DB1302∕T 353－2013 平菇原生质体脱毒技术规程

B39

DB1302

唐山市地方标准

DB1302/T353—2013

平菇原生质体脱毒技术规程

2013-07-01发布2013-08-01实施

唐山市质量技术监督局发布

DB1302/T349—2013

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由唐山市质量技术监督局提出。

本标准起草单位：唐山师范学院。

本标准主要起草人：范永山、张运峰、张淑红、李小六。

I

DB1302/T349—2013

平菇原生质体脱毒技术规程

1范围

本标准规定了平菇原生质体脱毒的实验室准备、原生质体制备、原生质体再生、鉴定。

本标准适用于平菇菌种的原生质体脱毒。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅标注日期的版本适用于本

文件。凡是不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T12728-2006食用菌术语

GB19172-2003平菇菌种

GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测

NY/T528-2010食用菌菌种生产技术规程

NY/T1743-2009食用菌菌种真实性鉴定RAPD法

NY/T1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应

JJG552-1988血细胞计数板试行检定规程

DB1302/T306-2011无公害平菇栽培技术规范

3术语和定义

GB/T12728-2006中确定的及下列术语和定义适用于本文件。

3.1平菇

指层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属的主要品种。

3.2初始菌株

保存于PDA斜面或其它适合培养基内的平菇带毒菌株。平菇病毒病病原和症状见附录A。

3.3原生质体

脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。

3.4稳渗剂

用于维持原生质体形状和功能的渗透压稳定剂。

3.5再生菌株

指原生质体经过培养获得的单菌落。

3.6脱毒菌株

1

DB1302/T349—2013

经过栽培试验，无病毒感染症状的优良再生菌株。

4实验室准备

4.1实验室要求

实验室质量控制规范应符合GB/T27405-2008的规定。

4.2仪器和设备

4.2.1超净工作台：无菌风的纯度≤0.5个/皿•时(φ90mm培养平皿)，风速可调。

4.2.2高压蒸汽灭菌器：温度可控制在121℃。

4.2.3水浴锅：温度可控制在25℃～50℃。

4.2.4气浴恒温振荡培养箱：温度可控制在10℃～50℃，转速0～200rpm。

4.2.5光学显微镜：放大倍数400倍。

4.3试剂

应使用分析纯试剂，水为GB/T6682-2008规定的水。

4.3.1稳渗剂

0.6mol/L甘露醇（pH7.0）。配制后在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。

4.3.2细胞壁降解酶

应采用溶壁酶（Lywallzyme）。

4.4培养基

4.4.1PD液体培养基

称取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L沸水中煮20min，然后用三层纱布过滤，

向滤液中加入葡萄糖20g，定容至1L。在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。

4.4.2PDA固体培养基

在1LPD液体培养基中加入琼脂粉15g，加热煮沸15min。在高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。

4.4.3PSA固体培养基

称取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L稳渗剂中煮20min，然后用三层纱布过滤，

向滤液中加入蔗糖20g，用稳渗剂定容至1L，加入琼脂粉15g，加热煮沸15min。在高压蒸汽灭菌器

中121℃灭菌20min。

5原生质体制备

5.1菌丝体活化

在超净工作台中用接种针挑取少许初始菌株的菌丝，接种于PDA平板表面，25℃培养5d～7d。

5.2摇瓶培养

在超净工作台中用接种铲铲取菌落近边缘处菌丝和少许培养基3～5块，置于含有50mLPD培养基

的摇瓶中，25℃、180rpm振荡培养5d。

2

DB1302/T349—2013

5.3破碎菌丝体

在超净工作台中，利用接种针从PD培养基中挑取菌丝球置于重量为G1的1.5mL离心管中，10000

rpm离心5min，去掉上清，用天平称重为G2，菌丝体重量G=G1-G2（控制在G=0.1g左右）。用玻璃

棒（直径6mm）将菌丝球捣碎。

5.4酶解

称取0.02g溶壁酶于1mL稳渗剂中，用0.22μm的微孔滤膜过滤（现配现用）。将溶壁酶液加入装

有菌丝碎片的离心管中，颠倒混匀。将离心管放置于35℃水浴锅中孵育2.5h左右。每隔30min颠倒

混匀一次。

5.5原生质体分离

利用300目细胞筛过滤酶解产物，获得含有原生质体的滤液。

5.6原生质体观察和计数

利用光学显微镜观察原生质体。按照JJG552-1988的要求进行原生质体计数。

6原生质体再生

将制备好的原生质体用稳渗剂稀释至1.0×105个/mL，30℃静置培养过夜；然后按0.5mL/皿均匀涂

布在PSA再生培养基上，25℃静置培养，直到平板上长出菌落。

将单菌落转接到PDA平板上，22℃～28℃静置培养5d～7d，选择边缘整齐、菌丝致密的再生菌株

进行鉴定。

7鉴定

7.1再生菌株的真实性鉴定

7.1.1拮抗反应鉴定

将再生菌株与初始菌株对峙培养于同一个PDA平板上，按照NY/T1845-2010的要求进行拮抗反应

试验。选择无拮抗反应的再生菌株进行遗传学鉴定。

7.1.2遗传学鉴定

按照NY/T1743-2009的要求进行。选择与初始菌株具有相似RAPD指纹图谱的再生菌株进行以下

鉴定。

7.2脱毒菌株的鉴定

按照DB1302/T306-2011进行出菇试验，观察无病毒感染症状，获得脱毒菌株。按照NY/T528-2010

进行菌种生产，脱毒菌种应符合GB19172-2003的规定。

3

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附录A

(资料性附录)

平菇病毒病病原和症状

A.1病原

糙皮侧耳球形病毒（oystermushroomsphericalvirus，OMSV）

糙皮侧耳等面体病毒（oystermushroomisometricvirus，OMIV）

糙皮侧耳病毒-I（Pleurotusostreatusvirus-I，POV-I）

糙皮侧耳病毒-SN（Pleurotusostreatusvirus-SN，POV-SN）

A.2症状

A.2.1菌丝体感染病毒后多表现于生长速度变缓，菌落边