当归补血汤对血管性痴呆大鼠学习记忆及SOD,MDA,GSH-PX

当归补血汤对血管性痴呆大鼠学习记忆及SOD,MDA,GSH-PX的影响摘要目的研究当归补血汤（DGBXT）对VD大鼠学习记忆能力，以及对抗氧化物质SOD和GSH-PX活性，及MDA含量的影响。方法VD大鼠模型，采用Wistar大鼠颈总动脉单侧永久性结扎法。术后7天，用Morris水迷宫筛实验，选出造模成功的40只大鼠，分为模型组、假手术组、DGBXT中剂量和高剂量组、及

Piracetam组。灌胃给药30天后，用Morris水迷宫实验进行学习记忆能力检测，大脑皮层组织进行抗氧化SOD和GSH-PX活性，及MDA含量测定。结果治疗后DGBXT高、中剂量和Piracetam组找到平台的时间均显著小于模型组（P＜0.05）。与模型组比较，DGBXT高、中剂量和Piracetam组中MDA含量显著降低，SOD和GSH-PX活性显著升高，差别在统计学上存在意义（P<0.05）。结论DGBXT可通过提高抗氧化物活性，降低脂质发生过氧化反应产物，改善大鼠学习记忆能力，治疗血管性痴呆（VD）。关键词血管性痴呆当归补血汤学习记忆SODGSH-PXMDA血管性痴呆（VD）是一种由于缺血性和出血性中风，以及慢性低灌注而导致的痴呆。是由脑血管疾病引起的一种学习和认知功能障碍[1]。此种疾病使具有认知、记忆和行为的大脑功能区受到损伤。血管性痴呆会影响患者的记忆和空间认知能力，进而影响患者的生活质量。目前已有实验证明[2]，血管性痴呆的发病机制之一与机体的氧化应激反应有关。当归补血汤主治血虚发热证，还可补气生血，血管性痴呆多数表现为血虚气弱，正是当归补血汤的适应证[3]，并且赵欢等通过临床试验证明用当归补血汤治疗血管性痴呆优于传统补肾法治疗[4]。有研究表明，当归补血汤对血管性痴呆有治疗作用，但具体治疗机制并无相关研究。本文采用改良后的颈总动脉单侧永久性结扎法来造成大鼠血管性痴呆模型，通过Morris水迷宫实验及大脑皮层组织内抗氧化物质及过氧化产物含量和活性的测定，客观的研究当归补血汤对血管性痴呆的治疗机制，以便为此方的临床应用提供实验性依据。仪器和材料分类名称批号生产厂家当归伞形科植物当归Angelicasinensis（Oliv.）Diels的根药品黄芪豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的根黄河药市吡拉西坦胶囊190409陕西白鹿制药股份有限公司丙二醛(MDA）测试盒20200321试剂SOD（超氧化物歧化酶）测试盒20200325南京建成生物工程研究所谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）测试盒20200330仪器Morris水迷宫MT-200成都泰盟科技有限公司酶联仪BenchmarkPlus美国伯乐公司动物健康成年雄性Wistar大鼠80只实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2015-0005，实验动物质量合格证许可证号：SCXK（甘）2015-002甘肃中医药大学实验动物中心2.方法2.1药物制备及给药当归补血汤水煎液：采用2015版《中华人民共和国药典》与《内外伤辩惑论》确定比例为当归:黄芪=1:5，根据人与动物体表面积折算给药量[2]。阳性药物：吡拉西坦胶囊用蒸馏水配成浓度为0.324g/kg[5]。根据水迷宫定位航行实验结果筛选，造模成功的32只大鼠随机分为四组，外加8只假手术组大鼠，给药量如下图所示：组别阳性组中剂量组高剂量组模型组假手术组剂量（g/kg/d）0.3243654等量生理盐水等量生理盐水每天称重，调节给药量，食水正常，连续给药30天。2.2模型制备根据顾静[5]等的研究进行VD大鼠模型制备：术前12h禁水食，i.p.5%chloralhydrate麻醉后，腹腔注射2mg/kg的硝普钠降压，剃去颈部鼠毛，消毒，打开颈部手术区皮肤，分离出两条颈动脉，同时夹持两条颈动脉，10分钟后松开夹持器，10分钟后再次夹持，反复三次，最后一次结扎右侧颈总动脉。假手术组进行创伤性损伤不结扎颈总动脉，其余步骤同模型组。2.3Morris水迷宫实验2.3.1模型筛选待术后8天，伤口愈合，食水正常后开始筛选。实验前，将四个颜色形状均不相同的标记物分别贴于水迷宫水面以上内壁四个象限，平台在水面2～3厘米以下，水温控制在18～22℃之间[6]，墨汁染色。实验时将大鼠分别从非目的区域头朝池壁放入，记录模型大鼠在2分钟内找到平台的时间，并要求其在平台上停滞15秒。若大鼠不能在2分钟内找到平台，引导其找到平台，并停滞平台15秒，时间按2分钟记录，让其根据三个区域标记物进行学习记忆，训练结束后立即取出并擦干，三个区域步骤相同。记录找到平台的时间数据，连续进行五天，每天一次。五天试验结束后，评价造模成功的标准：（模型组大鼠找到平台时间的均值的总和的均值）-（假手术组大鼠找到平台时间的均值的总和的均值）/每只大鼠找到平台的时间的平均值，若比值大于20％则判定为痴呆大鼠，造模成功[7]。