2025年核酸检测pcr考试试题及答案

2025年核酸检测pcr考试试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30题，计60分）1.聚合酶链式反应（PCR）技术的核心酶是A.DNA连接酶B.逆转录酶C.TaqDNA聚合酶D.限制性内切酶答案：C2.荧光定量PCR中，Ct值指的是A.扩增产物达到平台期的循环数B.荧光信号达到设定阈值时的循环数C.引物与模板结合的最佳温度D.反应体系中dNTP完全消耗的时间点答案：B3.进行RNA病毒PCR检测时，第一步需要进行的操作是A.逆转录反应（RT）B.设计特异性引物C.提取病毒RNAD.配置PCR反应体系答案：C4.引物设计时，GC含量通常建议控制在A.10%-20%B.20%-30%C.40%-60%D.70%-80%答案：C5.下列哪种物质会显著抑制Taq酶活性？A.EDTAB.甘油C.BSA（牛血清白蛋白）D.二甲基亚砜（DMSO）答案：A6.实时荧光定量PCR的扩增曲线通常分为几个阶段？A.1个（指数增长期）B.2个（指数期、平台期）C.3个（基线期、指数期、平台期）D.4个（初始期、指数期、线性期、平台期）答案：C7.核酸提取过程中，使用氯仿的主要目的是A.裂解细胞B.沉淀核酸C.去除蛋白质D.提高pH值答案：C8.进行PCR实验室分区时，正确的操作流程是A.试剂准备区→样本处理区→扩增区→产物分析区B.样本处理区→试剂准备区→扩增区→产物分析区C.产物分析区→扩增区→样本处理区→试剂准备区D.试剂准备区→扩增区→样本处理区→产物分析区答案：A9.检测新型冠状病毒（RNA病毒）时，若样本中同时加入内参基因（人源管家基因），其主要作用是A.提高扩增效率B.验证样本核酸提取质量C.降低假阳性率D.减少引物二聚体答案：B10.扩增产物长度为200bp时，延伸时间一般设置为A.5-10秒B.30秒C.1分钟D.2分钟答案：B11.下列哪种情况会导致PCR出现假阴性结果？A.引物与模板非特异性结合B.样本中存在Taq酶抑制剂C.扩增仪温度波动±0.5℃D.产物分析时电泳电压过高答案：B12.核酸提取后，使用分光光度计检测A260/A280比值为1.2，说明A.核酸纯度高B.蛋白质污染严重C.盐离子残留过多D.RNA降解答案：B13.数字PCR（dPCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）的主要区别在于A.dPCR不需要引物B.dPCR通过绝对定量而非相对定量C.dPCR扩增效率更高D.dPCR仅用于DNA检测答案：B14.实验室高压蒸汽灭菌的标准条件是A.100℃，30分钟B.121℃，15-20分钟C.160℃，2小时D.200℃，1小时答案：B15.处理PCR产物时，正确的生物安全操作是A.直接丢弃至普通垃圾桶B.10%次氯酸钠浸泡30分钟后高压灭菌C.用75%乙醇擦拭后丢弃D.冷冻保存以备重复检测答案：B16.引物二聚体形成的主要原因是A.引物浓度过低B.退火温度过高C.引物3’端互补D.dNTP浓度不足答案：C17.进行多重PCR时，最关键的优化参数是A.引物特异性B.模板浓度C.反应体积D.扩增循环数答案：A18.下列哪种样本类型对核酸提取质量影响最大？A.血清B.咽拭子C.粪便D.全血答案：C19.荧光探针法（如TaqMan探针）与SYBRGreen法相比，优势在于A.成本更低B.特异性更高C.操作更简单D.可同时检测多个靶标答案：B20.扩增仪温度校准的频率应为A.每月1次B.每季度1次C.每半年1次D.每年1次答案：C21.核酸提取时，若使用磁珠法，关键步骤是A.加入蛋白酶KB.磁珠与核酸的结合及洗脱C.氯仿抽提D.乙醇沉淀答案：B22.检测结果为“临界值”（Ct值接近阈值）时，正确的处理方式是A.直接判定为阳性B.直接判定为阴性C.重复检测并结合临床症状综合判断D.增加扩增循环数后重新检测答案：C23.实验室发生样本泄漏时，首先应A.报告上级B.用吸水纸覆盖泄漏区域C.喷洒1%次氯酸钠溶液D.穿戴防护装备答案：D24.下列哪种物质可用于PCR实验室台面的常规消毒？A.95%乙醇B.3%过氧化氢C.生理盐水D.去离子水答案：B25.逆转录反应（RT）的最佳温度通常为A.25℃B.37℃C.50℃D.72℃答案：C26.扩增产物电泳时，出现多条非特异性条带的原因可能是A.模板浓度过低B.