灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液的免疫应答比较研究

灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液的免疫应答比较研究摘要：随着养殖规模的不断扩大，刺参病害问题日趋严重，目前常见的疾病主要包括腐皮综合征、口围肿胀症、烂边症、烂胃病等。其中腐皮综合征已成为刺参养殖业最常见也是危害最严重的疾病，而灿烂弧菌是引起养殖刺参腐皮综合征的主要病原菌，该株细菌能够在温度较低的环境中生长。为研究灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液的免疫应答差异，本文以灿烂弧菌为刺激源,采取体腔注射方式感染刺参，通过酶学技术分别对刺参体腔内和波里氏囊内体腔液上清中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的免疫酶活进行了测定。结果显示，灿烂弧菌刺激后，不同时间点内刺参体腔液上清和波里氏囊内液体上清的ACP、AKP、CAT和SOD都是显著不同的(P﹤0.05)。在ACP活力测定中，波里氏囊内体腔液ACP在早期免疫应答中可能起着更重要的作用。在AKP活力测定中，感染前期体腔内体腔液AKP呈现了持续性显著升高，具备更迅速的应答力，后期波里氏囊内体腔液AKP更快速的发挥作用。在CAT活力测定中，在感染病原菌前期,波里氏囊内体腔液CAT不断升高，后期体腔内体腔液CAT显著增高。在SOD活力测定中，刺参体腔内体腔液与波里氏囊内体腔液内SOD，在抵御灿烂弧菌刺激的过程中，无明显差异。这说明SOD在体腔和波里氏囊内都占据了一个主要的地位。关键词：刺参；灿烂弧菌；波里氏囊；体腔液；免疫相关酶Acomparativestudyontheimmuneresponsesofthebodycavityfluidofjaponicusanditsbursaaftervibrioresplendentstimulation.Abstract:Withtheexpansionofthescaleoffarming,trepangdiseaseproblemisincreasinglyserious,thecurrentcommondiseasesincludingsoyasheetsyndrome[14],mouthswellingaround,rotten,suchasdisease,stomachtroubleside,therottingskinsyndromehasbecomeatrepangaquacultureisalsoharmthemostseriousillness.Themostcommonandbrilliantvibrioisthemainpathogenicbacteriainaquaculturetrepangrottingskinsyndrome,thestrainsofbacteriacangrowinlowtemperatureenvironment,inordertounderstandthesplendidvibriostimulation,Trepangcavityandwavemagnitudeofcoelomicfluidinsidebursaofacidphosphatase(ACP),alkalinephosphatase(AKP),catalase(CAT),superoxidedismutase(SOD)ofthechange,thisarticlestimuli,trepangbrilliantvibrioinfectioninbodycavityinjectionwaytrepang,respectivelythroughenzymatictechnologyresearchtrepang'spouchcoelomicfluidcavityandwaveresponse,theimmuneresponseandcomparetheirdifferences,soastostudywavemagnitudeofsacfunctioninthetrepangsplendidvibrioinfectioninthereply.Keywords:Apostichopusjaponicus;Brilliant

