不同分子量红芪多糖结构表征及体外抗氧化活性比较

不同分子量红芪多糖结构表征及体外抗氧化活性比较摘要：目的制备不同分子量红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4，对其初级结构和分子量大小进行测定并研究分离纯化过程对红芪多糖体外抗氧化活性的影响；比较紫外-可见分光光度法与酶标仪两种仪器测定结果，选择出更加简便，准确、快捷的方法。方法采用水提醇沉、sevage、Sephadex系列凝胶洗脱等方法分离纯化制备不同分子量的红芪多糖；红外测定其初级结构，水相GPC测定分子量大小及分布情况；紫外-可见分光光度法和酶标仪法测定红芪多糖对DPPH自由基清除能力大小。结果经Sephadex系列凝胶洗脱得到红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4，可能为β-吡喃型糖。红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量分布图均呈单一峰，其Mw分别为3.27E+04、2.89E+04、3.20E+04，Mw/Mn分别为8.83、6.79、5.89，分子量分布较宽。纯化后的红芪多糖较红芪总多糖在较低浓度即可对DPPH自由基发挥作用，但总体清除能力降低。结论红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4是β-吡喃型糖，分子量不同，具有一定抗氧化能力的多糖；采用酶标仪法去测定更简便、准确、快捷，可以为制备量少的样品测定提供方法参考。关键词：红芪多糖；抗氧化；分子量；红外红芪为豆科植物多序岩黄芪（HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.）的干燥根，具有补气升阳、生精养血等功效，临床常用于治疗气虚等证[1]。红芪含有多种的活性成分，其中红芪多糖为主要有效成分之一。现代药理研究表明免疫反应和肠粘膜氧化应激损伤是UC的重要发病机制，红芪多糖具有良好的抗炎、调节免疫、和抗氧化应激等方面的作用[2-4]，因此预示在UC的治疗上具有良好应用前景。前期课题组研究发现红芪水提取部位对UC具有良好的治疗作用，分析其主要发挥作用的是总多糖[5]。本实验对分离出来的红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量及其分布情况进行测定，对其结构进行初步研究，同时探究不同分子量红芪多糖的体外抗氧化能力的大小及红芪多糖体外抗氧化活性在分离纯化过程中的变化，为后续研究不同分子量红芪多糖对UC的作用奠定基础，也为解释多糖构效关系，进一步扩大红芪在临床的应用范围作出贡献。1仪器与材料仪器型号公司红外光谱仪ALPHA-T布鲁克仪器有限公司GPC-凝胶渗透色谱系统P230型Elite，Dalian紫外可见分光光度计UV-3300上海美普达仪器有限公司超声波清洗器KQ-500D型昆山市超声仪器有限公司酶标仪IMARK美国伯乐公司电子分析天平上海实验器材有限公司试剂公司1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基\o"北京中生瑞泰科技有限公司"北京中生瑞泰科技有限公司乙醇天津市大茂化学试剂厂丙酮天津东方化工厂，分析纯SephadexG-25、G-75、G-200北京索莱宝生物科技有限公司96微孔板上海晶抗生物工程有限公司中药药材红芪于甘肃省陇西县首阳镇采（购），由甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定其为豆科植物多序岩黄芪（HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.）的干燥根。2研究方法与结果2.1不同分子量红芪多糖的制备[6]称取适量的红芪，采用的方法为水提醇沉法，得红芪总多糖，sevage法除蛋白，采用Sephadex系列G-25、G-75、G-100柱洗脱，苯酚-浓硫酸法检测，合并主流峰，醇沉后分别得到红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4。2.2红芪多糖HG-4的红外光谱分析分别精密称取红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4粉末，溴化钾（KBr）适量，充分研磨均匀，压片，测定得到IR谱图。