TCRHA052-2024基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术

ICS11.100

CCSC04

团体标准

T/CRHA052—2024

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基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价

技术

Evaluationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhumanliverorganoids

2024-05-15发布2024-05-20实施

中国研究型医院学会发布

T/CRHA052—2024

目次

前言.........................................................................Ⅱ

引言........................................................................Ⅲ

1范围.......................................................................1

2规范性引用文件.............................................................1

3术语和定义.................................................................1

4缩略语.....................................................................2

5一般规定...................................................................2

6评价内容及流程.............................................................5

7评价报告及结果解释........................................................10

附录A（资料性）S药物的肝脏毒性评价实验方案.................................12

附录B（资料性）S药物的肝脏毒性评价报告.....................................16

参考文献....................................................................19

I

T/CRHA052—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

则》给出的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责

任。

本文件由中国研究型医院学会肝胆胰外科专业委员会提出。

本文件由中国研究型医院学会归口。

本文件起草单位：清华大学附属北京清华长庚医院、中国食品药品检定研究院、中国

计量科学研究院、中国医学科学院药物研究所、中国科学院上海药物研究所、南方医科大

学、上海美迪西生物医药股份有限公司。

本文件主要起草人：王韫芳、柳娟、阴雯臻、李迪、耿兴超、王晶、傅博强、强桂芬、

潘国宇、彭双清、李桦、毕惠嫦。

II

T/CRHA052—2024

引言

药物不良反应是一个重要的临床问题，也是卫生系统的主要经济负担和制药行业面临

的巨大挑战。药源性肝损伤（drug—inducedliverinjury，DILI）是临床上最常见的药

物不良反应之一，也是当前急性肝损伤最为常见的病因之一，严重者可导致急性肝衰竭、

甚至死亡。

目前的临床前药物试验程序难以有效的预测患者是否发生DILI，评价模型和技术的缺

乏是造成药物研发失败率高的主要原因。采用合理、有效的模型预测药物-药物相互作用及

潜在DILI是制药领域面临的严峻科学挑战。传统二维培养的肝细胞（系）模型过于简单、

不具备生理特性而无法再现药物体内发生的相对复杂的代谢与毒性事件，而人源肝脏类器

官作为药物代谢及药物毒性预测的模型，能够更真实地反映候选药物对人体的影响，同时

可以减少动物研究所致的偏差。

近期，美国食品药品监督管理局发布了减少药物临床试验前的动物试验，而鼓励微组

织与器官芯片列为替代模型的指导原则。实际上，人源肝脏类器官模型已有许多公司和机

构用于药物筛选及评价，但其发展仍存在一些技术规范障碍。本文件的制定有助于推动基

于人源肝脏类器官的药物肝脏安全性评价的标准化建设，助力行业规范发展。

III

T/CRHA052—2024

基于人源肝脏类器官的药物肝脏毒性评价技术

【警示】使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本文件给出了基于人源肝脏类器官开展药物体外肝脏毒性评价的一般规定、评价内容及流程、评

价报告及结果解释要求。

本文件适用于医药企业、科研机构等试验人员开展基于人源肝脏类器官肝细胞脂肪变和胆汁淤积

相关的药物肝脏毒性评价。

本文件的试验方法适用于96孔板。其它孔数的多孔板可参考本文件。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适

用于本文件。

GB/T16886.5—2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（ISO10993-5:2009）

