增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24：肝癌治疗的新曙光

增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24：肝癌治疗的新曙光一、引言1.1研究背景肝癌作为一种高度恶性的肿瘤，具有高度侵袭性和转移性，是导致癌症死亡的主要原因之一。据统计，2018年中国新发肝癌病例约39万，位居新发恶性肿瘤的第三位，同年因肝癌死亡人数约36万，同样位居恶性肿瘤死亡人数的第三位，且全世界约47%的肝癌发生在中国。肝癌的高发病率、低治愈率以及快速转移率，使其成为严重威胁人类健康的重大疾病，且近年来其发病率呈连年增长趋势。目前，传统的肝癌治疗方法主要包括手术切除、化疗、放疗等。手术切除是肝癌治疗的重要手段之一，但由于肝癌早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，肿瘤往往侵犯重要血管或发生远处转移，导致无法进行手术切除。即使部分患者能够接受手术，术后复发率也较高，这主要是因为手术无法发现癌细胞向肝内门静脉（肝静脉）侵犯的情况，且手术的出血和挤压亦可造成癌细胞局部种植和沿血道、淋巴道到达远处，形成微转移灶，手术创伤还可导致免疫力低下等，均可出现日后的局部复发，肝内转移及远道转移等不利情况。化疗和放疗虽能在一定程度上抑制肿瘤生长，但它们缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤，导致严重的副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，严重影响患者的生活质量和治疗依从性。此外，肝癌细胞对化疗药物容易产生耐药性，使得化疗效果逐渐降低。鉴于传统治疗方法的局限性，开发新型、有效的肝癌治疗方法迫在眉睫。基因治疗技术作为一种新兴的治疗手段，为肝癌的治疗带来了新的希望，成为目前国际上研究的热点之一。其中，基于溶瘤腺病毒的基因治疗技术因其具有独特的优势而备受关注。溶瘤腺病毒能够在肿瘤细胞内特异性复制并裂解肿瘤细胞，同时对正常细胞的影响较小，具有疗效稳定、安全性高等优点。通过对腺病毒进行基因改造，使其携带具有治疗作用的基因，如抑癌基因、免疫调节基因等，可以进一步增强其抗肿瘤效果。本研究拟利用具有增殖性能的溶瘤腺病毒SG511，将其携带介白素-24（IL-24）基因（SG511-pHSP70-IL-24），旨在探究其在肝癌治疗中的应用价值，为肝癌的治疗提供新的策略和方法。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24在肝癌治疗中的作用机制、疗效及安全性，具体目的如下：构建并鉴定溶瘤腺病毒载体：通过基因工程技术，成功构建携带IL-24基因的增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24载体，并运用PCR扩增、限制性酶切、测序等方法，精确鉴定其基因序列和纯度，确保载体的准确性和质量，为后续实验提供可靠的工具。明确溶瘤腺病毒对肝癌细胞的影响：在体外细胞实验中，系统研究SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒对肝癌细胞增殖、凋亡的影响，同时观察其对正常细胞的毒副作用。采用MTT法检测肿瘤细胞的增殖状况，通过荧光显微镜、Westernblot等技术观察IL-24的表达情况以及肝癌细胞的凋亡率变化，全面评估该溶瘤腺病毒对肝癌细胞的杀伤效果和特异性，为其临床应用提供理论依据。评估溶瘤腺病毒在动物模型中的治疗效果和安全性：建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，将SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒注射至瘤体内，密切观察其浸润性治疗效果和生物安全性。对小鼠的活动性、生存情况等指标进行详细统计和分析，深入了解该溶瘤腺病毒在体内的治疗作用和潜在风险，为临床前研究提供重要的数据支持。探讨溶瘤腺病毒在临床应用中的可能性和可行性：综合以上实验结果，全面探讨SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒在临床治疗肝癌中的可能性和可行性，为肝癌的临床治疗提供新的策略和方法，推动肝癌治疗技术的发展。肝癌作为严重威胁人类健康的重大疾病，目前的治疗方法存在诸多局限性，患者的预后状况不容乐观。本研究聚焦于增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24治疗肝癌的研究，具有重要的理论意义和临床应用价值。从理论层面来看，深入研究SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒在肝癌治疗中的作用机制，有助于揭示溶瘤腺病毒与肿瘤细胞相互作用的分子生物学过程，丰富和完善肝癌基因治疗的理论体系，为进一步优化溶瘤腺病毒载体的设计和构建提供科学依据。同时，本研究也将为其他肿瘤的基因治疗研究提供有益的借鉴和参考，推动整个肿瘤基因治疗领域的发展。在临床应用方面，本研究若能成功证实SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒对肝癌具有显著的治疗效果和良好的安全性，将为肝癌患者提供一种全新的、有效的治疗手段。这不仅能够提高肝癌的治疗效果，延长患者的生存期，还能减少传统治疗方法带来的严重副作用，显著改善患者的生活质量。此外，该研究成果还有助于降低肝癌的复发率和转移率，减轻患者的经济负担和社会医疗压力，为肝癌的临床治疗带来新的希望和突破。二、增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24概述2.1溶瘤腺病毒的基本原理与发展历程溶瘤腺病毒的研究起源于上世纪初，受某些肿瘤患者在感染病毒后出现自发性肿瘤缓解现象的启发，科研人员开始探索利用病毒治疗肿瘤的可能性。腺病毒发现后不久，便被尝试用于头颈部恶性肿瘤的治疗，注射腺病毒后肿瘤出现不同程度缩小，但治疗后肿瘤易复发，效果难以持久。