见图1红芪多糖HG-2的红外光谱图红芪多糖HG-3的红外光谱图红芪多糖HG-4的红外光谱图图1红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4的红外光谱图结果:在3600～3200cm-1、3000～2800cm-1和1400～1200cm-1处均具有多糖的特征吸收峰。在3355cm-1有强吸收峰，可能是氢键-OH的伸缩振动引起；在2934cm-1有吸收峰，可能是CH伸缩振动引起；在1609cm-1～1420cm-1有吸收峰，可能是CH或OH的面内伸缩振动；在1024cm-1有β-吡喃糖环形成的特征吸收峰，在763.63cm-1处有吸收峰，可能是由吡喃型糖环形成的特征峰。综上可知HG-2、HG-3、HG-4均满足多糖的一般特征，并且存在β类型的苷键，可能为β-吡喃型糖。2.3红芪多糖HG-4分子量2.3.1水相GPC条件仪器型号：P230型GPC-凝胶渗透色谱系统（Elite，Dalian）；色谱柱：PLaquagel-OHMIXED（7.5mml.D*30cm）（Agilent，US）；进样流速：1.0mL·min-1；柱温：40℃；流动相：0.1MNaNO3。制备供试品溶液的方法：分别准确称量红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4样品6.0mg，量取3.0mL超纯水将其溶解，过0.22m水相滤膜，备用。2.3.2不同分子量红芪多糖的分子量测定以上述条件对红芪多糖HG-4进行水相GPC分析，得到红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4的重均分子量及分子量分布。结果：可知后红芪多糖HG-2的重均分子量（Mw）是32700，分散系数为8.83；HG-3的Mw是28900，分散系数为6.79；HG-4的Mw为32000，分子量分散系数5.89。由此可知由葡聚糖凝胶G-25、G-75、G-100洗脱下来的红芪多糖具有不同的分子量，且分布带较宽，这可能与其单糖组成的糖链长短不同有关，其分子量呈单一峰，表明其纯度较高，这与课题组前期研究其相应的单糖组成和纯度鉴定结果相符合。样品名称分子量类型MnMwMzMw/MnHG-2平均分子量3.71E+033.27E+044.52E+058.83HG-34.25E+032.89E+043.44E+056.79HG-45.44E+033.20E+041.68E+055.89表4红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4的平均分子量红芪多糖HG-2分子量分布图红芪多糖HG-3分子量分布图红芪多糖HG-4分子量分布图（横轴：分子量对数；纵轴：曲线上某一点纵轴值为每个分子量下样品分子的含量多少相关的数值。）图7红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量分布图2.4红芪多糖体外抗氧化活性比较2.4.1紫外-可见分光光度法测定[7]脱蛋白红芪多糖体外抗氧化测定：精密称取脱蛋白红芪多糖适量，蒸馏水配制成0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4mg/mL系列浓度梯度。精密吸取脱蛋白红芪多糖溶液3mL，加入0.09mmol/LDPPH乙醇溶液1mL，充分混匀后室温避光反应30min，以EtOH作参比在520nm处测定吸光度A样。取2mLDPPH与1mL无水乙醇混合液，以EtOH作参比在520nm处测定吸光度A对。取脱蛋白红芪多糖溶液2mL与1mL乙醇溶液混匀，以EtOH作参比在520nm处测定吸光度A空。计算清除率（%）=1-（A样-A空）/A对*100。结果知采用紫外-可见光分光光度法测得的脱蛋白红芪多糖在2.4mg/mL时清除率是36.7%，在0.6-2.4mg/mL浓度范围内清除作用于质量浓度呈正相关。见图1。图1脱蛋白红芪多糖测定结果方法学的考察精密度实验：精密称取脱蛋白红芪多糖适量，配制成1mL/mg多糖溶液，按照“”项下方法在520nm处测定吸光度，连续测定6次，计算结果的RSD值为0.38%，说明所使用的仪器精密度良好。