RNA解旋酶DDX3在肺癌中的功能研究

前言肺癌是全球最常见的癌症，据称死亡人数比前列腺癌，结肠癌和乳腺癌的总和还多,《1990-2017年中国及其各省的死亡率、发病率和危险因素：2017年全球疾病负担研究的一个系统分析》的研究，是一项关于中国人口健康的全面研究报告。该研究根据寿命损失年数（YLL，因某种疾病少活了多少年）的多少，从282类致死原因中找出了2017年中国人的前三大死亡原因，分别是：中风、缺血性心脏病、癌症，而肺癌居众多癌症之首。根据肿瘤类型和发病阶段，肺癌患者的治疗通常包括手术切除和放化疗。尽管外科手术切除为肺癌患者提供了最佳的治疗效果，但90%患者在刚诊断时已处于中晚期，失去了最佳手术的时期，目前，服用化疗药物仍是大多数患者的唯一选择。近年来，肺癌的靶向治疗取得了较大进展，但这些方法仍受到适用人群、应答率等限制，因而研发针对性更强的治疗方法具有重要意义[1]。DEAD-boxRNA解旋酶3（DDX3）是DEAD-box蛋白的高度保守家族成员，DEAD-box蛋白是ATP依赖的簇，是最大的RNA解旋酶家族。能够解开RNA双链体并涉及多个RNA加工程序，包括mRNA剪接，RNA编辑，出口，RNA衰变，核糖体生物发生转录和翻译调控等[2,3]。DEAD-box家族的特征在于ATP酶和解旋酶活性的调节，RNA代谢的调节以及RNA结合蛋白或分子伴侣与其他蛋白或RNA相互作用的参与者。DDX3有两个指定的同源物分别位于X和Y染色体上的DDX3X和DDX3Y[4，5]。而DDX3Y位于无精子症的无精子因子a（AZFa）区域Y染色体，在睾丸中特异性表达，在精子成熟和雄性育性中起重要作用[6，7]。DDX3X与DDX3Y在蛋白质上有92％的相似性，序列同一性，并编码为662-或661个氨基酸的多肽，具体取决于mRNA选择性剪接[8]DDX3X在大多数情况下无所不在，而DDX3Y表达仅限于男性种系在雄性育性中起作用[9]。前人的研究结果证实DDX3和KRAS都是肺癌发生发展的关键癌基因.对于DDX3作为一个RNA解旋酶在包括肺癌在内的多种癌症中表达失调。乳腺癌中，超过30%的患者DDX3高表达[10]。宫颈癌细胞中，DDX3通过直接调控细胞周期蛋白E1(CyclinE1)的翻译来调控细胞周期[11,12]。髓母细胞瘤中，DDX3是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成因子[13]。尽管上述研究证实了DDX3在多种癌症中发挥癌基因的作用，但DDX3在肺癌发生发展中的具体作用仍处于探索阶段。

材料与方法一．实验材料1.WesternBlot所需试剂表1所需试剂配方2×Lysisbuffer30%丙烯酰胺储存液1.5MTris-HCl(pH=8.8)1.0MTris-HCl(pH=6.8)10%SDSTris-Glycine电泳缓冲液Tris-Glycine电转缓冲液10%过硫酸铵10XTBST洗膜缓冲液1×TBST洗膜缓冲液5%TBST-Milk封闭液1.211gTris，1.753gNaCl，2mLNP-40，调节pH值至7.5，用双蒸水定容到100mL29g丙烯酰胺，1gN,N'-亚甲基双丙烯酰胺，双蒸水溶解定容到100mL，0.45μm滤膜过滤至棕色瓶，4℃保存Tris18.17g，双蒸水溶解，浓盐酸调节pH值到8.8，定容到100mLTris12.11g，双蒸水溶解，浓盐酸调节pH值到6.8，定容到100mLSDS10g,双蒸水溶解，定容到100mL3.02gTris，18.8g甘氨酸，10mL10%SDS定容至1L3.03gTris，14.41g甘氨酸，850mL双蒸水，150mL甲醇现用现加，提前预冷过硫酸铵1g，双蒸水溶解定容到10mL，分装到1.5mLEP管中，-20℃保存2.92gNaCl,0.5mLTween-20,10mL1.0MTris-HCl(pH=8.0)，定容到500mL50mL10×TBST洗膜缓冲液,450mL双蒸水，混匀5g脱脂奶粉，100mL1×TBST充分混匀搅拌2.