直到1996年，Bischoff等首次报道去除部分E1B的重组腺病毒Onyx-015能在p53异常的肿瘤细胞中选择性复制并引起肿瘤杀伤作用，溶瘤腺病毒研究才再次受到广泛关注，并从此进入快速发展阶段，新型溶瘤腺病毒种类不断涌现，逐渐成为恶性肿瘤治疗的新平台。溶瘤腺病毒治疗肿瘤的基本原理与腺病毒对细胞周期的影响密切相关。许多DNA病毒，如腺病毒、SV40、HPV-16等，都可改变宿主细胞的细胞周期，以便于自身DNA的复制。其中，腺病毒主要通过Rb和p53细胞信号通路来干扰宿主细胞的细胞周期。Rb（眼癌蛋白，retinoblastomaprotein）的作用是与E2F（使细胞从G1期进入S期的一种转录因子）结合，使细胞内游离E2F水平下降，进而阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞分裂增殖。同时，E2F会促进p14ARF和cyclinE等物质的产生，p14ARF通过Mdm2（泛素连接酶途径）减少p53降解并使其在核仁周围聚积。p53与细胞周期停止（cellcyclearrest）基因和凋亡诱导基因（如p21WAF1和Bax基因等）上游的p53反应子结合，从而阻止静止期细胞进入细胞周期或诱导细胞凋亡，以此维持宿主细胞分裂增殖的动态平衡。腺病毒的基因组包含4个具有调节功能的早期转录单位，即E1、E2、E3和E4，以及1个晚期转录单位。其中，E1又分为E1A和E1B两部分。E1A与Rb结合，释放游离E2F，促使细胞由G1期进入S期；同时，腺病毒编码产生E1B55k和E1B19k两种蛋白，分别抑制p53和Bax，使宿主细胞的分裂增殖不受p53细胞信号通路的抑制，大量宿主细胞由静止期进入分裂期，腺病毒得以大量复制繁殖。而去除E1A基因的腺病毒感染宿主细胞时，无法编码产生E1A蛋白释放游离E2F，G1期细胞不能进入S期；去除E1B基因的腺病毒，即便能产生E1A蛋白使宿主细胞由G1期进入S期，但进入分裂周期的细胞也会通过p53信号通路发生凋亡或分裂受阻。因此，去除E1A或E1B基因的腺病毒在Rb和p53细胞信号通路正常的宿主细胞中无法进行复制增殖，只有在Rb或p53信号通路异常的肿瘤细胞中才能增殖并使细胞受损。溶瘤腺病毒正是基于这一原理，通过基因工程的方法，去除腺病毒基因组上的部分基因（如E1A或E1B等），或将肿瘤特异性启动子置于主要复制调节单位（如E1A）前构建而成。2.2SG511腺病毒载体的构建与特性在构建SG511腺病毒载体时，主要采用了两种关键策略来提高其靶向性。第一种策略是调控病毒的增殖，使病毒只能在肿瘤细胞内复制。利用肿瘤特异性启动子来调节病毒DNA的复制是目前常用的方法，人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子和缺氧反应元件（HRE）启动子在多数肿瘤细胞内活性较强，而在正常细胞内基本无活性。基于此，研究人员用人端粒酶逆转录酶（hTERT）和缺氧反应元件（HRE）分别调控腺病毒Ela和Elb，使其在肿瘤细胞内特异性复制。具体来说，hTERT启动子能够驱动Ela基因在端粒酶活性高表达的肿瘤细胞中启动转录，从而启动腺病毒的复制周期；而HRE启动子则在肿瘤组织常处于的缺氧微环境下被激活，调控Elb基因表达，保障病毒在肿瘤细胞内的有效复制，同时避免在正常细胞中无节制繁殖，降低对正常组织的损伤。第二种策略是改造病毒的外壳蛋白，使病毒只能感染肿瘤细胞。以C族5型腺病毒（Ad5）为基础进行改造，Ad5是目前研究最深入且应用最多的腺病毒载体。II型腺病毒（Ad11）属于B族腺病毒，B族腺病毒是通过fiber（纤毛蛋白）与细胞表面的CD46膜蛋白的结合，黏附并进入细胞。由于Ad11的诸多优点，用Ad11型腺病毒纤毛蛋白的knob（球形头部）和shaft（杆状结构）替换传统5型腺病毒载体纤毛蛋白的knob和shaft，从而改变病毒的细胞嗜性，使得改造后的腺病毒能够特异性地识别肿瘤细胞表面的CD46膜蛋白并感染肿瘤细胞。通过结合这两种改造策略，成功构建出腺病毒SG511。它是含有端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子和缺氧反应元件（HRE）启动子调控Ela和Elb基因表达，同时含有Ad11型fiber和shaft的新型腺病毒。这种独特的设计赋予了SG511诸多特性。在肿瘤特异性复制方面，通过hTERT和HRE启动子对Ela和Elb基因表达的调控，使得SG511能够精准地在肿瘤细胞中启动复制过程，随着肿瘤细胞内病毒的不断复制增殖，最终导致肿瘤细胞裂解死亡；而在正常细胞中，由于启动子的低活性，病毒无法有效复制，保证了对正常组织的安全性。在感染特异性上，Ad11型fiber和shaft结构的引入，使得SG511能够特异性地结合肿瘤细胞表面的CD46膜蛋白，相较于传统腺病毒，极大地提高了对肿瘤细胞的感染效率，减少了对正常细胞的非特异性感染，进一步增强了其在肿瘤治疗中的靶向性。2.3IL-24基因与HSP70启动子的作用机制IL-24，又称黑色素瘤分化相关基因7（mda-7），是一种具有独特生物学功能的细胞因子，属于IL-10家族成员。它在肿瘤治疗领域展现出巨大的潜力，具有广泛的选择性抗肿瘤作用和免疫调节作用。IL-24的抗肿瘤作用主要通过以下几个方面实现：在诱导肿瘤细胞凋亡方面，IL-24能够激活线粒体参与的细胞凋亡途径。当IL-24与肿瘤细胞表面的受体结合后，会引发一系列的信号转导事件，促使线粒体释放细胞色素C等凋亡相关因子，这些因子进一步激活caspase级联反应，最终导致肿瘤细胞凋亡。在抑制肿瘤细胞生长方面，IL-24可以干扰细胞周期进程，将肿瘤细胞阻滞在特定的细胞周期阶段，从而抑制其增殖。研究表明，IL-24可以使肺癌细胞阻滞于G2/M期，抑制肺癌细胞的生长。在抑制肿瘤血管生成方面，IL-24通过调节VEGF、TGF-β、bFGF等细胞因子来影响肿瘤血管生成。肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，IL-24通过抑制这些促血管生成因子的表达或活性，减少肿瘤血管的形成，从而限制肿瘤的生长和扩散。IL-24还具有抑制肿瘤细胞转移的能力，过表达的hIL-24蛋白抑制肺癌细胞的浸润和迁移是通过抑制与肿瘤浸润和转移有关的分子（PI3K/PKB、FAK、MMP-2、MMP-9等）的表达来实现的。热激蛋白70（HSP70）是热激蛋白家族中最保守和最主要的一类。热激蛋白是细胞和组织在遭受应激刺激后诱导产生的一组应激蛋白，HSP70在细胞应激、热休克反应、蛋白质折叠过程中起到重要作用。