不同年限、地域黄芪石蜡切片与粉末切片的制作与分析

不同年限、地域黄芪石蜡切片与粉末切片的制作与分析摘要：目的：通过石蜡切片的制作,观察黄芪根茎横切的显微特征;通过粉末切片的制作,观察黄芪的组织碎片、细胞形状及内含物的特征。方法：采用石蜡切片技术及染色技术对黄芪根茎进行石蜡切片的制作;采用植物粉碎技术对黄芪进行粉碎制成粉末切片。结果：通过对石蜡切片的观察可发现黄芪根部的木质化表皮细胞、木质部、导管壁细胞被翻红染液染成红色;通过对粉末的显微观察区分出不同的组织与类型细胞的形状,发现不同产地及年限的黄芪在外观及显微结构上都有较大的差异,结论：从黄芪根部组织与粉末切片特征可明显区别辨认出该药材;从黄芪的粉末切片可发现规律：相同产地不同年限的黄芪粉末的对比和相同年份的人工种植与野生型的比对与相同产地不同年限的黄芪,在显微观察结果是年份越低其细胞层数越少,细胞密度越大。相同产地和年份的人工种植黄芪与野生黄芪的比对,人工黄芪的生长速度更快,在显微观察下野生黄芪具有小年份黄芪的特点。关键词：不同年限;黄芪;石蜡切片;粉末切片;显微观察PreparationandanalysisofparaffinsectionandpowdersectionofAstragalusmembranaceusindifferentyearsandregionsAbstract:Objective:Toobservethemicroscopiccharacteristicsofastragalusrootandstemtransectionbymakingparaffinsection,andtoobservethecharacteristicsoftissuefragments,cellshapeandcontentsofastragalusrootandstemtransectionbymakingpowdersection.Methods:therhizomeofAstragalusmembranaceuswasmadebyparaffinsectiontechnologyanddyeingtechnology,andtherhizomeofAstragalusmembranaceuswasmadeintopowdersectionbyplantcrushingtechnology.Results:throughtheobservationofparaffinsection,wecanfindthatthelignifiedepidermalcells,xylemandvesselwallcellsofastragalusrootaredyedredbyturningreddyesolution;throughthemicroscopicobservationofpowder,wecandistinguishtheshapesofdifferenttissuesandtypesofcells,andfindthattherearegreatdifferencesinappearanceandmicrostructureofastragalusrootindifferentplacesandyears.Conclusion:fromtheroottissueandpowderofastragalusrootThecharacteristicsofthefinalsectioncanclearlydistinguishthemedicinalmaterial;fromthepowdersectionofAstragalus,wecanfindtherule:thecomparisonofAstragaluspowderofdifferentyearsinthesameplaceoforigin,thecomparisonofartificialplantingandwildtypeinthesameyearandthecomparisonofAstragalusofdifferentyearsinthesameplaceoforigin.Inthemicroscopicobservationresults,thelowertheyear,thefewerthecelllayers,thegreaterthecelldensityandthesmallerthevolume.ComparedwiththewildAstragalusinthesameplaceandyear,thegrowthrateoftheartificialAstragalusisfaster,andthewildAstragalushasthecharacteristicsofsmallyearAstragalus.Keywords:differentyears;astragalus;paraffinsection;powdersection;microscopicobservation1.前言黄芪（Stragalus)又称为绵芪,是豆科黄芪属生长多年的草本植物,羽状复叶,有14-28片叶子,叶长为5-10cm;柄长为0.5-1cm;卵圆形,线状披针形或披针形,长为6-9mm,叶下近似无毛;小叶呈长卵圆形或类椭圆形,长为5-35mm,宽为2-10mm,尖端微凹或钝圆,无明显小尖头,底部为圆形,上叶面近似无毛呈绿色。有较密花序,为8-16朵;花梗的长度与叶相等或稍长;总花梗长度为3-4mm;花萼呈钟状,长为5-7mm,外被为黑色柔毛或白色,萼筒有时近似无毛,仅萼齿有毛,萼齿较短,多为钻形至三角形,总长只有萼筒的1/6-1/4;有淡黄色或黄色的花冠,翼瓣较旗瓣较短,瓣片长圆形,旗瓣为倒卵形,长为13-19mm,顶端微凹,基部是短瓣柄。子房有柄,外被有细柔毛。荚果薄膜质,为半椭圆形,长为15-25,宽为8-15mm,尖端有刺尖,有黑色细短柔毛或白色的两面被,果颈超出萼外;有种子4-8颗。花期为6到8月份,果期为7到9月份有膜荚黄芪与内蒙古黄芪两种,黄芪性喜凉爽,耐寒耐旱,怕热怕涝,适宜在土层深厚、富含腐殖质、透水力强的沙壤土种植。强盐碱地不宜种植。中国的北部为主要产地,还分布于原苏联。主要生长在疏木下、林边缘或灌木丛下,也在草甸和山坡草地等地分布,中国境内以栽培为主,是我国常用的中草药之一。黄芪的药用价值至今已有两千多年的历史,针对疽病治疗的药方中就加有黄芪,它有保肝、利尿、增强人体免疫力、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。但气滞湿阻、痈疽初起、食积停滞或溃后热毒尚盛、表实邪盛等,以及阴虚阳亢者,应当禁止服用。我国结果长期大量采挖,野生黄芪急剧减少,有趋于绝灭的危险。为国家三级保护植物。同时黄芪中含有黄芪多糖和黄芪皂苷,对于不同年限和不同产地的黄芪,在黄芪的外观及显微特征上都有差异。在生物的形态结构研究中越来越依赖显微镜的观察,并且利用显微镜观察所使用的材料必须要安置在一定规格的载玻片上同时能透光,简而言之所观察的材料必须能够制成玻片标本。由于显微镜的出现植物组织制片技术成为植物研究中的一项重要技术,成为人们认识植物体结构的有效手段,在植物生物学的研究中占据重要地位。植物组织切片技术已经成为植物学工作者常用的一种有效手段。