胞测序需对目的细胞进行分离、扩增、和测序。下图展示了单细胞测序技术的原理。图2-14单细胞分离的方法分离细胞可将细胞群通过连续稀释来获取单细胞，这种方法叫做连续稀释法。此方法简单但不够准确；还有可以分离样本中细胞样种类较少的显微操作技术法，这种方法主要用来分离一些难以培养的微生物细胞［4，5］；当目的细胞较分散，且数目少时，可采用激光捕获显微切割术(LCM)来分离单个细胞；微流控芯片技术可在微米级尺度上忽略流体的惯性，从而控制(细胞)流体的流动，来分离单细胞［6］。在实验中，可以将微流控装置结合到生物芯片上［7，8］来减少流体用量、并提高样品浓度。荧光激活细胞分选技术可将单个细胞按不同特征分选到孔板中，这项技术也是目前较常用的。人们可根据实验要求选择不同的分离方法。其优缺点如下表：表1几种常用的单细胞分离方法

分离方法优点缺点连续稀释法操作简单.成本低分离错误或细胞丢失显微观察法激光捕获显微切割术拉曼镊子法荧光激活细胞分选术微流控技术免疫磁珠分离法操作简便、成本低:可视化操作保持细胞结构:保留位置信息高特异性高灵敏度高通量:操作灵活:样品需求量小简便、快速、成本低低通量,细胞损伤低通量,损伤细胞核应用范围有限用量大,细胞损伤成本高暂无说法 5单细胞测序技术的应用5.1单细胞测序技术与肿瘤基因恶性肿瘤细胞通过基因突变产生新的致病性表型，这一致病性表型的出现可以更好的适应宿主体内的肿瘤环境，因此肿瘤是一种具有高度异质性的疾病，其内部含有不同状态的肿瘤细胞。单细胞测序技术可以揭示肿瘤细胞发展过程中的基因变异。Ni等［9］利用单细胞测序技术对一种肺癌亚型的循环肿瘤细胞进行测序，发现病人一些基因拷贝数的变异与耐药相关联，且一些基因拷贝数变异也与转移有关；肿瘤是一种高度异质性的疾病，内部含有状态不同的肿瘤细胞，有些肿瘤细胞异质性的存在多半是因为存在肿瘤干细胞。最近，Hou［10］等通过应用单细胞三重组学测序技术，对来自肝癌病灶组织中的肿瘤细胞进行分析。根据分析结果发现拷贝数变异和甲基化水平都较高，细胞更易发生转移。单细胞测序技术也可以研究肿瘤细胞不同亚型之间的基因序列有何差异。Venteicher［11］对IDH两种不同类型病人进行测序，发现IDH的突变胶质瘤来源于同一祖细胞。2019年，Zhang等[20]发现肝癌内部免疫微环境的免疫细胞可分为3个细胞亚群，各亚群细胞的代谢特征和趋化因子的表达水平都不同。5.2单细胞测序技术与结核病

近年来，结核病的治疗难度逐渐增加，其主要原因是耐药型结核菌的种类不断增多。采用全基因组测序检测结核病菌，可以大概了解到耐药型结核病传播的危险因素，有了这项技术，结核病的治疗得到了很大的改善。耐药型结核菌的增加对结核病治疗具有很大的影响，高谦团队通过将中国某地区的结核病人作为研究对象，确定耐药结核病的传播模式以及传播途径。目前，在已发现的病人中，治愈率小于40%[12,13]，所以存在感染性高，治愈率低的特点。总而言之，常规的方法无法满足检测需求。所以应用单细胞测序技术对单个细胞进行全基因组测序，将对结核病的诊断和治疗带来重大意义。5.3单细胞测序技术与微生物微生物中具有DNA和RNA含量少、扩增难度大的特点，因此绝大多数微生物都无法在实验室进行培养。因此传统方法很难了解到微生物的遗传信息。利用单细胞测序技术检测微生物，就为微生物的研究提供了更大的可能。单细胞测序技术在研究病毒方面具有应用价值。Kearney等［14］对艾滋病病毒HIV-1类型进行单细胞测序，分析该病毒遗传的多样性和适应性。还有一些人利用单细胞基因组学对细菌进行靶向测序，这一方法阐述了细菌门内和门间关系，使得生态系统在微生物水平上的提升。Boltz等［15］采一种超灵敏的单细胞测序技术（UltrasenaitiveSingle-GenomeSequencing，uSGS），快速检测艾滋病病毒的稀有突变体。目前单细胞测序技术已在多种病毒上进行研究［16］。但由于微生物细胞体积相对来说小很多，因此对于微生物细胞中的单细胞测序仍然存在较大的挑战［17］。5.4单细胞测序技术与辅助生殖单细胞测序技术已成为胚胎植入前遗传学诊断和胚胎植入前遗传学筛查的新方法。此方法可以对试管婴儿在植入人体前进行遗传学分析，有利于全面地了解胚胎遗传学信息，帮助人们选择胚胎是否进入子宫，降低植入次数及防止流产的发生。此外，也可通过此项技术选择健康的胚胎进行移植，从而降低先天性遗传疾病的发生。6总结与展望随着单细胞测序技术的研究信息技术的发展，单细胞测序技术已不断地被完善以及应用到生物学的研究中，也为研究细胞、追踪细胞变化规律提供了帮助。相信借助此项技术可以解决很多重要的问题，也可以为定量细胞种类等问题的研究打下基础，成为定量研究细胞的工具。相信在未来几年，单细胞测序技术的研究和检测会更加全面和细致，也会被应用到越来越多的领域，从而发挥更大的作用。参考文献朱翔，浦春，武其文．单细胞转录组测序的方法原理及应用［J］．分子诊断与治疗杂志，2016，8(1):61-65．Xu

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