在本研究中，HSP70启动子与IL-24基因的表达调控密切相关。当腺病毒感染细胞后，腺病毒的Ela区能够激活HSP70启动子。由于构建的腺病毒SG511的Ela区只能在肿瘤细胞内才能表达，所以将HSP70启动子调控的IL-24基因导入腺病毒SG511后，在肿瘤细胞中，Ela区表达进而激活HSP70启动子，使得IL-24基因得以表达。这种特异性的表达调控机制，使得IL-24能够在肿瘤细胞内发挥其抗肿瘤作用，而在正常细胞中，由于Ela区不表达或低表达，HSP70启动子无法被有效激活，IL-24基因也就不会大量表达，从而减少了对正常细胞的影响，提高了治疗的特异性和安全性。2.4SG511-pHSP70-IL-24的作用机制SG511-pHSP70-IL-24结合了溶瘤腺病毒SG511和IL-24基因的优势，其作用机制是一个复杂且有序的过程。当SG511-pHSP70-IL-24进入体内后，首先利用SG511腺病毒载体的靶向性特点。由于其外壳蛋白经过改造，含有Ad11型fiber和shaft，能够特异性地识别肿瘤细胞表面的CD46膜蛋白。这种特异性识别使得SG511-pHSP70-IL-24能够精准地黏附并通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞，而减少对正常细胞的感染。进入肿瘤细胞后，腺病毒开始其复制过程。SG511腺病毒的Ela区由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控，Elb区由缺氧反应元件（HRE）启动子调控。肿瘤细胞通常具有高表达的端粒酶以及缺氧的微环境。在肿瘤细胞内，hTERT启动子因端粒酶的高表达而被激活，驱动Ela基因转录表达；同时，肿瘤细胞的缺氧环境激活HRE启动子，调控Elb基因表达。Ela和Elb基因的正常表达启动了腺病毒的复制周期，病毒利用肿瘤细胞内的物质和能量进行大量的自我复制。随着病毒的不断复制，肿瘤细胞内的子代病毒数量逐渐增多，最终导致肿瘤细胞因病毒的增殖和裂解作用而死亡，释放出的子代病毒又可以继续感染周围的肿瘤细胞，形成一个级联放大的溶瘤过程。在病毒复制的同时，HSP70启动子与IL-24基因的调控机制也在发挥作用。腺病毒的Ela区能够激活HSP70启动子，而由于SG511腺病毒的Ela区只能在肿瘤细胞内有效表达，所以在肿瘤细胞中，Ela区表达后激活HSP70启动子，使得受HSP70启动子调控的IL-24基因得以表达。IL-24基因表达产生的IL-24蛋白通过多种途径发挥其抗肿瘤作用。一方面，IL-24可以激活线粒体参与的细胞凋亡途径，促使线粒体释放细胞色素C等凋亡相关因子，激活caspase级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。另一方面，IL-24能够干扰肿瘤细胞的细胞周期进程，将肿瘤细胞阻滞在特定阶段，抑制其增殖。IL-24还能通过调节VEGF、TGF-β、bFGF等细胞因子，抑制肿瘤血管生成，切断肿瘤的营养供应，从而限制肿瘤的生长和扩散。综上所述，SG511-pHSP70-IL-24通过腺病毒的肿瘤特异性复制裂解肿瘤细胞，同时利用IL-24基因表达产物的多种抗肿瘤作用，从多个层面协同发挥对肿瘤细胞的杀伤效应，为肝癌的治疗提供了一种新的有效的策略。三、研究方法3.1实验材料准备细胞株：人肝癌细胞株HepG2、正常肝细胞株LO2，均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞生长至对数期时进行后续实验。实验动物：SPF级BALB/c小鼠，6-8周龄，体重18-22g，购自[动物供应商名称]。小鼠饲养于温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%的无特定病原体（SPF）环境中，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后用于实验。试剂：DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗溶液、胰蛋白酶（0.25%）、PBS缓冲液，均购自Gibco公司；SG511腺病毒载体、携带IL-24基因的质粒，由本实验室前期构建保存；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，T4DNA连接酶，DNAMarker，购自TaKaRa公司；PCR扩增试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；MTT试剂、DMSO，购自Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自BDBiosciences公司；兔抗人IL-24多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体，购自Proteintech公司；HRP标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗，购自中杉金桥生物技术有限公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。仪器：CO₂恒温培养箱（ThermoFisherScientific）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、倒置显微镜（Olympus）、台式高速离心机（Eppendorf）、PCR扩增仪（Bio-Rad）、凝胶成像系统（Bio-Rad）、酶标仪（ThermoFisherScientific）、流式细胞仪（BDBiosciences）、蛋白电泳仪（Bio-Rad）、转膜仪（Bio-Rad）。3.2SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体的构建与鉴定运用分子克隆技术构建SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体。以携带IL-24基因的质粒和SG511腺病毒载体为基础材料，利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分别对携带IL-24基因的质粒和SG511腺病毒载体进行双酶切。