《生物制药工艺》课件-自己学：大肠杆菌发酵提取法生产L-天冬酰胺酶

大肠杆菌发酵提取法生产门冬酰胺酶《生物制药工艺》主讲人：方绪凤导入湖北生物科技职业学院

大肠杆菌门冬酰胺酶对治疗白血病有显著疗效。门冬酰胺酶L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶左旋门冬酰胺酶爱施巴湖北生物科技职业学院作用机制：药用L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺门冬酰胺酶水解L-天冬氨酸NH3＋

L-天冬酰胺酶在血液中特异性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨，而天冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。正常细胞有自身合成天冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当外来天冬酰胺酶使天冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够天冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受阻，增值受抑制，细胞大量死亡。因此临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病，是第一种用于治疗癌症的酶。

编号：EC3.5.1.1。存在于细菌中的一种水解酶，能特异水解天冬酰胺的酰胺键。大肠杆菌能产生两种L-天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶Ι和II，其中L-天冬酰胺酶II的抗癌活性较强。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase）

呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。其20%水溶液，室温贮存7d，5℃保存14d，均不减少酶的活力。干品50℃，15min酶活力降低30%；60℃，1h内失活。最适pH为8.5，最适温度为37℃。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬酰胺酶湖北生物科技职业学院制备方法：L-天冬酰胺酶大肠杆菌菌种活化及扩大培养发酵罐培养提取、沉淀及热处理精制、冻干湖北生物科技职业学院制备步骤：第一步菌种活化及扩大培养菌种活化扩大培养湖北生物科技职业学院制备步骤：第二步发酵罐培养玉米浆培养基+大肠杆菌8%接种量37℃，通气搅拌，培养6-8h离心分离发酵液得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛自然风干成菌体干粉湖北生物科技职业学院制备步骤：第三步提取、沉淀、热处理菌体干粉+0.01MpH8硼酸缓冲液37℃搅拌1.5h降温至30℃加入5M醋酸调节pH至4.2-4.4压滤湖北生物科技职业学院制备步骤：第三步提取、沉淀、热处理静置4h过滤滤液[沉淀]2倍体积丙酮粗酶[搅拌，离心]0.3%甘氨酸pH8.8上清液[热处理]甘氨酸60℃，30min酶溶液湖北生物科技职业学院制备步骤：第四步精制、冻干[精制]聚乙二醇不同pH处理无热原酶液[冻干]无菌包装天冬酰胺酶冻干制剂酶溶液湖北生物科技职业学院制备方法：

L-天冬酰胺酶提取工艺流程图pH4.2~4.4大肠杆菌[菌种培养]肉汤培养基37℃，24h肉汤菌种[种子培养]玉米浆37℃，4~8h种子液[发酵]玉米浆37℃，6~8h发酵液[压滤、风干]丙酮干菌体[提取]硼酸缓冲液pH8.3，37℃提取液[沉淀]乙酸粗酶[热处理]甘氨酸60℃，30min酶溶液[精制]聚乙二醇不同pH处理无热原酶液[冻干]无菌包装天冬酰胺酶冻干制剂湖北生物科技职业学院提取原理：

蛋白质沉淀法丙酮pH4.2~4.4聚乙二醇加热60℃30min等电点沉淀高分子聚合物沉淀热变性有机溶剂沉淀湖北生物科技职业学院培门冬酶（Pegaspargase）湖北生物科技职业学院聚乙二醇在药物制剂中的应用湖北生物科技职业学院聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇会通过一些化学反应与蛋白质和多肽类药物相连，这个过程被称作聚乙二醇化(PEGylation)体积增大，不易被肾脏过滤覆盖保护层，防止被酶解水溶性大大增加有助于药物更好地在体内发挥作用湖北生物科技职业学院小结：大肠杆菌发酵提取法大肠杆菌菌种活化及扩大培养发酵罐培养提取、沉淀及热处理精制、冻干湖北生物科技职业学院展望：L-天冬酰胺酶其他生产工艺欧文菌发酵提取法