vibrio;Polianvesicle;Coelomicfluid;Immune-relatedenzymes

目录TOC\o"1-3"\h\u第一章文献综述 61.1刺参的概况 错误!未定义书签。1.1.1刺参 错误!未定义书签。1.1.2刺参的养殖 错误!未定义书签。1.1.3刺参的发展史 错误!未定义书签。1.1.4刺参在我国水产养殖领域的地位 错误!未定义书签。1.2刺参体腔液 错误!未定义书签。1.2.1体腔液 错误!未定义书签。1.2.2刺参体腔液 错误!未定义书签。1.2.3刺参体腔液的效用 错误!未定义书签。1.2.4体腔液的研究 错误!未定义书签。1.3灿烂弧菌 错误!未定义书签。1.3.1灿烂弧菌的概念 错误!未定义书签。1.3.2灿烂弧菌国内外的研究进展 错误!未定义书签。1.3.3灿烂弧菌在刺参养殖中的危害 错误!未定义书签。1.4刺参的免疫防御系统 41.4.1刺参的细胞免疫 41.4.2刺参的体液免疫 51.5研究目的及意义 错误!未定义书签。第二章实验部分 错误!未定义书签。2.1实验材料 错误!未定义书签。2.1.1实验动物 错误!未定义书签。2.1.2菌悬液的制备 错误!未定义书签。2.1.3实验器材 62.2实验方法 62.2.1实验设计 62.2.2刺参体腔内和波里氏囊内体腔液的收集与处理 62.2.3刺参体腔液上清的免疫酶活力测定 72.2.4数据分析 7第三章实验结果与讨论 83.1灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液ACP活力比较 83.2灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液AKP活力比较 93.3灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液CAT活力比较 103.4灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液SOD活力比较 错误!未定义书签。3.4讨论 14第四章结论与展望 错误!未定义书签。4.1结论 错误!未定义书签。4.2展望 15参考文献 错误!未定义书签。致谢 19第一章文献综述1.1刺参的概况1.1.1刺参刺参(Apostichopusjaponicus)隶属于棘皮动物门，是海参纲中后口动物的一种，是无脊椎动物的一种，其与脊索动物最为相似。除此之外，刺参也是中国海珍品养殖之中必不可少的一部分，其高昂的经济价值使其成为现今中国海水养殖品种之中不可或缺也是产值最高的品种[1]。1.1.2刺参的养殖刺参在其养殖过程中存在以下特点：1、池塘营养物质单一化；2、食物链短；3、饵料的残留、刺参的排泄废弃物以及部分有机体的分解容易引发水体的污染[5]。在养殖期间，为了保证养殖水体的良好水质，需要定期进行大量的换水,从而导致水体透明度较高，与之相对的是水体表层有机物质含量相较于底层数量少,细菌总数也少，底层水体中细菌总量受到底泥表层细菌的影响,显现出的情况是细菌数量显著高于表层。附着基作为特殊的池塘部分，是细菌繁殖的天然场所，在它之上附着有大量的底栖生物附着[6]。刺参养殖池塘的底泥中含有大量的刺参排泄物、残饵以及一些大型藻类的残体,这种环境与细菌的生长繁殖相得益彰,底泥中滋生大量细菌也便是应有之意了。刺参摄食范围比较杂乱，没有明确的选择性[3]，会选择在池塘底层摄入大量的底泥、有机物质以及大量的细菌，另外刺参的肠道中存在大量稳定细菌菌群，其功能是辅助消化[4]，从而导致肠道中细菌数量较多。刺参肠道与养殖环境中菌群变化的影响因素有以下几点：1、水体中浮游生物2、水温3、无机营养盐4、刺参的摄食活动情况。细菌数量随着水温的变化进行变化，两者的趋势趋于相同，大部分异养细菌其新陈代谢能力受到温度的影响,这也是细菌季节性变化的重要因素之一[1]，除此之外，水温影响的范围也包括刺参摄食与生理活动，这能够间接影响刺参肠道与养殖环境中菌群的变化。在秋季9月份的时候，池塘的水温大致在20℃左右,刺参结束夏蛰开始了活动与摄食,而在10月份的时候，天气转凉，水温下降到18℃左右，刺参的生命活动迹象开始频繁起来，摄食、活动活跃，这导致这一时间段池塘开始沉积大量的刺参排泄物，细菌的增长也因此有了足够的营养物质。10月份也是养殖投饵的主要时间段，大量残留的未被刺参摄食的残饵也提供了营养物质，从而促进了细菌的增殖，大大增加了细菌的数量。