T/CSCB0008—2021原代人肝细胞

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

人源肝脏类器官humanliverorganoid

通过多能干细胞、组织前体细胞或者成体细胞，依靠细胞自组装能力构建的三维细胞结构，它具

备类似于人类肝脏的生理结构和功能，并能提供更准确和可靠的体外实验模型。

注：人源肝脏类器官可被用于评估药物对人肝脏的毒性影响，可以更好地预测药物的代谢途径、

药效和毒性反应。

3.2

药源性肝损伤drug-inducedliverinjury；DILI

由药物及其代谢物引起的肝细胞损伤和/或坏死，进而导致肝酶升高、黄疸、肝功能衰竭等肝功能

异常表现。

3.3

肝脏毒性评价hepatotoxicityevaluation

用来评估某种物质或药物对肝脏功能的潜在危害程度的过程。这种评价可以通过多种方法进行，

包括体外实验、动物模型和临床观察。

3.4

剂量反应关系dose-responserelationship

药物暴露剂量与生物效应之间的关系，通常使用剂量反应曲线来描述。

1

T/CRHA057—2024

3.5

对照组controlgroup

在进行肝脏毒理学评价时，为便于与实验组进行比较而设立的一组参照物质或实验样本。它是一

种不含受试物的介质，在进行受试物处理时放置于与试验样品相同的器皿中，并在与试验样品相同的

条件下进行处理。

3.6

实验样本experimentalsample

在肝脏毒理学评价中用于进行分析、观察和验证的被测试物质或物体的代表性样品。

3.7

溶剂空白solventblank

为检测实验中可能产生的背景噪音或误差而设置的，不含待测物或对照品的介质，用以确保实验

结果的准确性和可靠性。

[来源：GB/T16886.5—2017，3.3，有修改]

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ALB——白蛋白（Albumin）

ALT——谷丙转氨酶（Alaninetransaminase）

AOP——有害结局路径（Adverseoutcomepathway）

AST——谷草转氨酶（Aspartatetransaminase）

CMFDA——5-氯甲基荧光素醋酸酯（5-chloromethylfluoresceindiacetate）

CYPs——细胞色素酶P450（CytochromeP450enzymesystem）

DMOS——二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）

FBS——胎牛血清(Fetalbovineserum)

GSH——谷胱甘肽（Glutathione）

HCS——高内涵筛选（Highcontentscreening）

MMP——线粒体膜电位（Mitochondrialmembranepotential）

P/S——青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）

ROS——活性氧（Reactiveoxygenspecies）

5一般规定

5.1试剂

试剂选择如下：

a）细胞活力检测试剂应使用细胞活力检测试剂盒；

b）生化指标检测试剂应使用谷丙转氨酶(ALT/GPT)试剂盒和谷草转氨酶(AST/GOT)试剂盒；

c）生化指标检测试剂宜根据肝脏损伤的毒性结局类型，优先推荐检测细胞活率、细胞凋亡、脂肪

性病变和胆汁淤积4个肝毒性评价指标，主要检测指标及对应检测试剂见下表1。

2

T/CRHA052—2024

表1HCS试验中荧光探针选择

激发波长发射波长

检测指标荧光探针/

Excitationwavelength/

DetectionindicatorFluorescentprobe

emissionwavelength

细胞活率CalceinAM495/515nm(green)

EthD-1495/635nm(red)

细胞凋亡Caspase-3/7502/530nm(green)

脂滴面积与微组织面积的比值；

脂滴总荧光强度与微组织面积的比值NileRed543/598nm(red)

形成的微胆管面积与微组织面积的比值；

微胆管平均荧光强度CMFDA492/517nm(green)

注：通常选用几个终点组合以获得最准确的DILI检测结果，针对不同的检测指标选用不同的荧光染

料，在同时检测多个肝毒性评价指标时，要求每种荧光染料的激发波长和发射波长不重叠。

5.2材料和培养器皿

5.2.1人源肝脏类器官的细胞

人源肝脏类器官的细胞应选用来源于肝细胞系（包括但不限于Huh7，HepG2-C3A，LO2，

HepaRG）、原代肝细胞、原代肝细胞衍生的肝细胞、干细胞分化来源的肝细胞等新型肝细胞体系,包

括但不限于:

——胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化来源的肝细胞;

——直接转分化肝细胞;