重复性实验：精密称取脱蛋白红芪多糖适量，配制成6份浓度为1mL/mg多糖溶液，按照“”项下方法在520nm处测定吸光度，计算结果的RSD值为2.13%，说明此实验方法重复性良好。2.4.2酶标仪法测定[8]不同分子量红芪多糖体外抗氧化测定：采用96微孔板法测定不同分子量红芪多糖对DPPH自由基清除能力即精密称取适量的红芪总多糖，蒸馏水充分溶解，配制成一定浓度梯度。精密吸取红芪总多糖溶液3mL，加入0.09mmol/LDPPH乙醇溶液1mL，充分混匀后室温避光反应30min，移液枪吸取200uL于96微孔板在520nm处测定吸光度，计算清除率，公式如下：清除率（%）=1-（A样-A空）/A对*100（其中A样：红芪多糖溶液+DPPH-乙醇溶液测得的吸光度值；A空：红芪多糖溶液+无水乙醇测得的吸光度值；A对：蒸馏水+DPPH-乙醇溶液测得的吸光度值。）脱蛋白红芪多糖、红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4测定方法同上。结果见图2-6。结果：采用酶标仪法测得的脱蛋白多糖在0.6-2.4mg/mL范围内质量与浓度呈正相关，最大清除率为38.4%，与UV-Vis测定结果相近。红芪总多糖的质量浓度在1-6mg/mL范围内清除率随质量浓度增大而递增，在5mg/mL时清除率达到50%以上。而不同分子量红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4测定结果相近，在0.6-2.4mg/mL时，红芪多糖HG-2最大清除率为44.5%，红芪多糖HG-3最大清除率为40.9%，红芪多糖HG-4最大清除率为46.2%。图2红芪总多糖测定结果图3脱蛋白红芪多糖测定结果图4红芪多糖HG-2测定结果图5红芪多糖HG-3测定结果图6红芪多糖HG-4测定结果方法学的考察精密度实验：精密称取脱蛋白红芪多糖适量，配制成1mL/mg多糖溶液，按照“”项下方法在520nm处测定吸光度，连续测定6次，计算结果的RSD值为0.18%，说明所使用的仪器精密度良好。重复性实验：精密称取脱蛋白红芪多糖适量，配制成6份浓度为1mL/mg多糖溶液，按照“”项下方法在520nm处测定吸光度，计算结果的RSD值为1.62%，说明此实验方法重复性良好。3讨论红芪是甘肃道地药材，具有多种化学成分和药理作用，其中红芪多糖是红芪的主要活性部位，具有良好的抗氧化、免疫调节作用。现代研究表明免疫反应和肠粘膜氧化应激损伤是UC的重要发病机制，预示红芪多糖在UC的治疗上可能具有一定治疗作用。本实验对分离纯化得到的红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4进行初步结构发现其均具有多糖的特征吸收峰，存在β类型的苷键，有吡喃型糖环形成的特征峰，可能为β-吡喃型糖。而红芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量分布图均呈单一峰且分子量分布较宽。体外抗氧化实验发现脱蛋白红芪多糖与不同分子量红芪多糖相较红芪总多糖在低浓度下即可对DPPH自由基发挥作用，说明其具有一定的抗氧化能力；但红芪总多糖在5mg/mL时清除率可达50%以上，而纯化后的脱蛋白红芪多糖和不同分子量红芪多糖清除率则均低于50%，说明红芪多糖可能在纯化过程中抗氧化活性会下降，具体原因值得进一步探讨研究。目前体外抗氧化实验多采用UV-Vis测定，但其工作量大，操做过于繁琐。而酶标仪是酶联免疫测定的常规仪器，在医药领域的应用在不断扩大。本实验还比较了UV-Vis和酶标仪法两种抗氧化测定方法，研究发现酶标仪法更简单，方便，快速，敏捷，且结果准确可靠，而且样品的需求量较少，这为制备量少的样品测定提供方法参考。[1]中国药典[S].2015年版.一部.425-1749.[2]黎笑兰,张新广,尹少萍.白芨多糖抑制溃疡性结肠炎大鼠炎性反应与氧化应激[J].基础医学与临床,2020,40(02):224-228.[3]宋亚芳,裴丽霞,赵婷婷,孙建华.溃疡性结肠炎免疫因素发病机制的研究进展[J].医学研究生学报,2019,32(04):432-436.[5]牛江涛,曹瑞,张泽国,徐富菊,李越峰.红芪多糖的提取分离及药理作用研究进展[J].中国药房,2017,28(01):130-133.[6]燕玉奎,王志旺,郭玫,周尚儒,王君梅.