时间转到11月份，水温渐渐降低，刺参开始了正常的冬眠活动，其代谢水平和繁殖能力也处于一个低谷期，与之相对应的是细菌的数量开始逐渐的下降。而到了冬季12月份的时候，水温处于一个较低的状态，大概在6℃左右，刺参处于冬眠时期，低温条件对细菌的繁殖和有机物质的分解都起到了抑制的作用。这个时候细菌的含量将显著低于11月，最终在1月份2℃,的水温条件下细菌数量达到低谷[7-9]。而在来年开春的时间点，3月份或4月份随着温度的爬升，细菌数量也逐渐的增加。一直持续到6月份、7月份左右，这个时候水体表层中细菌数量有受到水温或者水体有机物的影响而下降。1.1.3刺参的发展史棘皮动物体腔细胞的研究始于1900年左右[1]，一开始是集中于光学显微镜下的表观形态学观察,随着近年来科学技术的不断发展，国内外相继利用单克隆抗体、荧光标记及分子生物学技术对棘皮动物体腔细胞的形态、功能和发生进行了逐一深入研究，其研究对象主要集中于海参、海星和海胆。1.1.4刺参在我国水产养殖领域的地位最近一段时间以来，与中国蓬勃发展的刺参产业相对比的是其养殖技术的粗糙和泛化[2]。在刺参养殖规模和产量日渐增涨的现今时段，各种不同的问题却逐渐显现出来，种质的降低，病害的频发，环境的污染和市面上产品品质的降低等等问题都成为了制约刺参养殖业发展的因素。最直接的体现就是即使是同一品种同一批次出塘的刺参，显著差异的规格会导致价格的巨大差异从而直接影响到经济效益。造成这种差异的原因分为内因和外因，外因方面有：1、密度；2、社会等级；3、物理接触[3]，内因主要是刺参个体差异导致的免疫力有所差异[1,4]，但具体有关于免疫力高低与刺参自身生长性能方面之间的关系目前尚无定论。有感于此国内外多个专家对不同大小，不同规格的野生和养殖刺参免疫力相比较，在体腔细胞密度、数量及免疫酶活性等方面进行差异分析，以期能够探明刺参个体质量、生活环境和其免疫力之间的相互作用，也为了能更好的对刺参自身免疫机制进行明确，从而为建立刺参免疫指标提供基础试验依据。1.2刺参体腔液1.2.1体腔液众所周知，体腔细胞作为棘皮动物的重要组成部分，一直担任着棘皮动物的免疫系统核心成分。它所包括的功能不仅仅是是细胞免疫的承担者，同时也提供了体腔液免疫因子[10]。在棘皮动物的体腔中有类似于淋巴的体腔液，其功能也类似淋巴，参与了体腔液的免疫反应，是一种类似于白细胞的存在。有研究指出，体腔细胞的数量能对棘皮动物自身的健康状况和机体免疫能力有相应程度的正反馈[11]。1.2.2刺参体腔液刺参体腔并不是中空的，它的内部环境之中充斥着体腔液,而在体腔液之中存在着各种不同种类的体腔细胞。刺参由于其特殊的结构导致外物可以直接进入体腔之中，甚至可以直接与与刺参体相接触，所以对应的后果是体腔细胞在抵御外来异物的侵入等免疫反应的作用得到了凸显。1.2.3刺参体腔液的效用刺参体腔液中含有部分免疫反应的重要因子和免疫酶等[12]，所以它在免疫防御中也起到了至关重要的作用[13]。在这些免疫因子和免疫酶之中，有几种尤为重要,碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等为刺参体液免疫中重要的几种免疫酶类，其活性高低可在部分程度上对刺参的免疫力进行反映[14]。1.2.3体腔液的研究体腔液免疫是刺参为数不多的能够对病害入侵进行防御的有效手段，作为其主要的免疫防御，体腔液也一直是刺参最重要的免疫组织之一。在体腔液之中有各种各样的免疫因子，其中包括溶血素、活性酶、凝集素、和类补体物质等[10-11,15-17]。研究表明，在水产动物的内部尤其是体腔液以及血细胞之中含有大量与免疫防御功能相关的酶类(如溶菌酶、磷酸酶、过氧化物酶、脂酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶等)，而这些免疫相关酶的酶解过程就是将外来有害病原体在刺参体内进行消除降解的过程，我们通过内部和外部相结合的手段可以有效调节动物体内酶的水平，从而能够相应的影响到机体本身的免疫能力[15]。ACP和AKP酶是刺参体内两种重要的水解酶类，ACP酶在刺参的免疫系统中起着调理素的作用，它可以诱导刺参体腔细胞中的阿米巴细胞对外来的物质进行吞噬作用，ACP活性可以代表刺参体内体腔细胞清除异物的能力[16]。