Trmt2b基因敲除斑马鱼模型的构建

PAGEPAGEI题目题目：Trmt2b基因敲除斑马鱼模型的构建PAGEPAGEIII摘要CRISPR/Cas9是现在广泛应用的基因编辑技术，被用作各种基因的定向敲除。Trmt2b是一种定位于人线粒体的甲基转移酶，为线粒体定位蛋白，Trmt2b基因的缺失可能对线粒体功能有影响。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建Trmt2b基因敲除模型。首先设计基因Trmt2b的sgRNA位点，合成sgRNA引物，PCR引物，测序引物。并用PCR扩增模板来体外转录sgRNA和Cas9mRNA，接着对单细胞期的斑马鱼胚胎进行显微注射，为G0代，随机收集24hpf(受精后小时数)胚胎测序检测是否发生突变。如果发生突变，则培育筛选过后的G0代至性成熟然后让其与野生型斑马鱼杂交得F1代并鉴定基因型，待F1成年后让相同基因型的F1代自交，从理论上可以得到有1/4基因突变纯合子的F2代。该斑马鱼模型生物的构建，为以后研究Trmt2b基因的具体功能提供了稳定可靠的条件，也能进一步探究Trmt2b在人线粒体中的作用。关键词：CRISPR/Cas9技术，Trmt2b基因，sgRNA，斑马鱼，显微注射ABSTRACTCRISPR/Cas9isawidelyusedgene-editingtechnology,usedforthetargetedknockoutofvariousgenes.Trmt2bisamethyltransferaselocatedinhumanmitochondria,whichlocatesproteinsformitochondria.ThedeletionofTrmt2bgenemayaffectmitochondrialfunction.ThisstudyusedCRISPR/Cas9technologytoconstructtheTrmt2bgeneknockoutmodel.Firstly,thesgRNAsiteofgeneTrmt2bwasdesignedtosynthesizesgRNA.SgRNAandCas9mRNAweretranscribedinvitro,andthenSgRNAandCas9mRNAwereinjectedintozebrafishembryostogetgenerationG0.24hpf(hoursafterfertilization)embryoswererandomlycollectedforsequencingtodeterminewhethermutationsoccurred.Ifmutationoccurs,theG0generationafterscreeningwillbebredtosexualmaturityandthenhybridizedtoF1generationwithwildzebrafish.WhenF1becomesanadult,theF1generationwiththesamegenotypewillself-cross,andtheF2generationwithhomozygous1/4genemutationcanbetheoreticallyobtained.TheconstructionofthezebrafishmodelprovidesastableandreliableconditionforthefuturestudyofthespecificfunctionsofTrmt2bgenes,andfurtherexplorationoftheroleofTrmt2binhumanmitochondria.Keywords:CRISPR/Cas9technology,Trmt2bgene,sgRNA,zebrafish,microinjection目录TOC\o"1-3"\h\u1568摘要 I5208ABSTRACT II4455目录 III161341前言 1132971.1斑马鱼成为新兴的模型生物 1223451.2Trmt2b基因简介 2134811.3CRISPR/Cas9基因编辑技术 274871.4本课题研究的意义和价值 373102材料与方法 34782.1实验仪器 3155892.2实验试剂 3196752.3实验动物 451342.4sgRNA设计 4273002.5sgRNA的制备 5275002.6Cas9mRNA转录 8178672.7斑马鱼胚胎获取 8172422.8胚胎显微注射 9223602.9sgRNA的鉴定 975052.10纯合子斑马鱼的筛选 935133实验结果 9237993.1突变检测 960273.2Trmt2b敲除斑马鱼的构建与筛选 10317354讨论 114782参考文献 1313988致谢 141前言1.1斑马鱼成为新兴的模型生物斑马鱼(Zebrafish)是一种原产地印度和孟加拉的常见热带鱼，分类地位为辐鳍鱼纲，新鳍亚纲，鲤形目。