琼脂糖凝胶电泳所需试剂表2所需试剂配方50×TAE电泳缓冲液10×loading10g/L溴化乙锭(EB)溶液1%琼脂糖凝胶Tris碱242g冰乙酸57.1mLEDTA18.6g,20gNaOH溶于终体积1000mLddH2O中，使用时稀释50倍0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青、30%甘油混匀后保存于4℃0.2gEB溶于20mL去离子水中，混匀后4℃避光保存，使用时终浓度为0.5mg/L1%琼脂糖分别溶于1×TAE中，微波炉加热至完全溶解细菌培养所需试剂表3细菌培养所需试剂配方LB液体培养基LB琼脂平板固体培养基将2g胰蛋白胨，2gNaCl、1g酵母提取物溶于200mLddH2O中，121℃高压灭菌30min，4℃保存备用在200mLLB液体培养基中加入3g琼脂粉，121℃高压灭菌30min，待温度降至40-50℃以下时加入200μL氨苄青霉素（Amp+），混匀直接倒入平板中,待冷却凝固后用封口膜封好倒置放于4℃保存备用细胞培养所需试剂表4细胞培养所需试剂配方10%FBS-RPMI1640完全培养液磷酸盐缓冲液（PBS）PBS-EDTA0.25%胰蛋白酶消化液细胞冻存液含5mLFBS、45mLRPMI1640和0.1%青链霉素4gNaCl,0.1gKCl、1.79gNa2HPO4•12H2O、0.12gKH2PO4，溶于500mLddH2O中，121℃高压灭菌30min，4℃保存备用0.37gEDTA溶于500mLPBS中，121℃高压灭菌30min，4℃保存备用0.25g胰蛋白酶溶于100mLPBS中，0.22μm滤器过滤，4℃保存备用10%二甲亚砜（DMSO）、90%FBS试剂盒表5试剂盒公司来源SuperscriptTMIII逆转录试剂盒SYBR®PremixExTaqTMDNA快速胶纯化回收试剂盒质粒小量提取试剂盒BCA蛋白浓度测定试剂盒质粒大量提取试剂盒慢病毒包装、浓缩及病毒滴度测定试剂盒Invitrogen公司产品全式基因生物科技有限公司产品Transgen公司产品威格拉斯（Vigorous）公司产品威格拉斯（Vigorous）公司产品QIAGEN公司产品MiltenyiBiotec公司产品仪器与设备表6仪器设备品牌冷冻台式离心机PCR仪Real-timePCR仪荧光显微镜及照相系统CO2培养箱-80ºC冰柜MilliQPlus超纯水系统微量加样器电泳仪Hettich,GermanyBio-RadPTC-100Bio-RadIQ5，Bio-RadCFX96NikonRevcoThermoMilliporeEppendorf北京百晶&Bio-Rad二.实验方法1.蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）1.1蛋白质的提取和定量（1）细胞间收取所用细胞到1.5毫升EP管中，PBS洗沉淀两次，加入加了100X蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30min，隔十分钟涡旋几次，4℃离心机12000rpm离心15min，吸取上清。（2）使用BCA试剂盒测样品浓度，加入计算好的ddH2O和5×loading的体积，100℃金属浴煮10min，存于-20℃备用。1.2蛋白的SDS电泳（1）先测试是否漏液，记录上样顺序，样品左右两侧用蛋白Marker作为对照。（3）通电，电压80V跑出浓缩胶后调成120V，距胶底部0.5cm处关闭电源。