1.3灿烂弧菌1.3.1灿烂弧菌的概念弧菌是海水养殖一直以来的难题之一，它能够大面积的引起海水养殖鱼类的细菌性疾病。除此之外，弧菌引发的疾病有着以下2种特点：1、流行面积广2、发病率高。所以弧菌感染一直是养殖业的巨大隐患和危害之一，也一直是我们水产医学领域研究的热点[17]。灿烂弧菌(Vibriosplendidus)可以分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型两种，但是这两种生物型都具有致病性。莫照兰等[18]把从孵化14d患腹水症的牙鲆苗中分离的病原菌鉴定为灿烂弧菌生物Ⅱ型，人工感染实验证实它对牙鲆苗具有很强的致病性病原菌革兰氏染色阴性，杆状，有1根很长的极生单鞭毛，菌体大小为(0.7-1.0)×(1.8-2.0)μm，在2216E培养基上培养24h的菌落圆形、半透明，直径约1.0mm，在TCBS的菌落呈黄色，直径约2.0mm，对弧菌抑制剂O/129(150μg/ml)敏感，发酵葡萄糖不产酸、不产色素。1.3.2灿烂弧菌国内外的研究进展灿烂弧菌刺激后，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力显著升高，而超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力显著降低；哈维氏弧菌刺激后,酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力显著升高，碱性磷酸酶活力变化不规律；假交替单胞菌刺激后，酸性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力显著升高，超氧化物歧化酶活力先升高后降低，碱性磷酸酶活力变化不规律[19]；溶壁微球菌刺激后，酸性磷酸酶和酚氧化酶活力显著升高，超氧化物歧化酶活力先升高后降低,溶菌酶活力先升高后降低，而后在72h恢复至对照水平,碱性磷酸酶活力变化不规律；停乳链球菌刺激后，除碱性磷酸酶活力在4h有所下降外,其余免疫相关酶活力均显著升高[19,20]。在对仿刺参体腔液抗菌特性研究中发现，仿刺参体腔液上清对溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)的生长有明显的抑制作用，而对灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)和停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)的生长无明显影响[21,22]。1.3.3灿烂弧菌在刺参养殖中的危害刺参疾病的多发季节在秋冬两季，而在进行优势菌分析的时候发现这两季的弧菌数量与异养细菌数量比例达到了一个非常高的比例，尤其是在3、4月份也就是春季的时候，这个比例极大的提高，这说明了在刺参池塘的位置生长的一些弧菌具有极强的低温耐受能力，而且鉴定之后发现，冬季和春季两季均发先大量的灿烂弧菌。灿烂弧菌是引起养殖刺参"腐皮综合征"的主要病原菌，该株细菌能够在温度较低的环境中生长。在多数情况下，灿烂弧菌与刺参肠道内的益生菌也就是芽孢杆菌处于一个动态平衡的状态。但是当处于低温状态的时候，刺参自身的免疫力下降，导致抵抗力减弱，这时环境变化会使细菌菌群失衡，部分低温致病菌繁殖迅速，从而引发疾病[23]。生态养殖是渔业可持续发展的重要保证，而益生菌是生态养殖之中不可或缺二点一部分，利用益生菌来改善养殖环境、调节养殖动物肠道中菌群组成能有助于我们更好的进行生态养殖[24-26]。1.4刺参的免疫防御系统1.4.1刺参的细胞免疫刺参隶属于棘皮动物门海参纲，其缺少专门的防御屏障[11],只存在非特异性免疫系统[11-13]，其免疫应答是由体腔细胞和多种体液免疫因子共同介导的，主要是对进入体内的异物进行识别、降解、排除以及对伤口创面进行修复[12]。近年来关于海参体腔细胞类型的研究主要集中于仿刺参，其分类依据围绕体腔细胞的形态、大小及细胞内的颗粒情况[11-13]，研究方法采用光学显微镜下的表观形态学观察。1.4.2刺参的体液免疫刺参体腔液之中含有各种相关的体液免疫因子，这些体液免疫因子有其必不可少的作用，它们能够对外来物质进行识别和攻击。这些体液免疫因子包括不同类型的凝集素、溶血素、水解酶、类白介素、类补体样因子等[18]。