斑马鱼体型较小，成鱼体长在4厘米左右，因为从鱼的鳃盖到尾鳍有若干条蓝色横向条纹，故被命名为“斑马鱼”。斑马鱼的养殖对水质要求不高，最适养殖温度在25℃左右，与其他养殖品种相比存活率高。雌雄斑马鱼较好鉴别，体型上雄鱼较雌鱼纤长，身上条纹颜色比雌鱼更深并且条纹间呈柠檬色，雌鱼的条纹色较淡，条纹间色呈银灰色，在性成熟期雌鱼的腹部会明显膨大。斑马鱼每次的产卵量大，胚胎透明且在24小时内就能发育成型。随生命科学领域的活跃，各种模型生物逐渐登上历史舞台，孟德尔通过小小的豌豆，为遗传学的产生做了奠基，豌豆至今也是遗传学重要的模型生物。二十世纪初随着遗传因子位于染色体的假说提出，黑腹果蝇开始成为新一代的模型生物，促成了现代遗传学的发展，成为生命科学领域的重要的模型生物。模型生物的种类随着时间推移将会愈发丰富。近年来，斑马鱼开始成为一种有吸引力的模型生物(Translationstudiesmodelbiology)。斑马鱼将哺乳动物模型的许多遗传和生理优势与无脊椎动物模型的高通量(Highthroughput)能力结合起来，并且实验的的操作性良好。人类约有70%的基因与斑马鱼的基因同源，具有较高的同源性。从遗传学上看，斑马鱼遗传特性和人类也高度吻合,被用于基因修饰(Geneticmodification)的开发和优化。从解剖学和生理学上来说，斑马鱼与人类的基因相似相较人类与老鼠要远得多，所以建立遗传疾病的模型更具挑战性[1]。但是由于斑马鱼的个体小，早期的胚胎透明易观察，培养成本较其他模型生物低，并且体内也有心血管系统，视觉系统，肾，肌肉系统等。这些都使得它成为近年来现代遗传学、发育生物学、病理学和免疫学研究中常用的模式生物。以斑马鱼为模型的实验在各领域都有所贡献，与以往的其他动物模型相比，斑马鱼的高性价比为许多研究提供了充足条件。在病毒研究领域，斑马鱼作为模型生物可以通过感染病原体的方式，观察病原体在斑马鱼体内产生的影响以及斑马鱼对病原体的感染是否具有抑制作用，随着基因编辑技术CRISPR/Cas9的广泛使用，以斑马鱼为模型生物的病毒学实验占比将越来越大[2]。不仅病毒学的研究开始对斑马鱼生物模型开始重视，中药学对斑马鱼的研究也逐渐增多，斑马鱼可以用作药效的检测，直观的观察斑马鱼的生理变化。同时对中药中的有效提取物，可以通过高通量筛选进行检测。培育成本的降低，使得许多中药药效能在斑马鱼模型上更彻底的表现出来[3]。在抗肿瘤药物的研发方面，可以培育荧光转基因的斑马鱼进行药物筛选，在透明的斑马鱼胚胎中可以观察到补益类药物对其血管的作用效果[4]。由于斑马鱼体内模型的完整度较高，利用斑马鱼模型也可测试出各种提取物对体内组织器官的影响，如西洋参提取物对心脏的保护作用就能够以斑马鱼作为模型生物[5]。以斑马鱼为研究对象还可以探究各类化合物对体内组织器官的影响，如农药三唑磷的刺激，会对斑马鱼肝脏内与抗氧化体系相关的酶的活性造成影响,或抑制或促进,从而影响斑马鱼的正常生命活动[6]。通过观察透明的斑马鱼胚胎，可以明显发现其中发育异常的突变体，因此该模型生物的出现提高了人工诱变的效率，为遗传突变提供了可靠条件[7]。斑马鱼现在也成为了研究造血的理想生物。由于细胞中的所有成分是通过造血过程来实现的，包括我们熟知的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板，这些都是通过复杂的遗传信号通路形成的，在整个系统发育过程中高度保守。目前通过大规模的前向基因筛选在斑马鱼中已经发现了大量的血液突变体，这对揭示造血干细胞(HSCs)和各种造血细胞系重要的特定信号通路[8]有莫大的帮助。1.2Trmt2b基因简介所有物种的RNA分子都含有修饰过的核苷酸，尤其是m5U残基。脊椎动物线粒体小亚单位rRNA在一个独特的位点含有m5U核苷酸。研究发现Trmt2b负责在许多线粒体tRNA物种中形成这种核苷酸和m5U残基。