1.3转膜（1）准备新配好的1升电转液和PVDF（PolyvinylideneFluoride，聚偏氟乙稀）膜(83mm×50mm)，甲醇激活PVDF膜5秒。（2）提前准备好转膜物品，注意黑胶白膜，胶和膜还有滤纸之间要将气泡排干净。（3）转膜放在冰盒中，通电，恒流320mA开始。1.4封闭现用现配5%脱脂牛奶，用1XTBST清洗膜5分钟，把膜浸没在封闭液中，摇床缓慢摇1小时。1.5孵一抗裁膜放到稀释好的一抗中，4℃摇床过夜。1.6洗膜回收一抗，用1XTBST洗膜三次每次10min。1.7孵二抗：将膜放入用封闭液稀释好的二抗溶液中，室温摇床轻摇一小时。1.8洗膜用1XTBST漂洗膜每次5min，洗四次。1.9发光鉴定（1）膜从TBST中取出，在干净卫生纸上轻点吸除溶液残留。提前配好显色液，切记要避光，将膜放进凝胶成像仪中，滴加混合液到膜上，根据结果调整曝光时间和区域，得到最佳结果。2.分子克隆构建敲低质粒DDX3X2.1.设计敲低DDX3X的shRNA送于北京擎科测序公司进行合成。2.2酶切空载体plko.1，体系如下：Age12ulEcoR12ulplko.12ul10*cutsmartbuffer5ulddH2O39ul条件：37度水浴过夜2.3胶回收：将酶切的载体进行胶回收，胶回收步骤如下：(1)切胶：先配好琼脂糖凝胶，电泳跑胶，在UVUA光下切取目的条带，放入称量好的1.5毫升EP管内。(2)加入量为胶块质量三倍的融胶液GM，水浴37℃，每2min震荡一次直至完全溶解。(3)溶液移到收集柱中，室温离心12000rpm，1min。(4)倒去融胶液，加入700ulWB，室温离心12000rpm，1min并重复一次。(5)弃去WB，室温空离一次12000rpm2min。(6)加入65度预热的ddH2O，室温离心12000rpm1min。(7)使用Nandrop测浓度。2.4合成的shRNA先融水然后退火，95度10min,关机退火4h,自然冷却要贴条,不能开盖。2.5连接：退火后shRNA与酶切完的载体连接，使用NEB的T4连接酶置于16度大于4h。2.6转化：提前用紫外灯照射30min细菌工作台。(1)从-80℃冰箱取出stbl3感受态，取感受态50ul，加入连接产物10ul，冰浴30min。(2)然后42度金属浴热激45s立即放于冰上不少于2min。(3)加入无抗生素LB500ul于37度孵箱摇床上200rpm1h。(4)在细菌工作台轻离菌液，去一半上清，剩余菌液涡旋均匀涂布在平板上，37度孵箱过夜。(5)次日挑单克隆菌落，加入含A+抗性的LB，37度摇床摇大约6h，取一半送测序。2.7质粒DNA中小剂量提取及定量（1）在细菌台接种单个菌落到LB培养基，37℃摇床过夜；室温1200rpm离心5分钟，去干净上清；（2）加入500µl已加入RNaseA的重悬液BufferP1，用移液器充分悬浮混匀细菌沉淀；（3）再加入500µlBufferP2，温和缓慢的上下颠倒5-10次，静置2min。裂解时间控制在5min以内，混匀动作不可剧烈；（4）加入500µlBufferP4，立即轻柔地颠倒EP管6-8次，此时会出现白色絮状沉淀；室温放大约10min，12,000rpm离心10分钟，管底部形成白色沉淀。（5）柱平衡：用500µl的平衡液BL平衡吸附柱CP4，12,000rpm离心1分钟。（6）吸取上清液不要触碰沉淀分批加入过滤柱CS中，12,000rpm离心2min，滤液置于2mlEP管中。（7）加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下混匀后用移液枪吸到CP4中。（8）CP4室温12,000rpm离心1min，倒掉废液。（9）加入500µl去蛋白液PD，12,000rpm离心1min，弃去废液。