随着各种新设备的问世和新实验方法的不断地更新和运用,石蜡切片技术也不断渗入和使用到许多新领域中,做为基础技术为实验提供有效的使用样品和观察样本,是组织解剖学研究中最经典的实验技术之一,是观察植物细胞、组织和器官的用效手段之一并且具有易操作、成本低和能够永久保存的特点。利用石蜡切片技术可清晰的观察到各部分组织的形态特征,为不同产地黄芪的鉴别、分类等提供实验依据。在植物学研究中特别是非均质木质化的中草药中,中草药的粉末显微鉴定非常重要,生药的组织碎片、细胞形状及内含物的特征的观察离不开生药粉末的显微观察,此方法是鉴别生药的纯度及真伪的重要方法,并且使用显微镜来观察中草药中的特有细胞及内含物是保证临床用药安全有效的先决条件,高效快捷的植物石蜡组织切片与粉末切片的制作就能满足我们对于植物,特别是中药材的研究提供了有力的保障。2.材料与实验仪器2.1药材浑源黄芪,甘肃黄芪,购自于浑源黄芪药材有限公司2.2试剂沙黄（国药集团）,无水乙醇（国药集团）,叔丁醇（国药集团）,甲醛（国药集团）,丙酸（国药集团）,甘油（国药集团）,过氧化氢（国药集团）,冰醋酸（国药集团）,二甲苯（国药集团）,氯化氢合（国药集团）,石蜡（国药集团）,树胶（国药集团）,牛皮纸（喜瑞）2.3仪器粉碎机(武义海纳电器有限公司),100ml烧杯（福州泰美实验仪器有限公司）,玻璃棒（福州泰美实验仪器有限公司）,载玻片（福州泰美实验仪器有限公司）,盖玻片（福州泰美实验仪器有限公司）,显微镜（安徽桦锐文具有限公司）,真空泵（力辰科技）,切片机（华海教仪）,烘干箱（力辰科技）3.实验方法3.1石蜡切片的制作首先将买回来的黄芪根茎放在流水下清洗,待黄芪根茎的泥渍清洗干净后,取出黄芪,用毛刷、牙签清洗黄芪表皮褶皱;洗净后的黄芪截成1cm*1cm*1cm的小段。清洗完毕后使用滤纸将材料擦干,然后将材料放入现配的固定液中(75%叔丁醇:丙酸：45%甲醛:丙三醇:=75:10:8:7)中,然后利用真空泵抽真空使溶液中没有气泡产生且材料完全下沉,取出材料放在带盖玻璃瓶中置于4°C下保存两天以上。需要制作石蜡切片时将材料从固定液中取出,用蒸馏水冲洗5分钟,然后将茎段材料置于冰醋酸-过氧化氢混合溶液(3:2),抽真空1小时,再将材料转入装有丙三醇-65%叔丁醇混合溶液(3:2)的带盖玻璃瓶中,放进55°C恒温培养箱中处理48小时以上,设置三次重复,进行软化处理。软化后的根茎进行材料脱水,其具体流程如下：A：酒精X：二甲苯70%A（2h）→70%A(2h)→70%A（2h）→80%A（过夜）→85%A（2h）→95%A（2h）→100%A（1h）→100%A（1h）→1/2A+1/2X（1h）→1/2A+1/2X（1h）→X（1h）→X（1h）。用蒸馏水冲洗脱水后的材料,洗去材料表面所附的软化剂。完成清洗后进行叔丁醇梯度脱水法对材料进行脱水加透明的处理。方法:采用叔丁醇梯度脱水法,即50%叔丁醇1.5小时→70%叔丁醇1.5小时→85%叔丁醇1.5小时→95%叔丁醇1小时→纯叔丁醇30分钟→纯叔丁醇30分钟。提前准备好装有碎石蜡（熔点48-50℃）的带盖玻璃瓶将透明后的材料用镊子取出放玻璃瓶中,加盖放入40℃温箱,放置1天进行溶蜡。次日去掉玻璃瓶的盖子,再将温箱温度调至55℃放置一周,使其透明剂充分挥发。备好若干个玻璃瓶待材渗蜡完全后转移至装有熔点为60-62℃石蜡的玻璃瓶里,放置在温度为68℃的烘箱内进行保存,3h换一次熔点60-62℃的石蜡,重复三次开始包埋。浸蜡后的黄芪材料放在牛皮纸折叠成的包埋盒中,在包埋开始前向包埋盒中倒入石蜡溶液,然后将渗蜡完全的黄芪根茎放入其中,使用解剖针调整材料的位置以满足切片的需要,在进行包埋时,材料要在常温下冷却,待石蜡由溶液凝固成石蜡块将材料置于-20°C下放置2分钟后取出。