2.3.2行为学检测连续给药30天，将模型组、假手术组、DGBXT高和中剂量组、以及Piracetam组大鼠再次进行Morris水迷宫共三个区域的定位航行实验，每天一次，不间断地进行5天，记录每天各组大鼠找到平台的时间。3.大脑皮层抗氧化指标检测大鼠i.p.10%chloralhydrate0.3ml/100g麻醉后，大鼠头部置于冰袋上，取出海马体将大脑皮层分为4份，分装于冻存管，立即置于液氮冷冻，后转移至-80℃冰箱保存备用。准确称取大鼠大脑皮层组织，按1：9的比例加入预冷的生理盐水，应用酶促反应、二硫代二硝基苯甲酸法和硫代巴比妥酸法，根据试剂盒操作的说明测定超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，以及丙二醛含量。4.数据统计方法5.结果5.1各组大鼠定位航行实验结果潜伏期的长短可以非常直接地反映出各组大鼠，学习记忆能力的强弱。潜伏期越短说明大鼠学习记忆能力越强。在定位航行1-5d训练实验中，模型组潜伏期显著长于假手术组（P＜0.05）（表1），证明VD模型造模成功；与模型组比较第5d，Piracetam组、DGBXT高和中剂量组潜伏期显著均低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），证明各给药组大鼠认知学习记忆能力提高。与Piracetam组比较第5d，模型组与之有显著性差异（P<0.01），说明阳性药有治疗效果，DGBXT高剂量与之比较潜伏期显著降低，DGBXT中剂量组与之无统计学差异，说明疗效近似。具体数据见表1，各组大鼠第五天实验时的运动轨迹见图1。表1Morris水迷宫定位航行找到平台的时间结果(x±S，n=8)组别第1天第2天第3天第4天第5天假手术组13.52±6.11△△12.78±5.10△△14.00±4.06△△9.92±3.87△△8.41±3.15△△#模型组33.33±6.16**##32.24±4.60**##29.44±6.30**##27.89±4.88**##26.02±9.79**##高剂量17.83±5.85△△15.00±6.99△△12.67±7.35△△11.61±6.26△△9.89±8.59△△#中剂量20.83±7.24*##15.63±7.55△△12.52±5.93△△11.10±5.99△△11.83±8.00△△阳性12.13±5.45△△11.74±5.76△△10.00±4.92△△8.48±2.71△△14.00±5.26△△注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01，与阳性药比较#P<0.05，##P<0.01假手术组模型组高剂量组中剂量组阳性组图1.定位航行第五天各组大鼠运行轨迹图5.2SOD、MDA和GSH-PX活性检测与假手术组比较，模型组丙二醛含量显著增高133.2%，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性分别显著降低8.1%和50.1%（P<0.01），说明VD模型大鼠抗氧化能力降低。与模型组比较，Piracetam组、DGBXT高、中剂量组的丙二醛含量分别下降20.5%、36.5%和38.4%；超氧化物歧化酶活性分别增强10.5%、14.4%和23.9%；超氧化物歧化酶活性分别显著性增强133.5%、253.6%和169.7%（P<0.01）说明各给药组均具有抗氧化作用。与Piracetam组比较，DGBXT中、高剂量两组丙二醛含量降低22.5%和20.1%，超氧化物歧化酶活性增强3.5%和12.1%，谷胱甘肽过氧化物酶活性增强51.5%和15.5%，与之有差别，在统计学上存在意义（P<0.01），说明中药疗效好于阳性药物。结果见表2，变化见图3.表2当归补血汤对血管痴呆性大鼠脑皮质MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影响(x±S，n=8)组别剂量（g/Kg）MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）假手术组—3.62±1.30△△##195.60±12.58△56.06±3.52△△##模型组—8.44±0.31**△△##179.70±6.90*##27.96±5.79**##高剂量组545.36±0.54**△△##205.54±17.77△△98.87±5.80**△△##中剂量组365.20±0.69**△△##222.71±15.34**△△##75.40±5.61**△△##阳性组0.3246.71±0.54**△△198.64±18.10△△65.28±4.56**△△注：与假手术组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01；与阳性药物组比较#P<0.05，##P<0.016.讨论随着人口老龄化程度逐年加深及血管性疾病发病率的增高，血管性痴呆(VD)发病率也随之升高。加强对VD疾病的深入研究，寻求更好的治疗方法和药物，具有重要的医学影响和社会意义。西医相对注重症状治疗，提高认知功能和管理水平，这主要是基于药物管制。