（10）继续加入600µl加入无水乙醇的漂洗液PW，静置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟，倒掉废液，重复漂洗一次。（11）空离2分钟，将CP4开盖放在室温十分钟，保证晾干残留的漂洗液。（12）将CP4换一个新的干净的1.5ml离心管，向吸附膜中间部位加入ddH2O（ddH2O提前在65度金属浴上预热），室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集质粒溶液。（13）为了提高质粒的回收效率，重复步骤12，测定质粒OD260，OD280以及浓度。2.8质粒DNA的大剂量制备及纯化（1）大摇菌液接种到500ul培养基中活化，然后吸取50µl-100µl接种到200ml液体LB培养基（含氨苄青霉素）中，37℃摇床振荡过夜；（2）4℃离心机提前预冷，6000g,15min,离心过夜的LB培养基；（3）10mLBufferP1重悬细菌沉淀到50ml无酶离心管，加了lysisBlue的P1在层析柜。（4）加入10mLBufferP2，缓慢颠倒4-6次充分混匀，室温孵育5min(此时溶液慢慢变成蓝色)。（5）在孵育期间，准备QIAfilterCartridge帽子，QIAfilter管口和离心管(QIArack)。（6）加10ml预冷的BufferP3,颠倒4-6次成鸡蛋花状，蓝色消失。（7）溶解产物加到QIAfilterCartridge桶内，室温孵育10min。轻推塞子将溶解产物过滤到50ml无酶离心管中，滤液20-25ml左右。（8）加2.5ml的BufferER，颠倒10次左右充分混匀，冰上孵育30min。（9）10mlBufferQBT来平衡QIAGEN-tip500，使液体靠重力流干净。（10）孵育好的溶解产物过一遍QAGEN-TiP500柱子(即液体靠重力流干净)。（11）加30ml的BufferQC洗QIAGEN-tip两遍。（12）加入15ml的BufferQN(提前烘箱65度预热）洗脱DNA于一个无内毒素无热源质的管子里。（13）加10.5ml常温的异丙醇(无RNase)沉淀DNA，小心去上清，离心1h。（14）加入5ml无内毒素的室温的70%的乙醇，6000g，4℃离心30min，小心吸出上清。（15）室温放几分钟晾干，加300ul的无内毒素的BufferTE溶解DNA,在干净环境中进行。（16）提出的质粒应测浓度并跑电泳验证，-20度储存备用。3.敲低质粒DDX3X转染细胞1.细胞生长条件本课题所用人胚肾细胞系293TN用DMEM培养基、人肺癌细胞系A549用1640培养基，均为贴壁细胞。培养基中都添加10%FBS，100U/ML青霉素和100U/ML链霉素。两种细胞在37℃，5%CO2和湿度饱和的孵箱培养。2.冻存细胞复苏提前30min将复苏细胞所用培养基及PBS等放置室温，提前30min开紫外线消毒。液氮中取出细胞后我们把冻存管用PE手套包裹，放到37℃水浴锅中，手轻微摇冻存管，促使细胞快速溶解。800rpm离心5min，弃上清。用枪吸1ml培养基悬浮细胞沉淀，移到10厘米培养皿中，双手用十字交叉法缓慢晃动培养皿让细胞均匀分布，置于37℃孵箱培养。3.细胞传代细胞密度在80%-90%时需传代。显微镜下观察后在生物安全柜中操作，倒掉培养基，先加2mlPBS，轻微晃动用移液器小心吸掉PBS。加入2ml胰酶消化2-3min，等显微镜下看到贴壁细胞变圆，细胞的间隙变大后就加入2ml完全培养基中和胰酶。用移液器轻柔缓慢吹散细胞吸到15毫升离心管中。800rpm离心5min，去上清，用1ml培养基重悬细胞沉淀，按需求比例移至培养皿中。置于37℃孵箱孵育。4.细胞系的转染（脂质体介导真核生物转染系统）（1）转染前天我们计数铺板达到实验所需密度。