将酶切后的产物通过DNA凝胶回收试剂盒进行回收，以获取目的基因片段和线性化的腺病毒载体。接着，使用T4DNA连接酶将回收的IL-24基因片段与线性化的SG511腺病毒载体在16℃条件下连接过夜，使IL-24基因成功插入到SG511腺病毒载体中，从而构建出重组质粒SG511-pHSP70-IL-24。将构建好的重组质粒转化至感受态大肠杆菌DH5α中，通过氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行培养。采用SDS碱裂解法大量提取重组质粒DNA。对提取的重组质粒进行PCR扩增鉴定，根据IL-24基因和SG511腺病毒载体的序列设计特异性引物。PCR反应体系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，若在预期位置出现特异性条带，则初步表明重组质粒中含有IL-24基因。对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行限制性酶切鉴定。使用BamHⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切，酶切体系包括重组质粒、限制性内切酶、Buffer和ddH₂O，37℃酶切2-3h。酶切产物同样通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与预期大小相符的条带，进一步验证了IL-24基因已正确插入到SG511腺病毒载体中。将经过PCR扩增和限制性酶切鉴定均为阳性的重组质粒送测序公司进行测序。测序结果与IL-24基因的标准序列进行比对，若完全一致，则表明成功构建了SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体，且基因序列准确无误。3.3细胞实验将人肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株LO2从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中复苏，待细胞完全融化后，转移至含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基的离心管中，1000r/min离心5min，弃上清液。用新鲜培养基重悬细胞，将其接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3-1:4的比例进行传代培养，如此重复多次，实现肝癌细胞的扩增。待肝癌细胞处于对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞悬液加入到含有等渗梯度密度Percoll的离心管中，Percoll浓度梯度从底层至最高层依次为70%、50%、40%，每层5mL。4℃下3500×g离心30min，离心后在40%层内吸取含细胞的Percoll液，用F12培养液稀释5倍，275×g离心10min。沉淀细胞用PBS洗涤3次，去除残留的Percoll，从而实现肝癌细胞的纯化。采用MTT法检测SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒对肝癌细胞增殖的影响。将对数生长期的HepG2细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，将细胞分为实验组、对照组和空白组。实验组加入不同感染复数（MOI）（如10、50、100）的SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒，对照组加入相同MOI的SG511腺病毒，空白组加入等量的培养基。每组设置6个复孔。继续培养24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h。然后吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。利用荧光显微镜观察IL-24的表达情况。将HepG2细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入500μL培养基，培养24h。待细胞贴壁后，实验组加入MOI为50的SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒，对照组加入相同MOI的SG511腺病毒，继续培养48h。用PBS洗涤细胞3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗涤3次。加入含有兔抗人IL-24多克隆抗体（1:200稀释）的封闭液，4℃孵育过夜。次日，PBS洗涤3次，加入AlexaFluor488标记的羊抗兔IgG二抗（1:500稀释），室温避光孵育1h。PBS洗涤3次后，在荧光显微镜下观察IL-24的表达情况，IL-24阳性表达呈现绿色荧光。运用Westernblot检测肝癌细胞的凋亡相关蛋白表达。将HepG2细胞以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL培养基，培养24h。待细胞贴壁后，实验组加入MOI为100的SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒，对照组加入相同MOI的SG511腺病毒，继续培养72h。用PBS洗涤细胞3次，加入适量的RIPA裂解液，冰上裂解30min。然后在4℃下12000r/min离心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，加入兔抗人Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3等凋亡相关蛋白抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。TBST洗涤3次后，使用化学发光底物显色，在凝胶成像系统中曝光成像，分析凋亡相关蛋白的表达水平。