将要进入切片环节时将材料从包埋盒中取出,此时材不规则需要用双面刀片进行修改,使每个小块包含一个黄芪根段,并将石蜡块修成梯形,切面在梯形的上部。固定蜡块时要梯形的底部用烧热的蜡铲加热使蜡块固定在木台（2.5cm×2.5cm×3cm）上,同时保证黄芪根段的切面与木台的粘贴面平行。将粘有蜡块的小木块固定在石蜡切片机上,并调整切距到适当大小,转动调节器调切片厚度10μm进行切片。注片时要一手转动切片机,另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带,选取切片效果最好的几张材料进行观察。取一片新的载玻片,用干净的擦镜纸涂抹均匀后,在其中央滴一滴粘片剂,将取下的具代表性的蜡带切成小段置于载玻片上,将载玻片放到恒温箱中（保持40℃）进行烫片。待充分烫平后将其取出待水分充分烘干。进行脱蜡与染色步骤,具体步骤如下：A：酒精X：二甲苯100%X（20min)→50%X+50%A(10s)→100%A(10s)→95%A(10s)→85%A(30s)→50%A（30s）→30%A（30s)→1%番红溶液(3h)→蒸馏水（10s）→50%A+HCI（10s）→95%A+氨水（10s）→1%固绿（95%A配制）(1min)→95%A(1min)→100%A(10s)→100%A(30s）→50%X+50%A(30s)→100%X(30s)→100%X(30s)。番红染剂颜色时间3小时以上,随后的两次快速酒精清洗,是预防洗掉染上的番红。取出染色成功的石蜡切片使用中性树胶进行封片,将黄芪切片放置在试验台上,在切片中央滴一滴树胶溶液,待其溢至材料边缘,用镊子取一片干净的盖玻片,从黄芪切片的一侧倾斜接触树胶,缓慢盖上,待玻片完全盖上用镊子轻轻盖压玻片,赶出切片内的气泡。3.1粉末切片的制作首先将买回来的黄芪饮片放在流水下清洗,并用毛刷、牙签清洗黄芪表皮褶皱;洗净后的黄芪截成的小段。将切割后的黄芪材料放入烘箱中调至60℃烘干,烘干后进行冷却,冷却后的黄芪材料用粉碎机粉碎,粉碎好的黄芪粉末过五号目筛,取过完筛部分的粉末,再过六号目筛,取筛内粉末,在载玻片上滴一滴清水,用牙签将黄芪粉末均匀挑在载玻片上,涂抹均匀盖上玻片,利用显微镜进行观察。结果与观察4.1黄芪的横切面特征黄芪药材样品横切面显微特征MicroscopiccharacteristicsofthecrosssectionofAstragalus1.形成层2.韧皮纤维3.木栓层4.栓内层5.木质层6.韧皮射线黄芪性状:两端平坦,略弯曲,上端较细,下端较粗,表面棕褐色,有纵皱纹,质地坚硬同时具有一定韧性不易折断,折断后的断面不平坦,纤维性强,折断后有粉尘,横切面有放射状纹理和裂隙,断面皮部呈黄白色,木质呈现出黄棕色,约占黄芪总截面的1/2。根横切面:由数列木栓细胞构成的木栓层,横切切向延长可见韧皮部外细胞层;管状木栓组织,韧皮纤维成束,形成层成环。木质部导管单个2~3相聚,木纤维成束,存在导管间,多30~50个成束。纤维成束,木薄壁细胞散在,含少量淀粉粒。壁稍厚,有多数单纹孔。4.2黄芪石蜡切片的显微观察黄芪组织石蜡切片ParaffinsectionofAstragalus黄芪石蜡切片的的特征：由黄芪横切石蜡切片可观察出黄芪的木栓层是由8列左右的木栓细胞组成,细胞在显微镜的观察下呈切向延长的长方形,细胞壁木栓化加重。栓内层由5列左右的厚角细胞组成。细胞在显微镜的观察下呈切向延长的长椭圆形或长梭形,细胞壁和角隅处不均匀增厚,切向壁厚于径向壁。