ELISA法乙肝两对半方法研究

PAGE前言乙型肝炎病毒（hepatisBvirus,HBV）属于嗜肝DNA病毒科，是一种DNA病毒,由外壳和核心两部分组成。调查研究表明该病毒具有传染性，主要通过血液、母婴和体液传播。HBV感染呈全世界流行，HBV感染者约有9300万，发病率较高，是不容忽视的公共卫生问题。若携带乙肝病毒时间过长，可诱发肝硬化和肝衰竭等疾病，对患者生命健康带来严重影响[[]DeliaMottes,BeierJ,SchmidK,etal.Pharmacokineticsandsafetyofaclidiniumbromideinyoungerandelderlypatientswithchronicobstructivepulmonarydisease[J].IntJClinPharmacolTher,2012,50(6):403-412.]。因此临床乙肝检测要选择快速、准确、早期的检测方法，对于筛查和确诊乙肝病毒携带者有重要意义，其检测方法有酶联免疫吸附实验（[]DeliaMottes,BeierJ,SchmidK,etal.Pharmacokineticsandsafetyofaclidiniumbromideinyoungerandelderlypatientswithchronicobstructivepulmonarydisease[J].IntJClinPharmacolTher,2012,50(6):403-412.1.ELISA法概述在临床检测中，乙型肝炎病毒是最常规和普通的体检项目，同时，也是判断患者乙型肝炎病毒携带量或乙型病毒型肝炎患者治愈情况的判断和临床状况分析的重要临床参考指标[[]delaRicaR,StevensMM.PlasmonicELISAforthedetectionofanalytesatultralowconcentraionswhiththenakedeye[J].NatProtoc,2013,8(9):1759-1764.]。实际临床检验过程中检测的标本为血清，常检测血清中是否携带乙肝病毒表面抗原（HbsAg）、乙肝病毒表面抗体（HbsAb）、乙肝病毒e抗原（HbeAg）、乙肝病毒e抗体（HbeAb）和乙肝病毒核心抗体（HbcAb），俗称“乙肝两对半”。所用的检测方法有胶体金免疫法、ELISA法、电化学发光免疫法和PCR等方法，在临床中最常用的方法为ELISA法，它具有灵敏度高、特异性好、操作方便以及出结果快的优点，并且研发出了全自动酶免分析仪可以进行批量操作和定量及半定量测定，在大批量标本检测时更加便捷，大大提高了检测的效率[[]周成，涂然，卢芳芳，蔡萼，王治伦.ELISA法和胶体金免疫层析法在乙肝表面抗原检测中的对比研究[J].中国地方病防治杂志，2017，32（11）：1233-1234.]，因此各级实验室广泛采用此检测方法[]delaRicaR,StevensMM.PlasmonicELISAforthedetectionofanalytesatultralowconcentraionswhiththenakedeye[J].NatProtoc,2013,8(9):1759-1764.[]周成，涂然，卢芳芳，蔡萼，王治伦.ELISA法和胶体金免疫层析法在乙肝表面抗原检测中的对比研究[J].中国地方病防治杂志，2017，32（11）：1233-1234.[]殷蓓琪，黄秋芳.三种不同免疫检测法对乙肝血清学标志物检测的结果对比分析[J].标记免疫分析与临床，2017，24（6）：682-685.2.ELISA法的检测原理将酶标记的抗体或抗原和待测标本(含待测抗原或抗体)按一定程序加入反应体系中，与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成固相化的抗原抗体-酶复合物；用洗涤的方法将抗原抗体酶复合物与其他成分离，结合在固相载体上的酶量与标本中待测物质的量与标本中待测物质的量呈一定比例，加入酶反应底物后，底物被固相我体上的酶催化生成有色产物，产物的量与标本中待测物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析[[]吴正林，陆学东，钟小强.ELISA差减分析——一种简便实用的免疫逃逸变异HBsAg检测新方法[J].中国免疫学杂志，2010，（07）；642-645]。