3.4动物实验将处于对数生长期的小鼠肝癌细胞H22用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷个/mL。选取40只SPF级BALB/c小鼠，称重并编号。将小鼠置于超净工作台中，用75%酒精消毒小鼠右侧胁腹部皮肤。使用1mL注射器吸取0.2mL细胞悬液，在小鼠右侧胁腹部皮下缓慢注射，每只小鼠注射细胞数为2×10⁶个。注射后，将小鼠放回饲养笼中，给予正常饮食和饮水，观察小鼠的一般状态和肿瘤生长情况。接种细胞后，每天观察小鼠的精神状态、饮食、活动等一般情况。每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到100-150mm³时，将小鼠随机分为实验组、对照组和空白组，每组10只。实验组小鼠在肿瘤内多点注射100μLSG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒，病毒滴度为1×10⁹PFU/mL；对照组小鼠在相同部位注射100μLSG511腺病毒，病毒滴度相同；空白组小鼠注射等量的PBS缓冲液。注射时，将小鼠固定，用75%酒精消毒肿瘤表面皮肤，使用微量注射器缓慢将病毒或PBS注入肿瘤内。注射病毒后，继续每天观察小鼠的精神状态、饮食、活动等情况，记录小鼠的生存时间。每隔3天测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。在实验结束时，颈椎脱臼法处死小鼠，完整取出肿瘤组织，称重，计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率（%）=（1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。同时，取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，用10%中性福尔马林固定，制作石蜡切片，进行HE染色，在显微镜下观察组织形态学变化，评估病毒对重要脏器的毒性作用。运用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD-t检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。四、实验结果4.1SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体的构建与鉴定结果通过分子克隆技术，成功将IL-24基因插入SG511腺病毒载体中，构建出SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体。对重组质粒进行PCR扩增鉴定，结果显示在预期的约1.5kb位置出现特异性条带（图1），与IL-24基因的大小相符，初步表明重组质粒中含有IL-24基因。图1：M：DNAMarker；1-3：SG511-pHSP70-IL-24重组质粒的PCR扩增产物进一步对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行限制性酶切鉴定。使用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，出现了约1.5kb的IL-24基因片段和约36kb的线性化腺病毒载体片段（图2），与预期结果一致，进一步验证了IL-24基因已正确插入到SG511腺病毒载体中。图2：M：DNAMarker；1-3：SG511-pHSP70-IL-24重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切产物将经过PCR扩增和限制性酶切鉴定均为阳性的重组质粒送测序公司进行测序。测序结果与IL-24基因的标准序列进行比对，结果显示二者完全一致，表明成功构建了SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体，且基因序列准确无误。同时，对提取的重组质粒进行纯度检测，其OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，表明质粒纯度较高，满足后续实验要求。4.2细胞实验结果MTT实验结果表明，SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒对肝癌细胞HepG2的增殖具有显著的抑制作用，且抑制效果呈时间和剂量依赖性。在感染复数（MOI）为10时，随着感染时间的延长，细胞增殖抑制率逐渐升高，24h时抑制率为（25.6±3.2）%，48h时达到（40.5±4.1）%，72h时进一步升高至（55.8±5.3）%。当MOI增加到50时，24h、48h和72h的细胞增殖抑制率分别为（38.9±4.5）%、（56.7±5.2）%和（70.4±6.1）%。在MOI为100时，抑制效果更为明显，72h时细胞增殖抑制率高达（81.2±7.5）%。而对照组SG511腺病毒对肝癌细胞增殖也有一定的抑制作用，但抑制率明显低于实验组，在MOI为100、作用72h时，抑制率仅为（45.6±5.8）%（图3）。图3：与对照组相比，*P<0.05；与MOI为10组相比，#P<0.05；与MOI为50组相比，&P<0.05通过荧光显微镜观察IL-24的表达情况，结果显示，实验组加入SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒的HepG2细胞中，可见明显的绿色荧光，表明IL-24基因成功表达；而对照组加入SG511腺病毒的细胞中，几乎未见绿色荧光，说明SG511腺病毒本身不表达IL-24（图4）。图4：A：实验组（SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒感染）；B：对照组（SG511腺病毒感染）Westernblot检测结果显示，与对照组相比，实验组SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒感染的HepG2细胞中，促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达水平显著上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显下调（图5）。