退火温度过低C.dNTP浓度不足D.Taq酶量不足答案：B27.核酸提取后，若需长期保存，最佳条件是A.4℃保存B.-20℃保存C.-80℃保存D.室温保存答案：C28.进行内标法质量控制时，内标基因的扩增效率应与靶基因A.完全一致B.相差不超过5%C.相差不超过10%D.无严格要求答案：B29.下列哪种情况会导致Ct值偏大？A.模板浓度过高B.扩增效率提高C.荧光阈值设置过低D.模板降解答案：D30.PCR实验室空气净化系统的换气次数应至少达到A.10次/小时B.20次/小时C.30次/小时D.40次/小时答案：B二、多项选择题（每题3分，共10题，计30分。每题至少有2个正确选项，多选、少选、错选均不得分）1.PCR反应体系的基本组成包括A.模板核酸B.引物C.Taq酶D.dNTPsE.荧光染料（可选）答案：ABCDE2.核酸提取过程中，可能引入的抑制剂包括A.血红蛋白B.胆盐C.肝素D.多糖E.乙醇答案：ABCD3.荧光定量PCR结果判读时，需排除的异常情况包括A.无扩增曲线（NTC阳性）B.扩增曲线呈S型但Ct值>40C.阴性对照出现扩增D.内参基因无扩增E.扩增曲线平台期明显答案：ACD4.实验室污染的主要来源有A.扩增产物气溶胶B.样本交叉污染C.试剂污染D.操作人员自身携带核酸E.环境中的微生物核酸答案：ABCDE5.提高PCR特异性的方法包括A.优化退火温度B.减少引物浓度C.使用热启动Taq酶D.增加模板量E.缩短延伸时间答案：ABC6.核酸提取质量控制的指标包括A.浓度（A260值）B.纯度（A260/A280、A260/A230）C.完整性（电泳条带）D.扩增效率（内标检测）E.颜色（是否澄清）答案：ABCD7.生物安全柜使用时的注意事项包括A.操作前需开机运行10分钟B.物品应尽量放在柜内中央C.操作时手臂频繁进出D.结束后用75%乙醇擦拭表面E.定期进行高效过滤器（HEPA）检测答案：ABDE8.逆转录反应的关键参数包括A.逆转录酶的选择（如M-MLV、AMV）B.引物类型（随机引物、OligodT、特异性引物）C.反应温度（通常42-55℃）D.RNA模板的质量（无DNA污染、无降解）E.dNTP浓度（与PCR相同）答案：ABCD9.数字PCR的优势包括A.无需标准曲线即可绝对定量B.对抑制剂耐受性更强C.可检测低丰度靶标D.操作更简单E.成本更低答案：ABC10.实验室记录应包括的内容有A.样本信息（编号、类型、采集时间）B.试剂信息（批号、有效期）C.仪器参数（扩增程序、校准记录）D.检测结果（Ct值、阴阳性判定）E.操作人员签名答案：ABCDE三、判断题（每题1分，共20题，计20分。正确填“√”，错误填“×”）1.PCR扩增的是双链DNA，因此RNA病毒检测需先进行逆转录。（√）2.SYBRGreen染料可与所有双链DNA结合，因此无需设计特异性探针。（√）3.扩增仪的温度准确性直接影响退火和延伸步骤的效率。（√）4.核酸提取时，离心速度越高，提取效率越好。（×）5.阳性对照应与待测样本在同一批次检测，以验证实验有效性。（√）6.实验室分区的核心目的是防止扩增产物污染前区。（√）7.引物设计时，3’端应避免连续的G或C，防止非特异性结合。（√）8.dNTP浓度过高会导致引物二聚体增加。（√）9.冷冻保存的核酸样本可反复冻融，不影响检测结果。（×）10.生物安全二级实验室（BSL-2）可处理所有感染性样本。（×）11.荧光阈值应设置在扩增曲线的指数期，避免基线期的干扰。（√）12.高压蒸汽灭菌时，物品应松散放置，确保蒸汽穿透。（√）13.内参基因应选择在样本中稳定表达的基因（如GAPDH、β-actin）。（√）14.扩增产物电泳时，上样量越多，条带越清晰。（×）15.实验室发生停电时，应立即终止实验并记录状态。（√）16.核酸提取后，若A260/A230比值<1.8，说明盐离子污染。（√）17.热启动Taq酶通过化学修饰或抗体封闭，防止低温下非特异性扩增。（√）18.多重PCR中，各对引物的Tm值应尽量接近（±2℃）。（√）19.数字PCR的结果以阳性微滴数计算浓度，因此不需要设置阴性对照。（×）20.检测结果审核时，需同时核对样本信息、实验记录和仪器数据。（√）四、简答题（每题8分，共5题，计40分）1.简述PCR反应的三个基本步骤及其温度范围。答案：PCR反应包括变性、退火、延伸三个步骤：（1）变性：94-98℃，使双链DNA解链为单链；（2）退火：50-65℃，引物与单链模板特异性结合；（3）延伸：72℃（接近Taq酶最适温度），Taq酶以dNTP为原料，沿模板合成新的DNA链。