（2）按比例分别稀释转染试剂和目的质粒，静置5min。（4）取100ul混合液加入到稀释质粒中，室温静置20min。期间为细胞换液，更换为无抗生素的1ml培养基。（5）将混合物与细胞混匀，37℃培养箱中培养4-6h之后换液再培养24-48h。（6）转染24h后收细胞检测RNA变化，48h后检测蛋白变化。5.慢病毒包装目的质粒：PSPAX.2:PMD2G为6：4.5：1.5，转染试剂为neofect。（1）稀释液Opti-MEM：转染试剂neofect按6孔板一孔为100ul：5ul静置5min。（2）稀释液Opti-MEM：PSPAX2：PMD2G为100ul：4.5ug：1.5ug稀释静置5min。（3）取6ug目的质粒对应加入到稀释后的双质粒系统轻柔混匀，做好标记。（4）每孔100ulneofect加入到质粒稀释液中，静置20min，为293T换液，换为1ml无双抗的DMEM。（5）静置后加入对应孔中。培养48h（注：4--6h后补加双抗防止细胞污染）（6）培养48h后收取上清，室温离心10min，上清用0.45um过滤膜过滤。（7）病毒上清按体积比4：1加入PEG-it，充分混匀，4度冰箱静置12h-72h。（8）6孔板铺A549细胞，在密度为60%-70%时感染细胞。（9）感染细胞4-6h后加双抗和puro药筛，24h后收细胞检测功能。4.实时定量PCR4.1Trizol法提取总RNA（1）往1.5毫升离心管内加1毫升Trizol；（2）加200微升三氯甲烷，上下颠倒几次混匀，室温静置10分钟；（3）4℃离心15分钟，吸取上清至新的离心管中；（4）加入同体积的异丙醇，涡旋混匀，-20℃放置一段时间来增加RNA沉淀；（5）离心15分钟，弃上清，保留沉淀；（6）加入800微升75%乙醇，温和振荡悬浮沉淀；（7）离心5分钟，尽量弃上清，重复两次；（8）吸净上清，室温晾干数分钟，沉淀不能太过干燥；（9）用无酶水溶解沉淀，测浓度。4.2逆转录与实时PCR（1）冰盒中向0.65mlEP管加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。（2）65℃金属浴5min，立刻冰浴2min。（3）短暂离心，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ulM-MLV，1ulRNAseInhibitor。（4）低速涡旋，42℃金属浴1小时，70℃金属浴15min，进行PCR或-80℃保存。（7）每个样品设三个复孔，反应体积为20μL，反应体系：2×SYBRMix(10mM)10μL10μMPrimer10.4μL10μMPrimer20.4μLcDNA0.2μLddH2O9.0μLTotal20μL（8）仪器设置完成运行程序并保存数据。（9）分析数据：我们待程序完成后就设置样本对照和内参基因，分析目的基因的相对表达。5.cck8细胞增殖实验（1）用细胞计数板计数细胞，细胞要吹打均匀，在细胞间用五板96孔板铺成每孔为100微升的细胞悬液，分别设置为0h,24h.48h,72h和96h。（2）铺完细胞后在0h的96孔板每孔加入10微升cck8溶液，一起放入细胞间孵箱中培养。（3）2-3h后将0h的96孔板先在酒精灯下将孔中气泡去除，然后用酶标仪测定450和630nm处的吸光度。其他板数在测定时间前4h内加入cck8溶液。（4）最后制作出标准曲线，来测定样品的细胞数量。结果1.病例水平证实DDX3X在肺癌中作为癌基因发挥作用收集了肺癌病例，并从正常组织，肺腺癌以及癌旁组织中提取出蛋白进行WesternBlot实验，结果显示DDX3X在肺癌细胞中表达水平升高（图1）。图1.DDX3X在肺癌患者中的表达。a肺腺癌b癌旁c正常组织2.