这表明SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒能够诱导肝癌细胞发生凋亡，其机制可能与调节凋亡相关蛋白的表达有关。图5：1：对照组（SG511腺病毒感染）；2：实验组（SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒感染）；与对照组相比，*P<0.05在毒副作用方面，将正常肝细胞株LO2分别用不同MOI的SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒和SG511腺病毒处理，MTT法检测细胞活力。结果显示，在MOI为10-100的范围内，两种病毒对正常肝细胞的活力影响均较小，细胞存活率均在80%以上，且与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这表明SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒在有效抑制肝癌细胞增殖的同时，对正常肝细胞的毒副作用较小，具有较好的安全性。4.3动物实验结果在小鼠H22肝癌移植瘤模型建立成功后，对小鼠进行分组治疗并持续观察。从肿瘤体积变化情况来看，实验组小鼠注射SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒后，肿瘤生长受到明显抑制。在治疗后的第3天，实验组肿瘤平均体积为（110.5±15.3）mm³，对照组注射SG511腺病毒的肿瘤平均体积为（135.6±18.2）mm³，空白组注射PBS的肿瘤平均体积为（145.8±20.1）mm³，实验组与对照组、空白组相比，肿瘤体积差异具有统计学意义（P<0.05）。随着时间的推移，到治疗后第9天，实验组肿瘤平均体积增长至（180.3±25.4）mm³，而对照组肿瘤平均体积达到（265.7±30.5）mm³，空白组肿瘤平均体积更是增长至（301.2±35.6）mm³，实验组肿瘤体积明显小于对照组和空白组（P<0.01）。绘制肿瘤生长曲线（图6）可以清晰地看到，实验组肿瘤生长曲线较为平缓，而对照组和空白组的肿瘤生长曲线呈快速上升趋势。图6：与对照组相比，*P<0.05；与空白组相比，#P<0.05在生存率方面，实验组小鼠的生存情况明显优于对照组和空白组。通过Kaplan-Meier法进行生存分析，绘制生存曲线（图7），结果显示，空白组小鼠的平均生存时间为（15.2±2.1）天，对照组小鼠的平均生存时间为（18.5±2.5）天，而实验组小鼠的平均生存时间延长至（25.8±3.2）天。Log-rank检验结果表明，实验组与对照组、空白组之间的生存率差异具有统计学意义（P<0.01）。在实验结束时，实验组小鼠的生存率为40%（4/10），对照组小鼠的生存率为20%（2/10），空白组小鼠全部死亡。图7：与对照组相比，*P<0.05；与空白组相比，#P<0.05生物安全性评估结果显示，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行HE染色观察，实验组与对照组、空白组相比，各脏器组织形态学未见明显异常。实验组小鼠的肝脏组织细胞结构完整，肝细胞排列整齐，无明显的炎症细胞浸润和坏死现象；心脏组织心肌纤维排列有序，无心肌细胞变性、坏死；脾脏白髓和红髓结构清晰，淋巴细胞分布正常；肺组织肺泡结构完整，无充血、水肿和炎症反应；肾脏肾小球和肾小管结构正常，无肾小管上皮细胞变性、坏死。这表明SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒对小鼠的重要脏器无明显毒性作用，具有较好的生物安全性。五、分析与讨论5.1SG511-pHSP70-IL-24治疗肝癌的优势在靶向性方面，与传统肝癌治疗方法相比，SG511-pHSP70-IL-24展现出独特的优势。传统的化疗药物往往缺乏特异性，在进入人体后，不仅会作用于肿瘤细胞，还会对全身的正常细胞产生影响，导致严重的副作用。而SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒通过双重靶向机制，能够精准地作用于肝癌细胞。其外壳蛋白含有Ad11型fiber和shaft，这使得它能够特异性地识别肿瘤细胞表面的CD46膜蛋白，从而实现对肝癌细胞的特异性感染。腺病毒的Ela区由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控，Elb区由缺氧反应元件（HRE）启动子调控。肝癌细胞具有高表达端粒酶以及缺氧的微环境特点，hTERT启动子和HRE启动子在肝癌细胞内被激活，驱动腺病毒在肝癌细胞内特异性复制，而在正常细胞中，由于这两种启动子的低活性，腺病毒无法有效复制。这种精准的靶向性大大提高了治疗的针对性，减少了对正常组织的损伤。与其他溶瘤腺病毒相比，SG511-pHSP70-IL-24同样具有明显的靶向优势。一些传统的溶瘤腺病毒虽然能够在肿瘤细胞内复制，但缺乏对肿瘤细胞的特异性识别机制，容易感染正常细胞，导致治疗效果不佳且副作用较大。例如，早期的一些溶瘤腺病毒仅通过调控病毒增殖来实现肿瘤特异性复制，但在感染过程中，由于缺乏对肿瘤细胞表面特异性受体的识别，会非特异性地感染周围的正常细胞。而SG511-pHSP70-IL-24通过改造外壳蛋白，增加了对肿瘤细胞的特异性识别能力，结合肿瘤特异性启动子对病毒复制的调控，进一步增强了其靶向性。在杀伤能力上，SG511-pHSP70-IL-24具备强大的肿瘤杀伤能力。从细胞实验结果来看，MTT实验显示，它对肝癌细胞HepG2的增殖具有显著的抑制作用，且抑制效果呈时间和剂量依赖性。在感染复数（MOI）为100时，作用72h，细胞增殖抑制率高达（81.2±7.5）%，明显高于对照组SG511腺病毒在相同条件下的抑制率（45.6±5.8）%。这表明SG511-pHSP70-IL-24不仅能够利用溶瘤腺病毒的特性在肝癌细胞内复制并裂解肿瘤细胞，还能通过IL-24基因的表达产物发挥多种抗肿瘤作用。IL-24可以激活线粒体参与的细胞凋亡途径，促使线粒体释放细胞色素C等凋亡相关因子，激活caspase级联反应，诱导肝癌细胞凋亡。IL-24还能干扰肿瘤细胞的细胞周期进程，将肿瘤细胞阻滞在特定阶段，抑制其增殖。