Trmt2b基因失活导致呼吸链复合物I、III和IV的活性降低，其中包含线粒体蛋白合成装置合成的亚基[9]。RNA在转录后修饰中发挥宿主作用，这些修饰共同构成了转录后组。5-甲基尿苷(5-methyluridine,m5U)是对细胞RNA最常见的修饰之一，在54位的细菌和真核细胞的tRNAs中几乎无所不在[10]。Trmt2b是一种定位于人线粒体的甲基转移酶，催化所有tRNA中5-甲基尿苷在m5U54的形成。m5U54修饰已在人类[11-12]的细胞质和线粒体tRNAs中被鉴定，其中前者最近被鉴定为由Trmt2a催化，后者是人类酵母Trm2和Trmt2b的两个同源物之一。Trmt2b也可能在tRNA的稳定或成熟中起作用[13-15]。Trmt2b也是Trma蛋白家族的一员，与Trmt2a是同源蛋白，其基因存在于黑猩猩、恒河猴、狗、牛、老鼠、鸡、斑马鱼和青蛙上。是一种定位于人线粒体的甲基转移酶，能够促进线粒体翻译。1.3CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)为规律间隔的短回文序列，Cas(CRISPRassociatedprotein)是crRNA引导的DNA内切酶。CRISPR/Cas9技术通过单链sgRNA，直接识别DNA序列，并实现高效精确的DNA切割，再利用细胞的非同源末端重组或同源重组对断裂的DNA进行修复，可实现对靶基因的敲除、敲入[16]。1.4本课题研究的意义和价值本课题进一步证明了斑马鱼模型生物在基因编辑领域的重要作用，一方面从理论上给将来研究Trmt2b相关蛋白在斑马鱼线粒体中的具体作用提供了较为稳定的突变体模型，另一方面由于斑马鱼的Trmt2b基因与人类具有较高的同源性，从斑马鱼这一模型生物的相关研究可以类比到人类，为攻克相关的人类疾病提供了条件。实验的同时也验证了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率，让之后的研究者能够更广泛的使用该技术。2材料与方法2.1实验仪器(1)PCR仪(MJResearch公司)(2)低温冷冻离心机(Eppendorff公司)(3)凝胶成像及分析系统(Syngene公司)(4)蛋白质核酸定量仪(Eppendorff公司)(5)电泳仪(BIO-RAD公司)(6)离心机(Eppendorff公司)(7)涡旋振荡器(8)超纯水系统(AIUATECUSA)(9)恒温水浴锅(Pharmacia公司)(10)电子分析天平(MONOBIOCChina)(11)XTP45-T1体视显微镜(motic公司)(12)气压电控式显微注射器(美国WPI公司)(13)IMAGEPRO图像处理软件MediaCybernetic2.2实验试剂(1)DEPC(Sigma公司)(2)RNA逆转录试剂盒(ThermoFisherScientific公司)(3)胶回收纯化试剂盒(TaKaRa公司)(4)T4DNA连接酶(TaKaRa公司)(5)氨苄青霉素和寡核苷酸(上海生工公司)(6)MAXISCRIPT试剂盒(上海博耀生物科技有限公司)(7)Xbal内切酶(购自Promega公司)(8)Cas9体外转录试剂盒mMESSAGEmMACHINEkit-7(9)DNAmarker(TaKaRa公司)(10)E3幼鱼培养液：是一种混合盐溶液，目的是为了给幼鱼提供一个微盐环境。其组分和浓度为：氯化钠5mM，氯化钾0.17mM，氯化钙0.33mM和硫酸镁0.33mM。将上述物质溶于去离子水中，灭菌备用。2.3实验动物斑马鱼由南通大学生命科学学院提供。野生型斑马鱼AB品系来源于zebrafishInternationalResourceCenter。2.4sgRNA设计从生物数据库(Ensemble)下载Trmt2b基因全长序列。了解该基因组上编码序列、功能域、结构域等详细信息，并用NCBI网站对目的基因的信息进行校对与补充，CRISPR/Cas9的剪切位点位主要在于一段名为“PAM”的公共序列(protospacer-adjacentmotif)即NGG位点之前。因此，要对Trmt2b进行靶点的设计。首先，需要对所有含有NGG位点进行初步的筛选，将起始碱基为GG、GA、AA、AG的序列全部筛出作为备选序列，之后再从中选择3-6个序列作为sgRNA序列。其次，要去掉序列开头的NGG，并在前端添加上T7启动子的序列，同时在末端添加上质粒的F端引物同源序列。