有研究表明仿刺参体腔液、体腔液上清液和体腔细胞中存在总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4[19,20]，表明仿刺参体内存在有脊椎动物的补体类似物,且其活性与正常人补体活性相似。名称作用凝集素受伤或包囊外源入侵者后维持机体正常运作溶血素与靶细胞接触后形成空洞而裂解靶细胞补体机体免疫防御机制的重要组成部分，对消除外来抗原的侵害和维护机体内环境的平衡具有重要作用1.5研究目的及意义刺参是我国北方沿海地区的重要经济水产养殖品种[1]，冬、春低温季节是刺参疾病的多发季节，大部分水产之中所使用的微生物制剂基本都是从陆地生物的肠道乃至于其养殖环境之中进行分离所得到的[20,25]，所以会有类似于不耐受低温和不完全适应于刺参养殖环境之类的弊端。为了解决这种弊端，我们选择从刺参自身入手，从它的疾病多发的时期也就是低温的秋冬季节进行土著益生菌的筛选这样的筛选结果也许更加有利于对刺参疾病的防控。刺参体腔细胞是刺参主要的免疫反应效应器，在抵御外来异物入侵等免疫反应中起到了不可或缺的作用。随着刺参养殖行业的逐步发展，尤其是集约化养殖的普遍,养殖过程中出现的病害和种质退化的现象也日益增多[8,24]。加强刺参自身免疫力的研究已经刻不容缓，本研究就灿烂弧菌刺激后刺参体腔细胞的应答响应入手，旨在从其自身免疫反应效应器出发为研究促进刺参免疫力的产品提供指导意见，从而推动整个刺参养殖业的健康发展，为水产养殖业的绿色化、健康化添砖加瓦[22]。波里氏囊作为海参水管系统的附属物，过去普遍认为其主要功能是调节水管系统内压力，但随着生物技术的发展，其生物学功能逐渐被重新认识。近年来研究证实：海参波里氏囊具有造血功能,在海参体腔细胞生成中起着关键性作用；波里氏囊对异物刺激可表现出明显的炎症反应，有研究者甚至推测其在功能上类似于脊椎动物免疫器官—"淋巴结"。越来越多的研究证据表明，波里氏囊在海参免疫系统中发挥着重要作用，然而当有病原微生物侵染时,海参波里氏囊会表现怎样的应答反应，其是否参与海参的抗感染免疫尚不清楚[27]。实验部分2.1实验材料2.1.1实验动物刺参购于山东省青岛市某水生动物养殖基地，体重为(65.2±5.3g)，于盐城工学院计算机楼养殖间的水族箱中充气暂养，水温16-18℃,盐度30‰-31‰，pH8.2-8.4，定时换水，一周后进行实验。2.1.2菌悬液制备实验以灿烂弧菌为刺激源,将细菌在28℃180r/min的条件下培养至对数生长期后,取细菌培养悬液12000rpm/min,4℃离心2min，弃上清，用TSA液体培养基重悬细菌沉淀至终浓度为2×108cfu/ml，用于刺参腹腔注射刺激。2.1.3实验器材恒温水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、解剖盘、解剖刀、镊子、烧杯、培养皿、离心管、冰块、滤纸、一次性注射器、移液枪、无酶管、酶枪头等，以上器材均经无菌处理。南京建成生物工程研究所的检测试剂盒：碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)。2.2实验方法2.2.1实验设计为进行灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液的免疫应答比较研究，实验设计的采样时间点分别为0h、12h、24h、36h、48h、72h,96h。用1ml灭菌注射器吸取100µL灿烂弧菌菌悬液(2×108cfu/ml)对刺参进行腹腔注射，63头刺参被随机分成7组。没有注射的作为0h，注射后12h、24h、36h、48h、72h、96h,刺参体腔内体腔液，每3个样品随机混合作为一个重复，分别收集3个重复；波里氏囊内体腔液，每4或5个样品随机混合作为一个重复，分别收集2个重复，每组使用实验动物刺参9头进行免疫酶活的研究。2.2.2刺参体腔内与波里氏囊内体腔液的收集和处理对应取样时间点内，从水箱中取出刺参并用滤纸吸干其体表水分，于培养皿上方，用剪刀从泄殖腔向上剖开刺参腹部，将体腔内体腔液收集至培养皿。用2.5ml注射器迅速从培养皿内吸取体腔内体腔液2ml至10ml无酶管，每三头混合一个样品，9头均取完后(冰浴);暴露波里氏囊，用2ml注射器抽取刺参波里氏囊内体腔液至一无酶管，每四头/五头混合一个样品，9头均取完后(冰浴)。将收集的刺参体腔内与波里氏囊内体腔液样品，放入离心机，配平后，4℃，3000r/min，离心10min。