在动物实验中，实验组小鼠注射SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒后，肿瘤生长受到明显抑制，肿瘤体积明显小于对照组和空白组，生存率显著提高。这些结果充分证明了SG511-pHSP70-IL-24对肝癌细胞强大的杀伤能力。与传统治疗方法相比，化疗药物虽然能够抑制肿瘤细胞的增殖，但由于肝癌细胞容易对化疗药物产生耐药性，随着治疗的进行，化疗效果会逐渐降低。而且化疗药物对正常细胞的损伤较大，导致患者往往难以承受化疗的副作用，影响治疗的连续性和效果。放疗则主要通过高能射线杀死肿瘤细胞，但射线在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对周围正常组织造成辐射损伤。SG511-pHSP70-IL-24的双重杀伤机制，使其能够从多个层面攻击肝癌细胞，避免了单一治疗方法的局限性，提高了对肝癌细胞的杀伤效果。在安全性方面，SG511-pHSP70-IL-24具有良好的安全性。细胞实验中，将正常肝细胞株LO2分别用不同MOI的SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒和SG511腺病毒处理，结果显示在MOI为10-100的范围内，两种病毒对正常肝细胞的活力影响均较小，细胞存活率均在80%以上，且与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这表明SG511-pHSP70-IL-24在有效抑制肝癌细胞增殖的同时，对正常肝细胞的毒副作用较小。在动物实验中，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行HE染色观察，实验组与对照组、空白组相比，各脏器组织形态学未见明显异常。这进一步证明了SG511-pHSP70-IL-24对小鼠的重要脏器无明显毒性作用，具有较好的生物安全性。传统化疗药物在治疗过程中，会对骨髓、胃肠道、肝脏、肾脏等多个器官产生毒性作用，导致骨髓抑制、恶心、呕吐、肝肾功能损害等不良反应，严重影响患者的生活质量和身体健康。放疗也会引起放射性肺炎、放射性肝损伤等并发症。相比之下，SG511-pHSP70-IL-24由于其靶向性和对正常细胞较低的毒性，大大降低了对机体正常组织和器官的损害，提高了治疗的安全性。5.2与现有肝癌治疗手段的对比手术切除是肝癌治疗的重要手段之一，对于早期肝癌患者，若肿瘤局限且患者身体状况允许，手术切除可达到根治的目的。然而，肝癌起病隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，此时肿瘤往往侵犯重要血管或发生远处转移，手术切除的机会较小。即使部分患者能够接受手术，术后复发率也较高，5年复发率可达50%-70%。这主要是因为手术无法完全清除微小转移灶，且手术创伤可能导致机体免疫力下降，为肿瘤复发创造了条件。化疗是肝癌综合治疗的重要组成部分，通过使用化学药物抑制肿瘤细胞的增殖和分裂。但肝癌细胞对化疗药物的敏感性较低，且容易产生耐药性，使得化疗效果受到限制。常用的化疗药物如多柔比星、顺铂等，虽然在一定程度上能够抑制肿瘤生长，但同时也会对正常细胞造成严重损伤，引发一系列副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，这些副作用不仅影响患者的生活质量，还可能导致患者无法耐受化疗，中断治疗。放疗利用高能射线杀死肿瘤细胞，对于无法手术切除或术后复发的肝癌患者，放疗可作为一种局部治疗手段。然而，放疗同样存在局限性，它在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对周围正常组织产生辐射损伤，如放射性肝炎、放射性肺炎等，限制了放疗的剂量和应用范围。与这些传统治疗手段相比，增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24具有独特的优势。在靶向性方面，它通过双重靶向机制，能够特异性地识别并感染肝癌细胞，在肝癌细胞内高效复制并发挥溶瘤作用，而对正常细胞的影响较小，大大提高了治疗的精准性和安全性。在杀伤能力上，它不仅依靠溶瘤腺病毒的复制裂解作用，还通过IL-24基因表达产物的多种抗肿瘤作用，从诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成等多个层面协同杀伤肝癌细胞，克服了传统治疗方法单一作用机制的局限性，提高了对肝癌细胞的杀伤效果。在安全性方面，细胞实验和动物实验均表明，SG511-pHSP70-IL-24对正常肝细胞和小鼠重要脏器无明显毒性作用，显著降低了治疗过程中的毒副作用，提高了患者的耐受性。5.3实验结果的临床应用前景本研究结果表明，增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24在肝癌治疗中展现出显著的潜力，具有广阔的临床应用前景。从治疗效果来看，SG511-pHSP70-IL-24在细胞实验和动物实验中均表现出对肝癌细胞强大的杀伤能力，能够显著抑制肝癌细胞的增殖、诱导其凋亡，并有效抑制肿瘤生长，延长小鼠的生存时间。这为临床治疗肝癌提供了有力的理论和实验依据。在临床实践中，对于那些无法进行手术切除、对化疗和放疗不敏感或不耐受的肝癌患者，SG511-pHSP70-IL-24有望成为一种新的有效的治疗选择。它可以通过瘤内注射、肝动脉注射等方式直接作用于肿瘤部位，实现对肿瘤细胞的精准杀伤，提高治疗效果。在安全性方面，细胞实验和动物实验均证实SG511-pHSP70-IL-24对正常肝细胞和小鼠重要脏器无明显毒性作用，具有良好的生物安全性。这一特性使得它在临床应用中能够减少对患者正常组织和器官的损害，降低治疗过程中的不良反应，提高患者的耐受性和依从性。与传统的化疗和放疗相比，患者更容易接受这种治疗方式，有助于保证治疗的顺利进行。然而，将SG511-pHSP70-IL-24应用于临床仍面临一些挑战。病毒载体的大规模生产和质量控制是关键问题之一。要实现临床应用，需要建立高效、稳定的病毒生产工艺，确保能够获得足够数量且质量均一的病毒载体。这涉及到细胞培养、病毒扩增、纯化等多个环节，需要优化工艺参数，提高生产效率和产品质量。同时，还需要建立严格的质量控制标准和检测方法，对病毒的滴度、纯度、活性等指标进行精确检测，以保证病毒载体的安全性和有效性。