在显微镜下可观察出黄芪的韧皮部由筛管组织、韧皮纤维、韧皮薄壁细胞和韧皮射线四部分构;木质部由导管木纤维、木薄壁细胞和木射线组成。韧皮射线呈放射状排列由1-4列射线细胞组成,射线细胞群的宽窄在植物体的不同位置有着不一样结构其中在靠近形成层处的射线较窄,细胞呈径向延长的不规则长方形或长圆形。切片组织表明外侧常弯曲,并伴有裂隙。韧皮纤维多成束状与筛管群交互排列,切片组织表面外侧的纤维束较小,由2-20个纤维排列组成,内侧的纤维束较大,由30-90个纤维排列组成,纤维有轻微的木质化。韧皮薄壁细胞呈多为不规则圆形或不规则多角形,组织切片表面在外侧的薄壁细胞形成裂隙。形成层由4-8个薄壁细胞组成,细胞呈切向延长的长方形,形成层的细胞排列整齐,形成环状,束中形成层明显。导管为不规则圆形,单个分布或2-3个相聚,胞壁木化严重,导管在接近形成层出的直径明显小于内方导管的直径。木纤维在形成层处较少,集中在木质部中央,其特征与韧皮纤维相似。木薄壁细胞呈类方形或椭圆形,胞壁较薄,非木化。木射线由1-3列木射线细胞组成,呈切向延长的椭圆形,以射线的方发散。淀粉粒多充满整个射线细胞,在薄壁细胞和栓内皮厚角细胞中也含有大量的淀粉粒,。截面可见径向延长的管状木栓组织,位于木栓层至韧皮部中,呈椭圆形或类圆形,由5-8层扁平的木栓细胞围绕,中央有少数薄壁细胞,壁呈黄棕色木栓化,有黄棕色内含物。所观察的黄芪细胞形状基本完整为类多边形,有的细胞中含有棕色块物为木栓细胞中央有少数薄壁细胞,胞壁呈黄棕色,木质化,有的呈皱缩状。所染色细胞部分为番红染剂所染,是黄芪根茎木质化部分,染色不规则且黄芪细胞内部有颜色较深的部分为黄芪细胞的细胞核。4.4黄芪粉末的显微观察黄芪粉末Astragaluspowder黄芪粉末为黄白色,气味微弱,味微甜,嚼之又豆腥味。粉末切片Powderslice1.木栓细胞2.薄壁细胞3.淀粉粒4.纤维细胞5.导管黄芪的粉末特征:(1)木栓细胞:细胞内还有黄色块状颗粒,细胞类多边形,垂周壁薄;有细波状弯曲。(2)薄壁细胞:细胞内充满淀粉颗粒,细胞壁较薄,细胞连接部分有细小连珠状,有明显的三角形细胞间隙。(3)淀粉粒:极多,单粒类圆形、卵形,复粒少数,半复粒较多。(4)纤维细胞:黄芪内含较多的纤维细胞约占1/2,在显微镜下观察黄芪纤维多成束细长,略微弯曲,细胞壁较厚,非木化细胞,所观察的切面表面有较多不规则纵裂纹,纤维断面不平坦。(5)导管:短节性,以网纹导管为主,偶见环纹和具缘纹孔导管。网纹导管多破碎,网孔狭细,有的侧壁具穿孔。4.5粉末切片观察分析甘肃2年黄芪AstragalusinGansufor2years甘肃5年黄芪AstragalusinGansufor5years甘肃野生5年黄芪FiveyearswildAstragalusinGansuProvince甘肃10年黄芪AstragalusinGansuProvincefor10years浑源5年Hunyuan5years浑源7年Hunyuan7years浑源15年Hunyuan15years浑源柳叶片7年Hunyuanwillowleaffor7years4.6粉末切片观察结果粉末切片能明显观察到细胞壁完整的细胞群,保留了细胞的完整性,能观察出细胞的详细特征。同时此切片为细胞观察,尤其是对细胞群的观察,图中细胞形状规则,细胞多成束,细胞细长,稍弯曲,壁厚,非木化,可判断出细胞多为纤维细胞。纤维细胞密度较大,在粉碎过程中能够最大程度的保留其细胞的完整性。5.讨论本文主要对不同年份的甘肃黄芪和浑源黄芪以及对甘肃野生黄芪与浑源柳叶片黄芪进行粉末观察比对,对于两地的黄芪有着更为详细的认识,能为以后对黄芪进行更深层次的研究提供帮助。