独一味主要药用成分含量随海拔的变化

独一味主要药用成分含量随海拔的变化摘要目的：对不同海拔梯度独一味不同部位的主要药用成分化合物进行含量检测，优选出适合独一味生长的海拔高度，为独一味的人工种植提供数据理论支撑。方法：使用回流提取法、HPLC法，对不同海拔梯度的独一味地上部位主要药用成分进行含量分析。结果：对3个海拔梯度独一味的地上样品图谱进行评价，确定了3467m海拔该药材的主要药用成分含量更高。为该药材的人工种植与开发提供科学依据。结论：本研究更准确、科学的评价了不同海拔因素对独一味生长以及其主要药用成分的影响，优选出最适合独一味生长的海拔高度，为该药材的人工栽培种植提供科学依据。关键词：独一味、HPLC、环烯醚萜苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯ThecontentofthemainmedicinalingredientsvarieswiththealtitudeAbstractObjective:Thecontentdetectionofthemainpharmaceuticalcomponentcompoundsofdifferentpartsofdifferentaltitudegradientsisselectedtoprovidedatatheoreticalsupportforthecultivationofuniquetaste.Method:UsingrefluxextractionmethodandHPLCmethod,thecontentanalysisofthemainmedicinalcomponentsofthesingle-tasteabove-groundareaofdifferentaltitudegradientswascarriedout.Result:Theabove-groundsamplemapof3altitudegradientswasevaluatedandthecontentofthemainmedicinalingredientsofthemedicinalmaterialwashigherat3467maltitude.Itprovidesscientificbasisfortheartificialcultivationanddevelopmentofthemedicinalmaterial.Conclusion：Thisstudymoreaccuratelyandscientificallyevaluatestheeffectsofdifferentaltitudefactorsonthegrowthofuniquetasteanditsmainmedicinalingredients,andpreferablyselectsthealtitudemostsuitableforthesingle-tastegrowth,whichprovidesascientificbasisforthecultivationofthemedicinalmaterial.Keywords:Lamiophlomisrotate(Benth.)Kudo;HPLC;iridoidglycosides;sesamoside;shanzhisidemethylester;8-O-acetylshanzhisidemethylester独一味Lamiophlomisrotata(Benth．)Kudo为是唇形科独一味属唯一物种。为藏、蒙、纳西族常用药材，药材表面枯黄或褐黄，质地坚硬、干枯、气腥臭，性甘，归肝经，功能为活血止血、祛风止痛，始见于藏医药经典文献《四部医典》等，近年来也有学者通过研究发现独一味还是具有一定研究价值的抑制肿瘤细胞增殖的一种天然药物REF_Ref39916432\r\h[1]，其制剂种类多样，具有非常广阔的应用前景。但独一味药材基本来源于野生资源，由于其近年来需求激增，野外资源日益紧缺，被列为一级濒危藏药。为保护野生独一味资源，自2010版中国药典将其入药部位由全草修订为地上部分。现代药理研究表明，独一味的有效活性成分主要有3类成分：环烯醚萜苷类，具有良好的镇痛、止血、促凝血作用；苯乙醇苷和黄酮类均具有较好的镇痛作用REF_Ref39331869\r[2]REF_Ref40374730\r\h[3]。本文选取2015版中国药典规定的环烯醚萜苷类活性成分中的山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯为研究对象。不同海拔梯度自然环境迥异，植被类型差异巨大，气压温度因海拔梯度而有所影响，年均温度、年均降雨量也有所不同，而野生独一味药材资源主要集中分布在甘肃，西藏等青藏高原带，尤以甘南州玛曲县、青海东南部最多，独一味的生长海拔范围为3900m-5100m，甘南州集中分布在3600m-3870mREF_Ref40386779\r\h[4]。本文所采样品均属于甘南地区，甘南地区属于青藏高原、黄土高原、陇山过渡带，气候特点为高海拔、高寒、缺氧、大气稀薄、日照时间长、昼夜温差大、年均降雨量400-800mm，平均气温1-13℃，草地面积占甘南州总面积的70.28%，藏药种类多，资源丰富REF_Ref40374747\r\h[5]。是黄河、长江上游的生态屏障，具有重要的水源涵养能力REF_Ref40376399\r\h[6]。本文以野生独一味为研究对象，通过野外取样和鲜药收购商处购买,采用HPLC法分析2015版药典规定检测的主要有效成分环烯醚萜苷类两种具体成分山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯的含量。