最后，针对Trmt2bsgRNA设计出验证时所需的PCR引物和测序引物，PCR引物一般都可以任意选择，但需要注意的是，测序引物必须在PCR引物之内进行选择，最好选择离突变位点100-500bp距离左右的位置。在Ensemble上下载斑马鱼Trmt2b基因外显子的全部序列，择优选取了一个靶位点。图1实验流程图2CRISPR/Cas9基因打靶示意图2.5sgRNA的制备1)PCR扩增以sgRNA模板质粒为模版，sgRNA引物与通用末端引物为引物，利用高保真酶进行PCR。PCR体系如下：ComponentVolume(uL)2×Buffer25.00uL2mMdNTPs10.00uLssgRNA1.50uL通用引物1.50uL模板质粒1.00uLKOD酶1.00uLddH2O10.00uL反应程序：94℃预变性5min；32个循环：98℃变性10s，50℃退火30s，68℃延伸30s；68℃延伸5min。2)琼脂糖凝胶电泳取1μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并且检测产物条带是否符合预期且条带单一为最优。具体操作步骤如下：1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用90mL、中胶用60mL、小胶用30mL)：称取0.3g琼脂糖置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，得到1.0%琼脂糖凝胶液。选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。

2.选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mM。

3.摇匀后轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3-5mM。倒胶时要注意，不能有气泡出现，如果有气泡产生可用吸管小心吸去。

4.琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20min，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。

5.将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1-2mM。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。

6.将4.5μLDNA样品与0.5μLloadingBuffer缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内。再在一个孔里加入5μLmaker(2000)。7.用移液枪将样品小心加入加样孔内，给点样顺序做好记录，以区分样品结果。

8.盖上电泳槽，开启电源开关，120V、30min使DNA从负极向正极移动。3)胶回收纯化1.取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μL的平衡缓冲液至柱子中。13000rpm离1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。2.在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。3.将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5mL离心管，称重。先称一个空1.5mL离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。4.加3倍体积溶胶液DD。5.56℃水浴放置10分钟(或直至胶完全溶解)。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。6.可选，一般不需要：每100mg最初的凝胶重量加入150μL的异丙醇，震荡混匀。有时候加入异丙醇可以提高回收率，加入后不要离心。回收大4Kb的片段时，不加入异丙醇，加入有时反而可能降低回收效率。7.将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1分钟，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。