将离心后的刺参体腔内与波里氏囊内体腔液上清液分别转移至新的酶活管中，-80℃冻存，用于酶活力的检测。2.2.3刺参体腔液上清的免疫酶活力测定刺参体腔液上清和波里氏囊内液体上清酶活力的测定指标我们选取酸性磷酸酶(ACP)，碱性磷酸酶(AKP)[28]，过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)这几种常见的与免疫相关的酶去研究这两个部位免疫力的强弱。将2.2.2中储存在-80℃中的体腔液上清样品拿出来解冻进行检测。酸性磷酸酶活力的测定按照对硝基苯基磷酸酯底物法操作，将对硝基苯基磷酸酯溶于100mmol/L、pH4.5的醋酸钠—醋酸缓冲液中，制成2mmol/L的对硝基苯基磷酸酯溶液。100μL样品加入到对硝基苯基磷酸酯溶液中混匀，37℃30min，再加入2.9mL100mmol/L的NaOH溶液。测定405nm波长下的吸光值，产生1mg对硝基苯酚定义为1个酶活力单位(U)。碱性磷酸酶活力的测定将对硝基苯基磷酸酯溶于100mmol/L，pH9.5的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液按照对硝基苯基磷酸酯底物法操作，测定405nm波长下的吸光值。产生1mg对硝基苯酚定义为1个酶活力单位(U)。超氧化物歧化酶活力测定采用氯化硝基四氮唑蓝法[16]，将50μL样品加入到3mL反应溶液(50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.75mmol/L氯化硝基四氮唑蓝2oμ，mol/L核黄素，13μmol/L甲硫氨酸，pH7.8)中混匀，30℃使用40001x荧光照射5min，测定560nm波长下的吸光值。1mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50%时定义为1个酶活力单位(U)。过氧化氢酶(CAT)活性测定将50mmol/L，pH7.5的磷酸缓冲液加入75mmol/L浓度的H2O2中，直至240nm波长吸光值达到0.04~0.06，用作底物缓冲液，将100μL样品加入到2.9mL底物缓冲液中，混匀测定240nm波长下的吸光值。每秒钟转化μmolH2O2定义为1个酶活力单位(U)。2.2.5数据分析酶活检测实验均重复3次，结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。数据使用SPSS17.0进行单因素方差分析，差异性显著定义为P<0.05。第三章实验结果与讨论3.1灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液ACP活力比较图1刺参体腔内体腔液ACP活力变化图图2波里氏囊内体腔液ACP活力变化图由图1分析，刺参在受到灿烂弧菌刺激后12h，体腔内体腔液的ACP酶活力与0h相比显著下降，在12-96h内ACP活力先上升后呈平稳趋势。由图2可知，灿烂弧菌刺激刺参12h后，相比于0h，波里氏囊内体腔液的ACP活力明显升高，而在12-24h内又发生急剧下降，24-48h又呈明显上升趋势，在48-96h，囊内ACP活力不断下降且显著低于对照组。在酸性磷酸酶活力的测定中，刺参经灿烂弧菌刺激达12h时波里氏囊内体腔液ACP活力急剧升高至对照组两倍左右，说明囊内体腔液酸性磷酸酶积极参与了刺参机体的免疫应答[29,30]，并且相比于刺参体腔内体腔液，波里氏囊内体腔液酸性磷酸酶在针对灿烂弧菌刺激后的早期免疫应答中可能起着相对重要的作用。3.2灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液AKP活力比较图3刺参体腔内体腔液AKP活力变化图图4波里氏囊内体腔液AKP活力变化图灿烂弧菌刺激后，刺参体腔内体腔液碱性磷酸酶活力总体呈先上升后下降的趋势，下降幅度相较于上升幅度较小，12-24h体腔内ALP活力明显上升，并且经刺激24h时体腔内体腔液碱性磷酸酶活力达到峰值，48-96h，刺参体腔内体腔液的ALP呈下降趋势。而波里氏囊内的体腔液的ALP活力经灿烂弧菌刺激后总体呈先上升后下降，再上升的趋势,再下降的趋势，囊内ALP活力在72h时达到最高值。刺激后的12h,囊内ALP活力上升,12-24hALP活力下降，下降幅度较小，而48-96h，波里氏囊内体腔液的碱性磷酸酶活力先明显上升后急剧下降，且上升和下降的幅度较大。