临床经验表明，在短期内取得良好疗效是必要的，但是长期使用特别容易产生药物依赖，病情还易复发，药物产生的毒副作用对患者身体也会有伤害，患者及家属依从性差，致使大部分患者在治疗过程中由于药物毒副作用而不得不间断服药，甚至停药影响此类疾病的效果[8]。并且研究表明，西药的单纯治疗只能使患者临床症状得到改善，并不能使VD疾病得到本质上的治疗[9]。VD在传统中医学中表现特征为痴呆、傻笨和记忆力下降，被称为“呆病”，属于肾虚血瘀型疾病，其特点是本虚标实，治疗上通常注意滋阴养阳、活血化瘀、通络解毒。近年来，中医药治疗血管性痴呆已取得了一定疗效，并逐渐成为了研究的热点。黄芪具有补气升阳、益卫固表之功效，可以改善血管性痴呆大鼠海马神经元形态结构，降低血脑屏障损伤程度，增强免疫功能[10]，当归可通过抑制MDA产生，提高GSH-PX的活性等抗氧化作用治疗VD疾病[11]。VD疾病发生过程中，氧化应激反应起到重要作用[12]。大量氧自由的积累，会使细胞膜脂质过氧化加速，致使神经元死亡及细胞膜损伤[13]。超氧化物歧化酶（SOD）在清除体内过多的氧自由基方面起着很强的作用。谷胱甘肽通过谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）催化分解为氧化的谷胱甘肽，使毒性过氧化物转化为无毒的羟基化合物，使自由基对组织和细胞膜的损伤减轻[14，15]。丙二醛（MDA）是脂质过氧化产物之一，是评价氧化应激常用指标，对体内氧自由基（Oxygen

Radical

，ROS）及氧化应激（OxidativeStress，OS）程度评价具有非常的重要意义。DGBXT低剂量并未通过预实验，故本实验只采用DGBXT高、中剂量。本研究结果显示，与模型组比较，DGBXT高、中剂量组治疗后大鼠定位航行找到平台的时间（潜伏期）显著降低，丙二醛含量，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于模型组，说明当归补血汤治疗血管性痴呆能够通过增强SOD和GSH-PX活性，降低丙二醛含量，有效降低氧化应激过氧化物丙二醛对脑组织的损伤，使VD大鼠认知、学习和记忆能力得到改善。为临床应用治疗VD疾病，及VD新药的开发提供理论依据。参考文献[1]赵见文,王志勇,闫国强,等.血管性痴呆中医药实验研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2015,17(11):128-130.[2]BennyA,ThomasJ.Essential0ilsasTreatmentStrategyforAlzheimer'sDisease:CurrentandFuturePerspectives[J].PlantaMed,2018,85(3):239-248[3]高晓兰,朱增强,陈彦文,等.当归补血汤加味对血管性痴呆大鼠的脑保护作用研究[J].西部中医药,2013,26(04):22-25.[4]赵欢,杨东东,郭强,等.基于“精-血-髓一体论”观察当归补血汤治疗血管性痴呆临床研究[J].陕西中医2016,37(10):1314-1315.[5]顾静,李海龙,杨长生,等.血管性痴呆大鼠模型制作方法的改良[J].中国实验动物学报,2015,23(06):634-638.[6]赵瑛,高伟莹,余群星,等.基于Morris水迷宫的小鼠学习记忆规律研究[J].哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2020,36(02):131-136+141.[7]张杰,马云枝,沈晓明,等.复智胶囊对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力改善的作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(02):128-132.[8]于筝,周东升.补肾益智方联合多奈哌齐片治疗阿尔茨海默病的疗效及对Aβ、GSH-Px、SOD及MDA的影响[J].广东医学,2019,40(12):1798-1802.[9]YokoShigemoto,DaichiSone,NorihideMaikusa,NobuyukiOkamura,ShozoFurumoto,YukitsukaKudo,MasayoOgawa,HarumasaTakano,YumaYokoi,MasuhiroSakata,TadashiTsukamoto,KoichiKato,NorikoSato,HiroshiMatsuda.Associationofdepositionoftauandamyloid‐βproteinswithstructuralconnectivitychangesincognitivelynormalolderadultsandAlzheimer’sdiseasespectrumpatients[J].BrainandBehavior,2018,8(12).[10]AndreaTumminia,FedericaVinciguerra,MiriamParisi,LuciaFrittitta.Type2Diabetes