ELISA的方法类型主要有夹心法、间接法、竞争法和捕获法，在临床实践中ELISA法检测乙肝两对半时，双抗夹心法用于检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg，竞争抑制法用于检测抗[]吴正林，陆学东，钟小强.ELISA差减分析——一种简便实用的免疫逃逸变异HBsAg检测新方法[J].中国免疫学杂志，2010，（07）；642-6453.ELISA法的检测过程检验人员将冷藏下酶联免疫吸附法所需试剂盒取出，将试剂盒中微孔反应条取出，放于室内环境进行三十分钟的室温平衡，待时间到时将血清样本滴加入微孔反应孔中，并设置好阴阳对照孔和空白对照孔，完成以上过程后进行整板封存，放于37℃恒温想中水浴60分钟；水浴过程中配置好洗液，待时间到后取出反应板进行洗板过程；洗板完成后加入显示液，在进行封板和温浴30分钟；最后加入终止液。数据的最终读取是每孔在酶标仪中波长为450纳米处的光密度值（OD值）进行读取和校对，采用的是酶标仪进行，校准常用空白对照孔进行零值校对。ELISA法在检测过程中影响众多如：试剂因素、处理及储存因素、标本凝集因素、样本因素、操作流程因素和检测结果研读的影响。3.1试剂因素我国乙肝两对半检测试剂的生产公司众多，其生产的试剂特异性和敏感度受部分原因影响具有一定的差异性，以吴丽婷的调查结果为例，采用不同厂家的试剂灵敏度一般介于78%-89%，特异性一般在89.4%-99.3%之间[[]吴丽婷.ELISA检测血清乙肝两对半的影响因素分析[J].中国妇幼监看研究，2017，28（1）：636-637.]。部分厂家的酶标板孔间A值，其差大于15%，标记酶活性不符合国家相关标准，所以在试剂选择方面不能选择劣质试剂，防止试剂对检验结果产生影响[[[]吴丽婷.ELISA检测血清乙肝两对半的影响因素分析[J].中国妇幼监看研究，2017，28（1）：636-637.[]闫峰.乙型肝炎病毒DNA与"乙肝两对半"模式关系的临床分析[J].中外医疗,2015，34（26）：105-106.3.2处理及储存因素临床实际工作中，在处理方面临床采集标本数量众多，首先要保证采样病人与标本对应正确，其次送检后的处理过程中严格按照处理流程，防止出现泼洒、溶血等情况，这类标本会对显色剂产生影响，进而影响检验的结果；在储存方面，临床一般采用的是一次性真空采血管，真空采血管的盖子在检验前不能打开，在采血后非检验需要不得打开采血管的帽子，对需要延迟送检及检验的标本采取冷藏保存，防止血液出现成分变化，这样可以在一定程度上减少对检验结果的影响[[]NingningMa,ChaoMa.ApplicationofFunctionalMicrosphereinHepatitisBVirusSurfaceAntigenDetection[J].Journalofnanoscienceandnanotechnology,2014,14(5):3348-3355.[]NingningMa,ChaoMa.ApplicationofFunctionalMicrosphereinHepatitisBVirusSurfaceAntigenDetection[J].Journalofnanoscienceandnanotechnology,2014,14(5):3348-3355.3.3标本凝集因素血液样本采集后，不能立刻上机操作，需要将标本放置半个小时左右，在凝固后24小时内完成检验。但在临床检测中，检测人员为满足临床需要或提高效率，会在标本凝固不完全时，通过离心分离出血清，通过此方法血清中的纤维蛋白原未完全溶解。在进行ELISA法检测操作时，会导致酶标板孔壁内附着着纤维蛋白块，导致酶标记物清洗不掉，从而影响酶标仪的检测并降低检测准确率。因此检验人员在测定时，需待血液样本充分凝固后，再离心分离血清。此外对于急诊患者还可在采血管内加入分离胶，或加入促凝剂至采血管中，以促进样本快速凝固，达到检验要求[[]衣淑明，张建敏.乙肝两对半ELISA检测法室内质控体会[J].现代中西医结合杂志，2015，14（19）：2573-2574.[]衣淑明，张建敏.乙肝两对半ELISA检测法室内质控体会[J].现代中西医结合杂志，2015，14（19）：2573-2574.3.4样本因素在实际临床工作过程中，部分患者体内的可能含有非特异性干扰物质，这内物质对检测的准确性会产生影响，遇到此类标本可采用复查的方法，提高检测结果的准确性，在此基础上，作为一名检验人员要了解病人的病历，了解患者服用了何种药物，是否对此项检验结果有影响，并及时与临床医生沟通，避免出现有误的检验结果发往临床。