刺参经灿烂弧菌刺激后，刺参体腔内体腔液在前期(0-24h)相比于波里氏囊内体腔液ALP变化情况呈现了持续性升高，这说明在感染前期体腔内体腔液ALP具备更迅速的应答力，在后期(48-96h),波里氏囊内体腔液ALP则发挥作用，更为迅速的抵御病原菌的入侵。3.3灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液CAT活力比较图5刺参体腔内体腔液CAT活力变化图图6波里氏囊内体腔液CAT活力变化图由图5分析，灿烂弧菌刺激后的12-72h，刺参体腔内体腔液的过氧化物歧化酶活力变化不规律，12h、48h、72h时，与对照组相比差异显著，在96h时，CAT活力急剧上升,并且达到最高值。而波里氏囊内CAT活力在12-24h明显上升，48h又急剧下降，72-96hCAT活力逐渐恢复至正常状态。刺参体腔内CAT在早期变化起伏不明显，相对来说，波里氏囊体腔液CAT活力在感染病原菌前期不断升高，这说明在刺参前期应答细菌感染的过程中，波里氏囊发挥着更重要的作用，扮演着重要的角色，而后期(96h),体腔内体腔液CAT活力突然显著升高，波里氏囊内体腔液CAT也恢复至起始水平，可能是刺参机体逐渐恢复状态，波里氏囊内与体腔内体腔液共同抵御对病原菌的结果[29-31]。3.4灿烂弧菌刺激后刺参体腔内和波里氏囊内体腔液SOD活力比较图7刺参体腔内体腔液SOD活力变化图图8波里氏囊内体腔液SOD活力变化图如图7所示，刺参经病原菌刺激12h时，体腔内体腔液SOD活力变化相比于对照组，出现显著下降现象，并持续此水平至48h，在48-96h阶段，体腔内体腔液SOD活力先下降后上升，在72h时,SOD活力最小且显著低于对照组。波里氏囊内体腔液的SOD活力整体变化趋势与体腔内相似，SOD活力变化呈先下降后上升再下降的趋势，并且每一时间点的SOD活力与对照组相近。在测定起始阶段(0-12h)，刺参体腔内体腔液和波里氏囊内体腔液SOD活力均出现显著下降，说明该病原菌的刺激，抑制了刺参机体SOD系统的免疫应答能力，在12-48h，刺参体腔内和波里氏囊内的体腔液SOD活力都呈先上升后下降趋势。从整体趋势来看,体腔内体腔液SOD，波里氏囊内体腔液SOD，在抵御灿烂弧菌刺激的过程中，没有发现明显的差异，这说明SOD在体腔和波里氏囊内都占据了一个主要的地位。此外,两者后期变化一致性显著降低,有可能是该病频发的重要原因之一。3.4讨论细菌作为细菌性疾病的引发者，一直是仿刺参的最主要病原，令人震惊的是，仅在仿刺参腐皮综合症就有着超过8种的细菌性病原,这直接表面了细菌性病害对整个仿刺参养殖业的阻碍与制约。仿刺参属于无脊椎动物的一种，它的内部没有特异性免疫，仅仅能够依靠体内的免疫因子也就是相应的酶来来识别、抑制、杀伤和清除病原。不同免疫因子通常具有明显不同的免疫分工。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶通过水解作用，一方面可以修饰病原外部的分子结构，从而增强机体对病原的吞噬作用，另一方面可以水解病原表面的磷酸基团，从而直接杀死或抑制病原体。超氧化物歧化酶能够清除机体吞噬或包囊病原体等过程中所产生的过量活性氧，防止过量活性氧对机体自身的氧化伤害，同时，在清除过量活性氧的过程中还能够催化超氧阴离子，产生具有很高杀菌活性的H2O2,直接参与杀菌、抑菌过程。3.4.1酸性磷酸酶ACP酸磷酶是一组在酸性条件下水解各种磷酸酯的酶，它在pH=5.0是活性最强，对底物特异性较低。ACP在细胞内主要定位于溶酶体内，在细胞核、胞液、微粒体、高尔基体中也存在。它是由两个相同的亚单位构成的糖蛋白，在高等动物中存在于前列腺、肝、肾、骨等各种组织细胞中，当细胞损伤时，ACP释放入血造成ACP含量升高。酸性磷酸酶是仿刺参吞噬细胞中溶酶体的标志酶和巨噬细胞中的重要水解酶，它可以消化细胞中由异物颗粒形成的吞噬体[31,32]，增强对病原的吞噬作用，达到抑制或杀死病原菌的目的。在缺乏特异性免疫球蛋白的软体动物体内，酸性磷酸酶的作用显得尤为重要，它能够通过水解作用将表面带有磷酸酯的异物破坏，从而达到预防病原体感染的目的，并可修饰或改变外来异物的表面分子组成，从而增强血细胞对异物的识别，起到调理的作用，加快吞噬细胞对异物的吞噬和降解速度。灿烂弧菌刺激12小时后，仿刺参体腔内体腔液中的酸性磷酸酶活力显著升高，这表明体腔内体腔液中ACP可有效应答病原菌的入侵。