——退分化形成的肝细胞ProliHH。

5.2.2待测药物

待测药物的准备应按《人用药品注册技术要求国际协调会ICH三方协调指导原则》，其工作时的

最高浓度设置应符合以下要求：

——不受溶媒或培养液中的溶解度限制时，最高浓度是1mM或0.5mg/ml（选择其中较低者）；

——受到溶解度限制时，最高浓度应采用培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度（若其不干扰评

分）。通过肉眼或光镜检查等方法对沉淀进行评价，来说明在培养过程中沉淀持续存在或出现（至给

药结束）。

5.2.3培养细胞所需溶液

应选取适当配方的、含有必需营养物和辅助因子的细胞培养基，用于支持人源肝脏类器官的生长

和维持，包括：

——0.05%胰蛋白酶-EDTA用于人源肝脏类器官的释放和分离。

——磷酸缓冲液（PBS）用于洗涤和处理人源肝脏类器官样本。

——蒸馏水（或任何适合细胞培养的纯化水）用于制备培养基、溶液和洗涤人源肝脏类器官。

5.2.4培养器皿

应选用适用于细胞培养的器皿，包括但不限于：

——玻璃培养皿

——塑料培养瓶或塑料多孔培养板

——微量滴定板

——96孔组织细胞培养级孔板。

注：只要符合组织培养的要求，并可以用于动物细胞的培养，其他孔板（如384孔板、24孔板和6

孔板）也可以替代使用。

5.3仪器

5.3.1培养箱

稳定的温度（37℃）、稳定的CO2水平（5%）、较高的相对饱和湿度（95%）。

3

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5.3.2多功能酶标仪

适用于96孔板培养器皿、波长范围：400-1000nm、带有发光检测模块。

5.3.3高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜

高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜应符合以下要求：

——高内涵细胞定量成像分析系统，包括全自动高速显微成像、全自动图像分析和数据管理。

——荧光显微镜，包括光源、滤板系统和光学系统。

——系统和显微镜的激发波长范围为355-675nm，发射波长范围为430-760nm。

5.3.4离心机

应符合以下要求：

——加速度大于等于2000rcf；

——离心力1,000~10,000rcf。

5.3.5超净工作台或生物安全柜

应提供高效的环境净化，包括无菌空气过滤、消毒和防护机制，以确保细胞培养过程中的无菌操

作和确保细胞及操作者的生物安全。

5.3.6倒置相差显微镜

应具有高分辨率和高清晰度（10倍、20倍、40倍或60倍物镜），能够显示微小组织结构和细胞；

配备有高质量物镜和目镜。

5.3.7实验室天平

应使用电子式天平，量程为0.1mg~200g，分度值不大于1mg。

5.3.8电子细胞计数仪或血细胞计数器

应能够快速、精准地计数细胞数量，并具备高度重复性和准确性。

5.4准备工作

5.4.1评价方案准备

开展药物肝脏毒性评价前应制定评价实验方案，方案内容及格式参见附录A。

5.4.2测试用试剂准备

5.4.2.1CTG试剂盒应按以下步骤准备：

1)将试剂盒放置在4℃过夜，使试剂缓慢解冻；

2)在使用前将试剂置于22℃水浴中约30min，将其温度平衡至室温；

3)颠倒内容物轻轻混匀，以获得均质溶液。

5.4.2.2ALT和AST试剂应按以下步骤准备：

1)使用前将试剂置于37℃水浴中预热约30min；

2)颠倒内容物轻轻混匀，以获得均质溶液。

5.4.3CalceinAM/EthD-1试剂应按以下步骤准备：

1)-20℃避光保存，

2)使用前用预热好的无血清细胞培养基或PBS稀释储存液配制2µMCalceinAM和4µMEthD-I

的染色工作液。

5.4.4Caspase-3/7试剂应按以下步骤准备：

1)用DMSO配制2mM储存液；

2)使用前用预热至37℃的无血清细胞培养基或PBS稀释储存液，终浓度为200nM。

5.4.5NileRed试剂应按以下步骤准备：

1)用DMSO配制1mM储存液；

2)使用前用预热好的无血清细胞培养基或PBS稀释储存液，终浓度为200-1000nM。

4

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5.4.6CMFDA试剂应按以下步骤准备：

1)用DMSO配制10mM储存液；

2)使用前用无血清培养基稀释储存液至工作液浓度（0.5-25µM），并将探针工作液于37℃预热。

5.4.7待测药物准备

应按以下步骤准备：

——根据药物说明书，使用适当的溶剂将待测药物完全溶解，配置成一定浓度的储备液；

——通过文献检索等方式，确认待测药物的最佳浓度范围，并在此范围内至少设计5个浓度梯度，