3.5操作流程因素ELISA法检测乙肝两对半的流程包括：加样、温育、洗板以及显色。首先要对加样器进行校准，保证其精准度，在使用过程中每次用完均需采用酒精或者消毒液进行彻底清洗，加样器在运行过程中要防止加样器的准确度，要准确加在对应反应孔中，并不接触到旁边反应孔。其后，对于反应孔中的标本和试剂需采用振荡器将其混合均匀，并震荡大于30s以上，震荡后对反应板进行温育，一般采用水育或者空气育的方法，这两种方法可以防止周边效应干扰检测或样本内融入影响检测结果的物质。在进行洗板操作是要控制好时间，既要彻底清洗干净，防范洗涤物质污染样本，又要防止将酶标结合物洗掉。在采用含氯成分的消毒剂时，需防止洗涤液外溢，导致反应孔之间出现相互反应的情况[[]刘佩,赵旭鸿.乙肝五项、HBV-DNA定量及乙肝前S1抗原联合检测用于诊断乙肝的临床价值分析[J].标记免疫分析与临床,2016,23(11):1275-1278.]。最后在进行显示操作是，要注意影响显色操作的外界因素包括时间、光线、温度等。操作时，尽量在光线暗一点的地方操作，避免强光对样本的刺激，操作也需要快速完成比色操作，对检测结果严格审核，确认无误后[]刘佩,赵旭鸿.乙肝五项、HBV-DNA定量及乙肝前S1抗原联合检测用于诊断乙肝的临床价值分析[J].标记免疫分析与临床,2016,23(11):1275-1278.3.6检测结果研读的影响结果判断要在终止液加入后10min内完成,防止出现孔内结晶,影响酶标仪的测试。同时要求检验人员要有高度的责任心,对检测整个过程严格把关，正确读取检验结果，对于一些假阳性和假阴性的结果要及时进行复查并告知临床，还要确保试剂的质量及有效期,对于复查后的结果依旧异常要告知临床重新采集标本再予复查,在整个实验过程中加入外部质控血清进行严格的质量控制[[]薛春阳，周建波.ELISA法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义[J].中国误诊学杂志，2011，11（16）：3913-3914.[]薛春阳，周建波.ELISA法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义[J].中国误诊学杂志，2011，11（16）：3913-3914.4.ELISA法的结果读取临床上主要ELISA法主要是测定样本中乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、e抗原、e抗体和核心抗体。ELISA法是一种定性实验，结果报告上面表现为“阴性”“阳性”，判断阴性和阳性主要是通过阳性判断值（cut-off值，CO）来进行定性，比较每项判断值（CO）与OD的大小来判断每项的阳性和阴性，判断值的计算方法[[]文沛然.胶体金免疫层析法与ELISA法检测HBsAg结果比较[J].中国医疗前沿，2010，（13）：71.]，判断值=阴性对照结果的OD平均值/3+0.100。如果样本血清检测结果中的OD值＜CO值，则表示为阴性；相反，如果样本血清检测结果中的OD值大于CO值，则表示为阳性。乙肝两对半结果为阳性的临床意义[[]李辉霞,王德志,杨朋.乙肝两对半定量检测及临床意义[J].医学信息,2010,23(9):21-22]：HbsAg表示已经感染病毒的标志,携带乙肝两对半的患者全程呈阳性；HbsAb表示曾经携带过乙肝病毒或接受疫苗；HbeAg为病毒复制标志。持续阳性较长则有慢性化倾向；HbeAb为病毒复制停止标志,出现在恢复期及无症状携带者；HbcAb早期指标和复制标志。临床上HBeAg，HBsAg是检测乙肝携带者的主要指标，通常所说的大三阳指HBcAb、HBsAg和HBeAg（三项呈阳性），小三阳指HbsAg、HbeAb、HbcAb（三项呈阳性），大三阳的传染性和复制率相对较高[]文沛然.胶体金免疫层析法与ELISA法检测HBsAg结果比较[J].中国医疗前沿，2010，（13）：71.[]李辉霞,王德志,杨朋.乙肝两对半定量检测及临床意义[J].医学信息,2010,23(9):21-22[]杨凤琴，王耀荣，吕如.荧光定量PCR与酶联免疫吸附法在乙型肝炎病毒检测中的应用价值.中西医结合心血管电子杂志，2019，7（13）：92-93.5.总结对于乙型肝炎病毒的检测、诊断以及治疗疗效检测都离不开临床实验室的检验，目前检测方法众多，各种检测方法学的特异性、灵敏度、检测成本、实用性是选择检测方法考虑的因素，其中ELISA法是发展历史久且经典的一种免疫学检测方法,有其自身的