有研究表明[32]，在仿刺参应答灿烂弧菌和假交替单胞菌过程中，体腔细胞内酸性磷酸酶介入要晚于体腔液上清中的酸性磷酸酶，这与受大肠杆菌(Escherichiacoli)感染栉孔扇贝(Chlamysfarre-ri)血细胞和血清中酸性磷酸酶活力变化相似[33]。3.4.2碱性磷酸酶(ALP)碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，在碱性条件下可以水解病原表面的磷酸基团，达到杀死或抑制病原体的效果，其对水体环境中钙质、磷酸钙等的形成有着十分重要的作用。碱性磷酸酶在机体内分布广泛，在消化道中主要参与脂质、葡萄糖和无机磷酸盐等营养物质的消化吸收，通常被认为是消化道吸收营养物质的标志酶。对于水产动物来说，是一种不可或缺的生存必须酶类。碱性磷酸酶活力测定结果显示，灿烂弧菌刺激后仿刺参体腔内与波里氏囊内体腔液碱性磷酸酶活力均显著升高，与鳗弧菌刺激后的青蛤和栉孔扇贝中的结果相似。这与哈维氏弧菌、假交替单胞、溶壁微球菌和停乳链球菌4株细菌刺激后的早期(4h、12h)，仿刺参体腔液中碱性磷酸酶活力均明显低于对照水平的变化不同[34]。本实验结果表明，仿刺参体腔内与波里氏囊内体腔液碱性磷酸酶均可有效应答灿烂弧菌的入侵，且前期体腔内体腔液应答更为迅速，后期波里氏囊发挥至关重要的作用。3.4.3超氧化物歧化酶SODSOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，该酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。自由基主要是在细胞对异物的吞噬过程中产生的，过多的自由基对细胞和机体有很大的损伤，SOD是清除自由基最重要的一种抗氧化物酶。传统SOD测定的方法是邻苯三酚法，超氧化物歧化酶是无脊椎动物体内重要的自由基清除，能够清除机体吞噬病原体等过程中产生的过量活性氧，免除其对机体自身的损伤[31]，同时还可以催化超氧阴离子，产生具有强杀菌活性的H2O2，直接参与抑菌、杀菌过程。超氧化物歧化酶既直接参与到病原的杀伤、抑制过程，又在机体杀伤、清除病原过程中起到自我保护的重要作用，因此超氧化物歧化酶活力水平是反映机体免疫抵抗力的重要指标[30]。相关研究表明，在仿刺参中，不同细菌刺激后4h，体腔液超氧化物歧化酶活力变化明显，表明超氧化物歧化酶是仿刺参中的急性应激类蛋白，与曼氏无针乌贼(Sepiellamaindroni)中的报道结果相似。此外，与紫贻贝(Mytilusedulis)中的结果相似，灿烂弧菌刺激后仿刺参体腔液超氧化物歧化酶活力显著下降，表明注射的灿烂弧菌抑制了仿刺参超氧化物歧化酶系统的应答能力。本文结果显示，刺参体腔内和波里氏囊内体腔液SOD酶活均较高，无明显差异，我们分析认为是SOD在刺参免疫过程中扮演了重要的防御作用[30-35]。第四章结论与展望4.1结论本文采用了4种不同检测技术，分别研究了在经灿烂弧菌刺激后刺身体腔内和波里氏囊内体腔液的免疫应答，分析实验结果得出以下结论：(1)在ACP活力测定中，相比于体腔内体腔液,囊内体腔液ACP在针对灿烂弧菌刺激后的早期免疫应答中可能起着更重要的作用。(2)在AKP活力测定中，刺参经病原菌刺激后，相比于波里氏囊内体腔液AKP变化情况，前期体腔内体腔液AKP呈现了持续性显著升高，体腔内体腔液AKP具备更迅速的应答力，抵御病原菌的入侵，后期波里氏囊内体腔液AKP更快速的发挥作用。(3)在CAT活力测定中，在感染病原菌前期,波里氏囊内体腔液CAT不断升高，波里氏囊扮演者重要的角色；后期体腔内体腔液CAT显著增高，可能是波里氏囊的对病原菌的及时有效应激，使机体恢复正常。(4)在SOD活力测定中，刺参经灿烂弧菌刺激后，从整体变化趋势看，刺参体腔内体腔液与波里氏囊内体腔液内SOD，在抵御灿烂弧菌刺激的过程中，没有发现明显的差异，这说明SOD在体腔和波里氏囊内都占据了一个主要的地位。4.2展望本试验通过通过酶学技术研究刺参体腔内和波里氏囊内体腔液的免疫应答响应并比较两者之间的差异，需深入研究：刺参体腔液中的多种免疫因子可有效应答病原菌的刺激，然而，仿刺参体腔液中的免疫相关酶在不同病原菌刺激后的应答特性尚不明确，有待探究。 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