探讨3个海拔高度因素对独一味不同部位药效成分含量的影响，此次实验旨在为今后野生独一味的人工引种栽培提供数据理论依据。材料表SEQ表格\*ARABIC1实验仪器名称厂家型号高效液相色谱仪Aglent有限公司1100Ⅱ型紫外-可见分光光度计北京莱伯泰科仪器有限公司UV8100A型万分之一电子天平瑞士梅特勒-托利多公司AL204型超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司SB25-12DTD型恒温水浴锅西安超杰仪器有限公司HH-6型真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司DZF-6090型低速大容量离心机湘仪离心机仪器有限公司DD-5M型表SEQ表格\*ARABIC2实验标准品名称厂家批号山栀苷甲酯成都曼思特生物科技有限公司型8-O-乙酰山栀苷甲酯成都曼思特生物科技有限公司型表SEQ表格\*ARABIC3样品采集表编号Number地点Locale来源Source海拔（m）Elevation群落组成Communitycomposition123阿万仓Awancang阿万仓Awancang曼日玛Manrima野外采摘Collectedinthefield野外采摘Collectedinthefield购买Buy374934673513金露梅Potentillafruticose、珠芽蓼Polygonumviviparum、毛莨Ranunculusjaponicus、甘松Nardostachysjatamansi秦艽Gentianamacrophylla、黄缨菊XanthopappussubacaulisC、鹅绒委陵菜Potentillaanserina、禾本科植物Gramineae独一味药材来自甘南州玛曲县阿万仓以及曼日玛乡，共三个不同海拔梯度（其海拔高度为手持GPS导航仪测定），各相差一百米左右。由兰州大学杜国祯教授鉴定为唇形科独一味属独一味L.rotata。方法与结果统计方法采用SPSS20.0软件（SPSSInc.,Chicago,IL）进行数据分析，采用一般线性模型（GLM）的one-wayANOVA分析海拔梯度对独一味的药用成分的影响。不同因素间的平均值差异利用Tukey’s检测法。色谱条件表格SEQ表格\*ARABIC4色谱条件项目名称规格色谱柱检测器TSK-GEL

ODS100V4.6mmx250mm，5μmVWD流动相梯度洗脱流速柱温进样量山栀苷甲酯检测波长8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)0～15min，12%;15～20min，12%A～20．5%A;20～30min，20.5%A1.0mL·min-125℃10μL235nm235nm按照上述条件，将样品的乙腈提取物与对照混合液进行测定，各成分分离度良好，见图1。图表图表SEQ图表\*ARABIC11:山栀苷甲酯2:8-0-乙酰山栀苷甲酯A混合对照品B样品地上部对照品溶液的制备图表图表SEQ图表\*ARABIC2对照品溶液制备对照品山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯分别精密称取2.3mg、2.4mg置于10ml容量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。山栀苷甲酯230mg/ml、8-O-乙酰山栀苷甲酯240mg/ml的混合对照品溶液A精密吸取1ml置于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度标准混合溶液B图表SEQ图表\*ARABIC3图表SEQ图表\*ARABIC3供试品溶液的制备独一味干燥药材粉碎过60目筛精密称取0.6000g置于100ml磨口三角瓶中，加70%甲醇25ml，称定装置重量水浴锅回流提取1h，冷却后补重，摇匀静置0.45μm微孔滤膜过滤，取其续滤液样品溶液对照品线性关系考察精密吸取标准混合溶液0.1μL、0.5μL、1.0μL、5.0μL、10μL、20μL。按照色谱条件分别进样，以进样量为横坐标（μL），对应色谱峰为纵坐标进行线性拟合，计算得到两种化合物的回归方程和线性范围(REF_Ref41035580\h表格5各成分的回归方程)表格SEQ表格\*ARABIC5各成分的回归方程成分回归方程R2线性范围（μL/ml）山栀苷甲酯Y=10.579x+5.08690.99982.4—1208-O-乙酰山栀苷甲酯Y=13.179x-0.295911.15—57.5精密度试验精密吸取样品（随机任选一份）溶液1.0μL，连续进样6次，记录色谱峰面积，计算质量分数。得到山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积的RSD为0.48%、1.74%。结果表明仪器精密度良好。表格SEQ表格\*ARABIC6精密度试验编号样品名称山栀昔甲酯（mg/g）8-0-乙酰山栀昔甲酯（mg/g）14L-10.5010.06624L-20.5020.06734L-30.5040.06844L-40.5080.06954L-50.5030.06764L-60.5030.067稳定性试验精密吸取样品（之前所选样品）溶液于0h、2h、4h、8h、16h、24h进样分析，每次10μL，记录峰面积，结果山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积的RSD分别为0.87%、2.43%，表明供试品溶液中活性成分在24h内稳定。