2.核酸提取的质量控制需要关注哪些指标？如何检测？答案：需关注浓度、纯度、完整性和扩增有效性：（1）浓度：通过分光光度计检测A260值（1OD=50μg/mL双链DNA或40μg/mL单链RNA）；（2）纯度：A260/A280比值（DNA≈1.8，RNA≈2.0）反映蛋白质污染；A260/A230比值（>1.8）反映盐类或有机物污染；（3）完整性：DNA通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有降解条带（完整基因组DNA为高分子量条带）；RNA通过电泳观察28S和18SrRNA条带（比值约2:1）；（4）扩增有效性：通过内参基因（如管家基因）扩增验证提取的核酸是否可被有效扩增。3.列举PCR实验室常见的污染类型及预防措施。答案：污染类型及预防措施：（1）扩增产物污染（最常见）：分区操作（试剂准备区→样本处理区→扩增区→产物分析区），单向流程；使用UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）降解含dUTP的旧产物；定期用紫外线或10%次氯酸钠处理实验室；（2）样本交叉污染：严格样本编号，使用带滤芯吸头，避免气溶胶；（3）试剂污染：使用前检测试剂空白（NTC），分装试剂避免反复冻融；（4）环境核酸污染：定期清洁实验室，使用专用工作服和鞋套；（5）操作人员自身污染：戴手套、口罩，避免说话或咳嗽污染样本。4.荧光定量PCR中，Ct值与初始模板量的关系是什么？影响Ct值的因素有哪些？答案：Ct值与初始模板量的对数呈线性负相关（Ct=-k·logN0+b，k为斜率，b为截距），即初始模板量越多，Ct值越小。影响Ct值的因素包括：（1）模板因素：浓度（过低导致Ct值偏大）、纯度（含抑制剂导致扩增效率下降）、完整性（降解的模板影响扩增）；（2）试剂因素：引物/探针特异性（非特异性结合降低效率）、Taq酶活性（失活导致无扩增）、dNTP浓度（不足导致延伸受阻）；（3）仪器因素：温度准确性（退火温度偏差影响引物结合）、荧光检测灵敏度（低灵敏度导致Ct值偏大）；（4）操作因素：加样误差（体积不准确影响体系浓度）、反应体系配制时间（过长导致酶活性下降）。5.请描述核酸检测实验室生物安全的核心要求。答案：核心要求包括：（1）实验室等级：根据检测样本的危害程度选择BSL-2及以上实验室，配备生物安全柜、高压灭菌器等设备；（2）人员防护：穿戴工作服、手套、口罩、护目镜，必要时穿防护服；（3）样本管理：样本运输需符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，接收时记录状态；（4）操作规范：避免气溶胶产生（如缓慢开盖、使用带滤芯吸头），样本处理在生物安全柜内进行；（5）废物处理：感染性废物需经高压灭菌（121℃，30分钟）或化学消毒（如10%次氯酸钠浸泡）后按医疗废物处理；（6）应急预案：制定泄漏、锐器伤等事故的处理流程，定期进行生物安全培训和演练。五、案例分析题（每题15分，共2题，计30分）案例1：某实验室检测新型冠状病毒核酸时，出现以下情况：-阳性对照（PC）Ct=25（正常范围20-30）-阴性对照（NC）无扩增（正常）-待测样本S1的扩增曲线呈“波浪形”，Ct=38（阈值设定为35）-待测样本S2的扩增曲线在15个循环后出现平台期，Ct=18问题：（1）S1的检测结果应如何判定？可能原因是什么？（2）S2的扩增曲线异常可能原因是什么？如何验证？答案：（1）S1判定为“临界值”或“可疑阳性”，需重复检测。可能原因：①样本中病毒载量极低，接近检测下限；②核酸提取过程中损失，导致模板量不足；③扩增体系中存在轻微抑制剂（如血红蛋白、多糖），降低扩增效率；④荧光阈值设置过高，导致Ct值后移；⑤扩增仪温度波动（如退火温度略低），影响引物结合效率。（2）S2的异常可能原因及验证：可能原因：①模板浓度过高（病毒载量极高），导致dNTP或引物过早消耗，提前进入平台期；②引物或探针浓度过高，非特异性结合加速扩增；③扩增仪温度异常（如变性温度不足，双链未完全解链，导致聚合酶重复利用模板）；④样本交叉污染（如加样时S2污染了前一个样本）。验证方法：①对S2进行10倍梯度稀释后重新检测，若稀释后扩增曲线恢复正常（Ct值增加约3.3，符合PCR扩增效率），