如果总体积超过750μL，可分两次将溶液加入同一个吸附柱EC中。8.加入700μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。9.加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。10.将吸附柱EC放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。11.取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1分钟。12.使用核酸定量仪测定回收纯化后的PCR产物的浓度和纯度。4)体外转录使用MAXISCRIPT试剂盒进行sgRNA体外转录的体系如下：ComponentVolume(uL)Buffer2μLNTPs(ATP、CTP、GTP、UTP)各1μLPCR纯化产物12μLEnzyme2μLfinalvolume20μL反应程序：37℃孵育2h，之后加入1μLTURBODNase，37℃孵育15min。sgRNA的纯化转录结束后的产物在经过LiCl纯化后，以每管量为500ng进行分装并保存到-80℃冰箱，用于后续的实验。LiCl纯化步骤如下：1.将Trmt2bsgRNA转录产物转移到一个新的1.5mL离心管，并加入20μL在-20℃提前预冷的LiCl和100μL异丙醇。放入-20℃的冰浴中，静置30min。2.在4℃下，放入离心机以>12,000rpm离心20min。3.弃去上清液，加入80%的乙醇溶液500μL洗涤沉淀。4.放入离心机，>12,000rpm在4℃下，离心5min。5.弃去上清液，将沉淀物置于室温环境下干燥。再加入10μLddH2O溶解沉淀。6.吸取0.5μL产物在核酸定量仪上测定纯化后的sgRNA浓度和纯度，再用0.5μL产物进行电泳检测。2.6Cas9mRNA转录1)使用mMESSAGEmMACHINEkit-7试剂盒，转录体系：ComponentVolume（uL）Buffer2.00uL2×NTPs/CAP10.00uLCas9plasmid质粒线性化纯化产物12.00uLEnzyme（酶）Mix2.00uLfinalvolume20.00uL于PCR仪中37℃孵育2h，孵育终止后加1uLTURBODNase，37℃15min去除模板。2)Cas9mRNA转录后纯化1.将Cas9mRNA转录产物转移到一个新的1.5mL离心管内，同时加入20uL在-20℃预冷过的LiCl和100uL异丙醇。在-20℃下冰浴30min，用离心机以>12000rpm在4℃下，离心20min。2.弃去上清液，用500uL80%的乙醇洗涤沉淀，在4℃下，用离心机以>12000rpm离心5min。3.弃去上清液，室温条件下干燥沉淀。4.加10uLddH2O将沉淀进行溶解。5.吸取0.5uL产物在核酸定量仪上测定纯化后的mRNA浓度和纯度，再用0.5uL产物进行电泳检测。将获得的Cas9mRNA以每管量为500ng进行分装并保存到-80℃冰箱。2.7斑马鱼胚胎获取挑选健康的雌雄斑马鱼各6条，以一条雌鱼一条雄鱼为一组放置入配种缸中，中间需用隔板分隔，次日抽出隔板使其自由交配，确认产卵后进行胚胎的收集，挑选200枚还处于单细胞状态的健康胚胎用于下阶段的显微注射。2.8胚胎显微注射将合成的gRNA和Cas9RNA混匀，使用气压电控式显微注射器将注射进斑马鱼胚胎，将胚胎置于培养皿中并加入E3溶液，放在28℃培养箱中培养。2.9sgRNA的鉴定显微注射后的胚胎F0代在24hpf(受精后小时数)用碱裂法提出DNA基因组，放入PCR仪进行扩增，然后测序从而评价gRNA是否有效。2.10纯合子斑马鱼的筛选将显微注射后的G0代与同一品系的野生型斑马鱼进行杂交，使用胚胎测序筛选出具有稳定遗传的新群体。然后再让新群体继续与同一品系的野生型斑马鱼杂交，可以得到F1代，用碱裂法测序鉴定成年的F1代，并筛选出敲除Trmt2b基因的杂合子斑马鱼，通过基因克隆测序可以鉴定出杂合子F1代的基因型。让F1代杂合子与同品系的野生型杂交得到F2代，通过基因克隆测序鉴定并筛选出具有相同基因型的F2代杂合子，最后让F2代自交获得F3代，等F3代成年后只要用基因克隆测序再次鉴定，筛选出Trmt2b基因敲除的纯合子斑马鱼。