结果表明不同年份的黄芪在显微结构上有一定的区别：第一;甘肃2年、甘肃5年与甘肃10年是在相同倍数下的甘肃黄芪纤维细胞,在显微镜下可看出随着黄芪年份的增加,单列单层的纤维细胞密度有所降低、年份越低,黄芪细胞纤维化越严重、木质部越薄。第二：甘肃5年黄芪与野生甘肃5年黄芪,在显微镜下可以清晰看出在相同年份下人工种植黄芪与野生黄芪相比,野生黄芪纤维化严重、纤维细胞密度较大,可以得出相同年份的人工黄芪与野生黄芪,野生黄芪的相对生长速度较缓。第三：浑源5年生、7年生、15年生黄芪,其结论与第一条结论相同,相同产地生产的同种黄芪：年份越低纤维化越严重,木质部越单薄。第四：7年生浑源黄芪和7年生浑源柳叶片黄芪,相比而言柳叶片黄芪的纤维化更严重、韧皮纤维细胞体积相对较小、细胞密度更大。普通黄芪柳叶片黄芪相比而言,普通黄芪的韧皮纤维细胞相对较大,细胞密度不及柳叶片黄芪大,则在相同年限、产地的黄芪,柳叶片黄芪纤维化更严重一些。第五：甘肃5年生黄芪与浑源5年生黄芪,两者在韧皮细胞的密度与体积方面差异不大,在纤显微观察下无较大区别呈现出相同的显微观察结果,故对于同种、同年生黄芪在细胞形态上大体相同。第六：分别为甘肃野生5年生黄芪与浑源5年生黄芪,在细胞体积上甘肃野生5年黄芪较小一些,在相同粉碎程度上细胞层数更多一些,细胞密度更大。第七：甘肃5年生黄芪、甘肃野生5年生黄芪与浑源5年生黄芪,综合以上所述与观察可观察出对于同样年份的黄芪,就显微观察而言野生黄芪的体积是略小,细胞层数较多,纤维化严重。黄芪的显微结构研究为研究中的基础研究,是其它有关黄芪制剂理论研究的基础。对于黄芪的显微观察能够让我们在进行黄芪,尤其是木质化生药的研究中有效的利用石蜡切片技术,进一步了解生药的细胞组织结构;同时以黄芪为基础的研究有助于为我们利用石蜡切片技术来研究其它中药材的显微机构与组织特征研究提供研究基础与理论指导。对与黄芪的显微研究有助于我们了解黄芪的显微组织特征能够更好的把握黄芪组织细胞的特征与辨别,了解黄芪细胞的形态结构,此项研究能为我们在黄芪的真伪鉴别提供有力帮助,。试验对不同年份的甘肃黄芪和浑源黄芪进行粉末观察,无论对于黄芪组织是内含物都进行了细致而又系统的观察,特别是不同类型的组织细胞,有了更加细微深刻的认识,利用粉末研究与切片观察能够帮助我们对与中药材的研究能够更加深入,利用其细胞特点区分野生中药材与人工中药材,对其质量的优劣有一定的把控,同是中药材的年份上与产地也是区分药材优劣的一项重要标准,文章对于不同年份与地域黄芪的研究,有利于我们对于其他种属与地区的黄芪的辨别提供参考,同时黄芪的研究作为一项模板,甚至可以对其他类型的生药在形态结构,组织学研究方面提供理论基础。中药材在当如今的工业化生产中占据的比重越来越大,人们对于中药的认识的越来越深入,使用也越来越信赖,所以对于研究工作者的要求也越来越高,对于中药的何种研究都离不开最基本的观察与辨别,高效快捷的真伪辨别与质量辨别越来越被市场需要,植物石蜡组织切片与粉末切片的制作就能满足高效辨别与快捷辨别。同时在中药制剂的制作过程中植物组织的粉碎也是不可或缺的,不同的粉碎程度直接影响着药物的提取与溶出效果,对于中药的粉碎把握可以起到对重要的资源保护与资源的有效利用,特别是对于珍惜的中药植物的有效利用。参考文献[1]MauJL,ChyauCC,LiJY,etal.FlavorcompoundsinstrawmushroomsVolvariellavolvaceaharvestedatdifferentstagesofmaturity[J].AgricFoodChemistry,1997,45(12):4726－4729.[2]牛耀虎.三种