表格SEQ表格\*ARABIC7稳定性试验编号样品名称山栀昔甲酯（mg/g）8-0-乙酰山栀苷甲酯（mg/g）14L-OH0.4990.06824L-2H0.5080.06434L-4H0.5040.06444L-8H0.5020.06454L-16H0.5020.06764L-24H0.5110.067重复性试验取同一样品3份，按照2.2制备样品溶液，按照2.1色谱条件测定峰面积，得山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积的RSD分别为0.76%、0.71%，表明方法重复性良好。表格SEQ表格\*ARABIC8重复性试验编号样品名称山栀昔甲酯（mg/g）8-0-乙酰山栀昔甲酯（mg/g）16L-111.5353.85226L-211.4593.83136L-311.6333.885加标回收率实验取已知化合物含量的三份不同样品，精密称定0.60g，分别精密加入已知浓度标准溶液5mL，按照2.2制备样品溶液，精密吸取10μL注入色谱仪测定。得山栀昔甲酯、8-0-乙酰山栀苷甲酯回收率RSD分别为1.20%、1.27%。表格SEQ表格\*ARABIC9山栀昔甲酯、8-0-乙酰山栀苷甲酯加标回收率编号样品名称山栀昔甲酯回收率%8-0-乙酰山栀苷甲酯回收率%12L+99.024%99.729%24L+101.032%101.242%36L+101.166%102.275%供试品含量表格SEQ表格\*ARABIC10不同海拔独一味地上部分主要药用成分含量2.160海拔（m）山栀苷甲酯8-O-乙酰山栀苷甲酯346710.398、10.380、10.4032.160、2.166、2.08035132.979、2.990、2.9801.322、1.300、1.31637490.497、0.498、0.5020.072、0.066、0.075讨论本实验利用HPLC通过对不同海拔地区的独一味不同部位有效成分含量测定，通过对数据及其色谱图的研究分析，得出独一味在3467m海拔梯度的有效成分与其他海拔地区独一味有效含量有显著性差异，3467m海拔梯度独一味主要药用成分显著高于其他两个海拔梯度。另外发现随着海拔梯度的上升，独一味中主要药用成分的含量成梯度显著降低，意味着在独一味的海拔生长范围内，海拔越低其主要药用成分含量急剧上升，海拔降低约三百米，独一味主要药用成分含量上升一个数量级。其中山栀苷甲酯含量上升约20倍，8-O-乙酰山栀苷甲酯含量上升约30倍。以上试验数据表明不同海拔梯度独一味药用成分含量有显著性区别，从所采样品来看，3467m独一味植株整体明显大于3513m、3749m。随着海拔梯度上升，独一味根部变短变细，叶片面积变小，由大菱状圆形变为小扇形，其轮伞花序数量急剧减少。可能是因为随着海拔升高、紫外线强度上升、氧气含量下降、水分减少、平均气温下降，植物为了更好的适应困难环境而在形态上发生变化。金兰等研究表明在独一味生长海拔范围外人工移栽不能传粉以及结实。而本研究数据表明虽然独一味在在3400米到3800米均有分布，但是生长范围内，低海拔独一味药用成分含量更高，这为独一味的人工栽培研究有一定的指导意义。

致谢文行至此处便将要结束，也意味着自己在甘肃中医药大学四年的学习生活即将落幕，始于2016年初秋，终于2020盛夏。时间仿若白驹过隙，只是忽然而已。回首四年，令人百感交集，在甘中校园里，曾有过困惑，有过欢乐，有过迷茫与彷徨。但也有过坚定，有过认可与关怀。四年里留下的是青春与些许收获，纵然有万般不舍，但内心仍心怀感激。在本论文完成之际，首先我要感谢我的指导老师谢田朋老师，其次还有在实验与论文方面帮助过我的老师与师兄师姐。在此次论文的编写过程中，纵然时间紧迫，但谢老师对课题组的我们仍然给予了无微不至的指导，可谓是亦师亦友。经师易遇，人师难遭。其次我想感谢大学期间我所遇到的所有老师以及所有同学，因为你们，让我变得完整，让我的大学生活不在留有遗憾。因为你们让我明白每份经历都是我的宝贵财富。2020年是属于英雄的一年，周遭的老师与前辈以血肉之躯向我辈树立典范，在疫情面前无人退缩，一封封请愿书向我们昭示着他们为国、为人民甘愿赴汤蹈火，纵然牺牲一切也在所不惜的勇气与决心。他们是我学习的榜样。希望自己日后踏入社会之后可以像各位前辈一般能够用自己的所学去为社会做力所能及的贡献。凌冬已过，皓月长明，愿山河无恙，国泰民安。愿莘莘学子前程似锦，未来可期。参考文献独一味有效成分的提取及其抗肿瘤作用比较[J].吴婧,杜鹃,李勇.中国药物与临床.2019,19(16):2730-2731梅之南,尹雪霏,丁昕,熊慧,郑亚男.独一味化学成分的研究(Ⅰ)[J].中南民族大学学报(自然科学版),2014,33(04):57-60.潘正,高运玲,张涛,邓杰.HPLC法测定独一味根中环烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草药,2011,42(02):279-281.李燕,王昕.甘南藏区植物独一味生长适宜性分析研究[J].农业科技与信息,2017(07):35-36.李彪,卢新生,巩红冬,马国辉.青藏高原甘南地区唇形科藏药植物资源调查研究[J].牡丹江师范学院学报(自然科学版),2016(04):43-46.杨淑霞,张强,杨青,陆荫,程慧波,王婷.2018年甘南藏族自治州草原生态系统状况调查[J].环境研究与监测,2019,32(03):1-6.李晓青.黄河源区玛曲极端气候变化及其生态环境影响研究[J].环境保护,2017,45(05):45-50.金兰,韩鸿萍,丁莉,杜雷,李锦萍,罗桂花.青海独一味在低海拔移栽地传粉及结实率的研究[J].种子,2012,31(09):41-43+47.张涛,张汝学,贾正平.藏药独一味的制剂研究进展[J].甘肃医药,2014,33(12):908-911]拉巴次仁,张丹,叶凡,邝婷婷,赖先荣.中国民族