同时设对照组；

——如果药物需冷冻储存，避免3-4个以上的冷冻/融化周期；

——准备不含药物的对应溶剂用于溶剂空白对照。

5.4.8仪器准备

在测定前确保酶标仪读数的一致性、高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜等仪器运行正常。

6评价内容及流程

6.1DILI肝毒性评价指标

主要的DILI肝毒性评价指标包括：

——细胞活性。通过评估细胞活性，可以了解药物对肝细胞代谢活力和功能状态的影响，若细胞

的活力低于对照空白组的70%，则可以推断该药物可能具有潜在的细胞毒性效应，并据此来衡量它对

肝细胞生存力的具体损害程度；

——生化指标。生化指标ALT和AST是反映细胞受损程度的重要指标，可评估其对肝脏健康的

潜在影响；

——细胞活率。细胞活死评估通过考虑细胞死亡和存活的比例，能够评估药物对肝细胞的毒性效

应；

——细胞凋亡。细胞凋亡的程度可以衡量细胞程序性死亡的程度，是肝毒性的重要指标之一；

——脂肪变性。反映肝细胞脂质代谢紊乱的指标，药物引起的脂肪变性可能与肝脏损伤相关；

——胆汁淤积。胆汁淤积相关的指标对于鉴别是否存在胆道系统的损伤以及病情严重程度具有重

要意义。

——在评价药物肝毒性时，还需要考虑其他因素，例如药物代谢能力、细胞通透性和药物在体内

的输送等。

6.2操作流程

药物对人源肝脏类器官的毒性特征主要通过细胞活力读数，生化指标，以及细胞活率、细胞凋亡、

脂肪变性和胆汁淤积这4个评价指标来进行表征。流程如图1所示。

5

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图1操作流程

6.3人源肝脏类器官培养板准备

6.3.1选用的人源肝脏类器官应符合T/CSCB0008-2021中5.2要求，肝细胞的基础形态与功能属性，

比如蛋白质分泌、代谢解毒等，应达到必要的安全标准。合格的人源肝脏类器官应满足以下条件：

a)ALB阳性细胞比例≥90%，同时HNF4A阳性细胞比例≥90%；

b)白蛋白分泌≥800ng/(106细胞/24h)；

c)药物代谢酶功能活跃，以CYP3A4为例，其对6-OH睾酮的内在清除率需不低于100µL/(106

细胞/h)；

d)经检测确认，无细菌、真菌、支原体污染，并且对HIV、HAV、HBV、HCV、HTLV、EBV、

HCMV、TP等均为阴性。

6.3.2将符合要求的人源肝脏类器官接种于96孔板，应确保每孔接种细胞的一致性，每孔200µl培

养基，确认人源肝脏类器官的细胞生长状态良好。

6.3.3人源肝脏类器官培养板的布局应按以下要求操作：

a）96孔板的边缘孔不接种细胞，并加入100µl的PBS，防止培养基蒸发，影响人源肝脏类器官

的生长以及影响待测药物的浓度；

b）如图2所示，在板①的第二列中，只加入培养基和相应浓度的待测药物，不加入细胞。同样

地，在第九列中，只加入培养基和相应浓度的阴性药物，不加入细胞，作为溶剂空白样本。这样做的

目的是为了排除待测药物可能产生的背景噪音。

c）板②中除边缘孔，均加细胞，如图3所示。

注：其中板①中涉及到的无肝毒性药物（阴性药物）主要包括：阿司匹林(Aspirin,ASP)、安倍生

坦(Ambrisentan,AMB)、普萘洛尔(Propranolol,PRO)、华法林(Warfarin,WAR)、罗格列酮(Rosiglitazone,

RLZ)等。

图2人源肝脏类器官培养板布局——板①

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图3人源肝脏类器官培养板布局——板②

6.4药物处理人源肝脏类器官

6.4.1设计待测药物加样板

待测药物加样板的基本设计见图4、图5。每孔200µl的待测药物，第二行为对照组，只加不含

药物的培养基；从第三行至第七行为药物由低到高的5个浓度梯度（具体浓度梯度要根据该药物的实

际使用浓度来设置）。

图4待测药物加样板布局——板①

图5待测药物加样板布局——板②

6.4.2药物处理人源肝脏类器官

应按以下步骤操作：

1）用200µl的吸头将人源肝脏类器官培养板中的培养基吸走100µl；

2）按图4和5所示，每孔加入100µl相应的2倍浓度的药物溶液；

3）将加入药物的加样板置于培养箱中培养24h。

4）24h后，用显微镜或高内涵细胞定量成像分析系统在明场下检查人源肝脏类器官，观察并记录

其组织结构、细胞形状、细胞核形态、组织密度以及组织的完整性。

注：不同时间的三次重复试验，药物溶液需要重新配制。

7

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6.5细胞活力检测试剂处理细胞

6.5.1添加CTG试剂

应按下列步骤加入CTG试剂：