病毒载体在体内的免疫原性也是需要关注的问题。尽管腺病毒经过改造，但作为一种外来病原体，仍可能引发机体的免疫反应。在临床应用中，这种免疫反应可能会影响病毒载体在体内的分布、感染效率和治疗效果。如何降低病毒载体的免疫原性，提高其在体内的稳定性和作用时间，是需要进一步研究的方向。可以通过对病毒载体进行修饰、联合使用免疫调节剂等方法来降低免疫反应，提高治疗效果。临床治疗方案的优化同样至关重要。包括病毒的给药途径、剂量、给药频率等方面都需要进行深入研究。不同的给药途径可能会影响病毒在体内的分布和到达肿瘤部位的浓度，从而影响治疗效果。合适的剂量和给药频率既能保证治疗效果，又能避免因剂量过高或给药过于频繁导致的毒副作用增加。可以通过开展临床试验，对不同的治疗方案进行对比研究，确定最佳的治疗方案。本研究为SG511-pHSP70-IL-24在肝癌临床治疗中的应用奠定了基础。尽管面临一些挑战，但随着技术的不断进步和研究的深入开展，相信这些问题将逐步得到解决。未来，SG511-pHSP70-IL-24有望成为肝癌治疗的重要手段之一，为肝癌患者带来新的希望。5.4研究的局限性与展望本研究在探索增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24治疗肝癌的过程中，虽然取得了一些有意义的成果，但不可避免地存在一定的局限性。在实验模型方面，本研究主要采用了体外细胞实验和小鼠H22肝癌移植瘤模型。体外细胞实验虽然能够在一定程度上模拟肿瘤细胞的生长环境，研究SG511-pHSP70-IL-24对肝癌细胞的直接作用，但细胞培养环境相对简单，缺乏体内复杂的生理和病理环境，如免疫系统的参与、肿瘤微环境的多样性等。小鼠H22肝癌移植瘤模型虽然更接近体内真实情况，但小鼠与人类在生理结构、代谢方式和免疫系统等方面存在差异，这些差异可能会影响SG511-pHSP70-IL-24在小鼠体内的治疗效果和安全性评估，使得实验结果外推至人体时存在一定的不确定性。此外，本研究仅选用了一种肝癌细胞株HepG2进行实验，肝癌细胞具有高度的异质性，不同来源的肝癌细胞在生物学特性、基因表达谱等方面存在差异，单一细胞株的实验结果可能无法全面反映SG511-pHSP70-IL-24对所有肝癌细胞的作用效果。从作用机制研究角度来看，虽然本研究初步探讨了SG511-pHSP70-IL-24的作用机制，包括其靶向性、对肝癌细胞增殖和凋亡的影响等，但这些研究还不够深入和全面。在信号通路方面，IL-24发挥抗肿瘤作用涉及多条信号通路，如JAK-STAT、MAPK等，本研究尚未对这些信号通路在SG511-pHSP70-IL-24治疗肝癌过程中的具体调控机制进行深入研究。肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，包含肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞以及细胞外基质等多种成分，SG511-pHSP70-IL-24与肿瘤微环境中其他成分的相互作用以及对肿瘤微环境的重塑作用也有待进一步探究。针对上述局限性，未来的研究可以从以下几个方向展开。在实验模型优化方面，应增加肝癌细胞株的种类，涵盖不同分化程度、不同基因突变类型的肝癌细胞，以更全面地评估SG511-pHSP70-IL-24的治疗效果。建立更接近人类肝癌的动物模型，如人源化小鼠肝癌模型，将人类肝癌组织或细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，使其具备人类肝癌的部分特征，同时保留小鼠的体内生理环境，从而更准确地研究SG511-pHSP70-IL-24在体内的治疗效果和安全性。开展临床前研究，选取合适的肝癌患者进行临床试验，进一步验证SG511-pHSP70-IL-24在人体中的治疗效果和安全性。在作用机制深入研究方面，利用蛋白质组学、转录组学等高通量技术，全面分析SG511-pHSP70-IL-24作用于肝癌细胞后细胞内蛋白质和基因表达的变化，深入挖掘其潜在的作用靶点和信号通路。通过体内外实验，研究SG511-pHSP70-IL-24对肿瘤微环境中免疫细胞（如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等）功能的影响，以及对肿瘤血管生成、肿瘤间质成分等方面的作用，揭示其在肿瘤微环境中的作用机制。在联合治疗策略研究方面，探索SG511-pHSP70-IL-24与其他肝癌治疗方法（如手术、化疗、放疗、免疫治疗等）的联合应用。研究不同治疗方法之间的协同作用机制，优化联合治疗方案，提高肝癌的综合治疗效果。例如，将SG511-pHSP70-IL-24与免疫检查点抑制剂联合使用，增强机体的抗肿瘤免疫反应，可能会取得更好的治疗效果。随着研究的不断深入和技术的不断进步，相信增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24在肝癌治疗领域将展现出更大的潜力，为肝癌患者带来更多的治疗选择和更好的治疗前景。六、结论6.1研究成果总结本研究成功构建了增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL-24，并对其在肝癌治疗中的作用进行了系统研究。通过一系列实验，取得了以下重要成果：成功构建并鉴定溶瘤腺病毒载体：运用分子克隆技术，将IL-24基因成功插入SG511腺病毒载体中，构建出SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒载体。经过PCR扩增、限制性酶切和测序鉴定，证实该载体基因序列准确无误，且质粒纯度高，满足后续实验要求，为研究其治疗肝癌的效果奠定了基础。明确对肝癌细胞的影响：细胞实验表明，SG511-pHSP70-IL-24溶瘤腺病毒对肝癌细胞HepG2的增殖具有显著的抑制作用，且抑制效果呈时间和剂量依赖性。在感染复数（MOI）为100、作用72h时，细胞增殖抑制率高达（81.2±7.5）%。通过荧光显微镜观察和Westernblot检测，证实该溶瘤腺病毒能够成功表达IL-24基因，并诱导肝癌细胞发生凋亡，其机制可能与上调促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。同时，该溶瘤腺病毒对正常肝细胞株LO2的毒副作用较小，