3实验结果3.1突变检测测序结果表明，sgRNA出现明显的套峰，并且重叠峰出现在Trmt2b靶位点酶切位点附近，证明sgRNA诱导突变有效，确定用此sgRNA进行实验。图3G0代靶位点突变效率检测图3.2Trmt2b敲除斑马鱼的构建与筛选G0代成年后与同品系的野生型斑马鱼杂交，通过对其胚胎进行测序，不能稳定遗传的只有单峰，可以稳定遗传的有明显的套峰。选取突变效率高的为F1代(如图5)，F1代成年后剪尾鳍鉴定其基因型，没有基因突变的野生型只有单峰，有基因突变的杂合子有套峰。将相同基因型的F1代筛选出并且自交。得到的F2代理论上将会有1/4的基因突变纯合子。图4F1代突变检测示例图4讨论本实验主要分为两大阶段，第一阶段为针对Trmt2b基因外显子设计sgRNA，合成sgRNA和Cas9mRNA，将其显微注射入斑马鱼胚胎。第二阶段开始以培养至性成熟和基因测序为主，将初始的注射胚胎测序后养成至成鱼，让其与野生型斑马鱼杂交。产生的胚胎筛选突变效率高的为F1代，剪尾鳍测出基因型，将相同基因型自交，得出的F2代中理论上有突变的纯合子。目前动物模型趋于多样，不同模型的作用和功能也不尽相同。用于斑马鱼模型的CRISPR/Cas9基因编辑技术现在被用于研究各种罕见的人类疾病，尤其是遗传类疾病的建模[1]。斑马鱼具有与哺乳动物类似的免疫器官、细胞以及免疫相关细胞因子和调控通路，同时具备先天免疫系统和适应性免疫系统。以往的模型生物往往都不能同时兼备易观察，培养成本低，耗时短，见效快的优势。常见的哺乳动物模型虽有抗病力强、稳定性好和采样方便等优点，但其造模时间长、饲喂成本高和不能进行实时活体病变观察等劣势[3]。斑马鱼的胚胎和早期鱼体呈透明状，可以明显观察到组织器官的变化，用荧光转基因斑马鱼模型可以比较中药提取物对胚胎心血管的作用。许多人认为斑马鱼这种创新型生物模型的出现对心血管疾病发生的分子和细胞机制的研究具有很大推动作用。有人对斑马鱼进行化合物的刺激，观察其内脏是否有损伤，体内酶活力的变化，简单的肾脏结构又可以作为肾脏发育和肾脏类疾病的研究[6-7]。这是斑马鱼模型生物现在广泛受到推崇的重要原因。本实验可以从理论上了得到Trmt2b基因敲除的斑马鱼模型，为后续进行该基因的功能研究提供了实验基础。国内关于Trmt2b的研究报道较少。有研究提出Trmt2b是人体线粒体中的甲基转移酶，催化所有tRNA中5-甲基尿苷在m5U54的形成。以斑马鱼为模型生物，利用CRISPR/Cas9系统构架的Trmt2b基因敲除斑马鱼模型，可以用于初探甲基转移酶缺失对斑马鱼线粒体的影响。通过对小鼠的研究发现脊椎动物线粒体小亚单位rRNA在一个独特的位点含有m5U核苷酸。Trmt2B基因的失活导致呼吸链复合体I、III和IV的活性降低，其中包含由线粒体蛋白合成装置合成的亚基[9]。m5U54修饰已在人类的细胞质和线粒体tRNAs中被鉴定，其中前者被鉴定为由Trmt2a催化，后者是人类酵母Trm2和Trmt2b的两个同源物之一，Trmt2b也可能在tRNA的稳定或成熟中起作用[10-12]。Trmt2b同时也是Trma蛋白家族的一员，与Trmt2a是同源蛋白。此次实验通过斑马鱼模型生物构建Trmt2b基因敲除的生物模型，可以用于以后探究甲基转移酶在人线粒体中的作用和Trmt2b基因缺失会产生何种实际影响。本次基因敲除使用CRISPR/Cas9系统，是因为与传统的TALEN和ZFN技术对比，CRISPR/Cas9具有许多优势。TALEN和ZFN都是蛋白质引导的DNA切割，但蛋白质合成、选择和验证过程复杂且耗时。CRISPR/Cas9是由sgRNA引导，短且方便设计，成本低且易于生产[16]。对靶向基因的编辑可以在不失精准的前提下，同时又兼容大规模的操作流程。由于自定义引导sgRNA对目标位点的识别，CRISPR/Cas9可在多个独立位点进行基因修饰，只需要为每个目标位点设计一个单一的寡核苷酸，此斑马鱼的基因敲除实验进行顺利，模型构建较稳定，再次验证了该基因编辑技术的便捷性是其重要优势。综上所述，本实验通过CRISPR/Cas9技术敲除转基因斑马鱼的Trmt2b基因，可以从理论上得到基因突变的纯合子斑马鱼，在实验过程中发现敲除Trmt2b基因敲除并未导致胚胎发育受损，细胞活性减弱，由于Trmt2b基因的敲除对斑马鱼的胚胎发育无明显影响，该生物模型可以成功构建。本次实验也是为未来深入研究Trmt2b基因功能提供稳定可靠的动物模型。

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