DB15∕T 2397-2021 黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术规程

ICS65.020.01

CCSB05

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内蒙古自治区地方标准

DB15/T2397—2021

黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术规程

Codeofprcticeoftissuecultureandseedlingtransplantingofstevia

inblacksoilarea

2021-09-26发布2021-10-26实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2397—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、扎赉特旗农牧和科技事业

发展中心。

本文件主要起草人：杨彦明、刘复伟、乌恩、陈新宇、张悦忠、李志新、于长生、潘云鹤、董津蒙、

王凌云、白桂香、艾俊国、陶凤英。

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DB15/T2397—2021

黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术规程

1范围

本文件规定了内蒙古黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术的无菌环境准备、无菌苗培养、组织培养、

试管苗移栽关键技术。

本文件适用于内蒙古自治区呼伦贝尔市、兴安盟、通辽市。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB13735聚乙烯吹塑农用地面覆盖薄膜

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

甜叶菊steviarebaudianahemsl.

菊科甜叶菊属多年生草本植物，原产于南美巴拉圭和巴西交界的高山草地。

4无菌环境准备

4.1湿热灭菌

培养基（不耐高温成分除外）、无菌水、玻璃器皿（三角瓶、空三角瓶、培养皿）、金属器械（剪

刀、镊子）等采用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌处理。灭菌锅内加水至底部有水析出，放入物品、关严

盖子，调整温度121℃，时间20min。待温度上升至95℃以上时，将出气阀和安全阀关闭；当气压降

至0.05Mpa以下时,出气阀和安全阀打开排气，冷却后开盖取出。

4.2干热灭菌

耐热器械（部分玻璃器皿、坩埚）采用干热灭菌，利用烘箱加热到170℃，持续90min。

4.3过滤灭菌

植物激素（6-BA、NAA、IBA）采用过滤灭菌。采用滤膜网孔直径0.45μm以下的微孔过滤灭菌器。

4.4灼烧灭菌

无菌操作器械采用灼烧灭菌。灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或酒精灯灼烧灭菌。

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4.5擦拭、喷雾灭菌

桌面、墙面、双手、植物材料表面用药剂涂擦、喷雾灭菌，用75%的酒精或0.1%的新洁尔灭菌。

超净工作台用75%的酒精喷洒。

4.6紫外线灭菌

接种室、培养室定期用紫外灯灭菌。打开室内及超净工作台，用紫外灯杀菌20min～30min，关

闭紫外灯，10min后进入缓冲间。

4.7熏蒸灭菌

接种室和培养室每年用高锰酸钾和甲醛混合熏蒸1～2次。熏蒸时，关闭房间，用大烧杯盛装甲醛和

高锰酸钾溶液，用量为甲醛10ml/m³、高锰酸钾5g/m³，熏蒸2d～3d，2d～3d后人员方可进入。

5无菌苗培养

5.1种子处理

取甜叶菊种子，每10粒1份，在超净工作台内将种子装入无菌离心管中消毒。75%酒精消毒10s→

0.1%HgCl2消毒6min，每隔5s～10s摇动1次离心管，无菌水冲洗4～5次，后置于无菌滤纸下吸干。

用70%乙醇30s→0.1%HgCl2消毒6min→15%H2O2消毒20min，每隔5s～10s摇动1次离心管，无菌水

冲洗4～5次，后置于无菌滤纸下吸干。

5.2种子装瓶

将灭菌后装有培养基的三角瓶在超净工作台内打开，封口膜倒放于台面。将消毒、吸水干燥后的种

子用镊子均匀播于培养基上，播后将瓶口用酒精灯灼烧灭菌，冷却后封口、扎紧。

5.3种子培养

将播种后的三角瓶在25℃恒温培养箱内暗培养至发芽后，继续保持光照10h/d～16h/d培养至苗

高3cm～5cm待用。

6组织培养

6.1培养基选择及制备

6.1.1MS培养基

取40gMS粉，溶于1L蒸馏水，调pH为5.8，加琼脂5g，灭菌20min后，冷却备用。

6.1.21/2MS培养基

取20gMS粉，溶于1L蒸馏水，调pH为5.8，加琼脂8.5g，灭菌20min后，冷却备用。

6.1.3诱导培养基

MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。

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6.1.4增殖培养基

MS+1.0mg/L6-BA+O.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。

6.1.5生根培养基

1/2MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.2mg/LIBA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂。

6.2材料选择及接种

取无菌苗上的带腋芽茎段作为外植体，用蒸馏水冲洗干净，将茎段切割成1cm左右带腋芽小茎段，

于超静工作台上用75%酒精消毒10s，再用0.1%HgCl2消毒6min，每隔5s～10s搅动1次，无菌水冲

洗5次，消毒处理后的外植体，接种在MS培养基中，约30d后腋芽长成芽苗。无菌苗可作为组织培养外

植体，在超净工作台中将无菌苗切下1cm左右小段，转移至诱导培养基。

6.3培养条件

培养温度为24℃～28℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lx。

6.4试管苗增殖

将无菌苗切成单株，接种于增殖培养基中，每瓶接种5株。

6.5试管苗生根

选取生长状态基本一致的试管苗，并将苗切成单株，接种于生根培养基中，每瓶接种5株。

7试管苗移栽

7.1试管移栽

将试管苗根部培养基清洗干净移栽于苗盘，以湿润河沙为栽培基质，覆盖塑料薄膜，温度控制在

20℃～30℃，中午适当遮荫，20d后统计试管苗成活率。塑料薄膜使用符合GB13735的规定。

7.2大田移栽

当地日平均气温稳定在12℃～15℃