细胞水平敲低DDX3X显著抑制肺癌细胞的生长（1）构建敲低DDX3X的shRNA,以质粒plko.1为载体骨架，构建敲低DDX3X的shRNA1,shRNA2和shRNA3，使用293T进行慢病毒包装，感染肺癌细胞A549，WesternBlot检测构建shRNA的敲低效率，结果显示：DDX3X敲低成功，其中shRNA1和shRNA2敲低效果更显著（图2）。图2.DDX3X在A549细胞中敲低效率的检测。（2）取敲低效率显著的shRNA1和shRNA2进行细胞增殖实验，结果显示，敲低DDX3X后能够显著抑制肺癌细胞的增殖（图3）。图3敲低DDX3X后肺癌细胞增殖的检测。讨论我们从收集的肺癌患者病例中首先通过组织提取出蛋白进行蛋白定量，然后用蛋白质免疫印迹法检测出DDX3的蛋白水平异常升高，根据文献中对DDX3在各种癌症中表达失调的表现，RNA解旋酶是基因表达的重要调节剂，在RNA代谢的几乎所有方面都发挥作用，我们可以确定DDX3在肺癌中有很大可能作为癌基因在发挥作用，DDX3可能的致癌作用是通过调节细胞周期。它通过诱导细胞周期G1/S过渡，从而促进细胞生长。它调节G1/S特定的翻译cyclinE1mRNA，RNA解旋酶活性是必需的过程[12,13,14]。此外，DDX3与DDX5交互在小鼠胚胎发育过程中的细胞周期的G2/M期[15,16]证据表明DDX3可以调节在肿瘤发生中至关重要的基因的转录。所以我们从细胞水平通过构建敲低DDX3X的质粒进一步检测DDX3在肺癌中的作用。我们以质粒plko.1为载体骨架，构建敲低DDX3X的shRNA1,shRNA2和shRNA3，使用293T进行慢病毒包装，感染肺癌细胞A549，之后蛋白质免疫印迹法证实DDX3X敲低成功，用敲低效果更加明显的shRNA1和shRNA2进行了细胞增殖实验，结果显示敲低后的DDX3X能够显著抑制肺癌细胞的增殖，这更加确定了DDX3在肺癌发生发展中发挥癌基因的作用。此外我们发现DDX3在肺癌细胞中表达水平异常增高的同时，DDX6和KRAS在肺癌细胞中的表达水平于邻近正常组织相比也是高表达。在大肠癌中，DDX6调节基因Wnt信号转导的转录表达谱以及翻译控制。DDX6的酵母同系物据报道DNA损伤后细胞周期停滞在G1/S的恢复中也很重要。其负责恢复在mRNA代谢的功能调节[17,18]。在人类宫颈癌细胞系中Hela，DDX6的表达在细胞过程中被上调，分化过程中增殖和下调。DDX6的耗尽会通过诱导DDX6阻碍细胞生长细胞周期停滞在S期。DDX6与eIF4E的交互暗示可能翻译的翻译启动基因参与细胞增殖[19]。85%的患肺癌患者都被诊断为非小细胞肺癌，这里面70%的患者为肺腺癌。研究表明，肺腺癌中有30.9%的患者都携带着Kras基因突变，K-Ras对人类各种癌症的影响非常大，KRAS基因可以控制调控细胞生长的路径；异常时会让细胞持续生长，KRAS参与细胞内的信号传递，当K-ras基因发生突变不能产生正常功能蛋白就使胞内信号传导功能紊乱，细胞突变增殖失去控制进而发生癌变。在结直肠癌的一项研究表明，DDX3通过增强SP1结合在KRAS启动子上可以促进Kras的转录[20]。而目前肺癌治疗中仍然没有靶向Kras的药物。因此寻找新的下游信号通路具有重要研究意义。综上所述，虽然现在医学领域发展越开越迅速，但是肺癌的治愈率依旧很低，许多癌基因在肺癌的治疗中起到关键性作用，肺癌也因各类靶基因的出现而发生革命性变化，所以从基因水平研究肺癌的各种发生机制，对今后肺癌的早期诊断和治疗更加有关键指导意义，在此实验中可以将DDX3X作为治疗肺癌的靶基因进行研究，从而使更多的肺癌患者在靶向治疗中获益。结论DDX3X在肺癌中作为癌基因发挥作用，敲低DDX3可以抑制肺癌细胞的增殖。

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