a)准备不透明壁多孔板，多孔板必须与所用的发光检测仪兼容；

b)吸取待测药物加样板（板①）第二列至第五列，以及第九列至第十一列中100µl含有人源肝

脏类器官的药物溶液加入不透明壁多孔板对应的孔中；

c)将板及其内容物平衡至室温（22–25℃）约30min；

d)添加与每孔中待测药物溶液等体积（100µl）的CTG试剂；

e)充分混合5min，使细胞裂解；

f)将培养板在室温再孵育25min，以稳定发光信号。

6.5.2测量CTG发光值

应按下列步骤使用酶标仪测量CTG发光值：

a)在每个待测孔中确保没有气泡。

b)设置酶标仪，以记录每个待测孔的发光值。

c)确定背景发光值，记录第二列不含有细胞只含培养基的对照孔的发光值。

d)确定读数时间，每孔整合读数时间设为（0.25-1）s可作为设置参考。

e)等待适当的反应时间，以便反应达到平衡状态，然后记录每个孔的发光值。

6.6测定生化指标ALT和AST转移酶

6.6.1ALT/AST标准曲线

应按照以下步骤制备ALT/AST标准曲线：

a)准备一系列浓度的丙酮酸钠标准溶液，浓度分别为0、2、4、6、8、10μmol/L。每个浓度配

制20ml。

b)在96孔板中按照以下顺序加入试剂：

——每孔加入0.1mol/L磷酸缓冲液5μl；

——按照浓度梯度，每孔分别加入2μmol/mL丙酮酸钠标准溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl；

——每孔加入基质缓冲液18μl、16μl、14μl、12μl、10μl；

——每孔加入2,4-二硝基苯肼20μl。

c)将96孔板轻轻水平摇动，使溶液混合均匀。

d)室温放置15min。

e)使用酶标仪测量每个孔在波长为510nm时的吸光度值。

6.6.2数据处理

各孔吸光度减去零孔吸光度，所得差值为绝对OD值作为横坐标，对应的丙酮酸钠浓度作为纵坐

标，绘制标准曲线。

6.6.3细胞上清中ALT和AST测定

应按照以下步骤测定细胞上清中ALT和AST：

a)准备酶标仪检测板。

b)向酶标仪检测板的测定孔和对照孔中加入20μL已预温至37°C的ALT或AST基质液，将

5μL待测药物加样板（板①）第六列至第八列中的待测上清加入测定孔中，混匀后在37°C

下孵育30min。

c)向每个孔中加入20μL二硝苯肼液，对照孔中加入5μL待测药物加样板（板①）第六列至第

八列中的待测上清，混匀后在37°C下孵育20min。

d)向每个孔中加入200μL浓度为0.4mol/L的氢氧化钠溶液，混匀后在室温下孵育15min。

8

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e)在波长为510nm的条件下，使用酶标仪测定各个样品孔的光密度（OD）值。

6.7评价药物肝脏毒性

6.7.1利用荧光分子探针孵育人源肝脏类器官

待测药物与人源肝脏类器官共培养24h以后，用PBS洗涤1次，为防止人源肝脏类器官的损失，

每孔剩余100µl的PBS。加入探针染料，按下列步骤进行染色:

a）Live/dead染色

1）在药物加样板（见图5，板②）的第二列至第四列加入100µl含2×的CalceinAM探针（2

µM）和EthD-1探针（4µM）的无血清培养基37℃(避光)孵育30min；

2）用无荧光探针的空白培养基进行多次重复半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰；

3）每孔加入100µl含2×的Hoechst（10µg/ml）的无血清培养基37℃(避光)孵育10min。

b）Caspase-3/7和NileRed染色

1）在药物加样板（见图5，肝脏毒性检测板）的第五列至第七列加入100µl含2×的Caspase-

3/7探针（200nM）和NileRed探针（5µM）的无血清培养基37℃(避光)孵育30min；

2）用无荧光探针的空白培养基进行多次重复半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰；

3）每孔加入100µl含2×的Hoechst（10µg/ml）的无血清培养基37℃(避光)孵育10min。

c）CMFDA染色

1）在药物加样板（见图5，肝脏毒性检测板）的第八列至第十一列加入100µl含2×的CMFDA

探针（30µM）的无血清培养基37℃(避光)孵育30min；

2）用无荧光探针的空白培养基进行多次重复半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰；

3）在无血清培养基中孵育45min；

4）每孔加入100µl含2×的Hoechst（10µg/ml）的无血清培养基37℃(避光)孵育10min。

6.7.2洗涤细胞

用无荧光探针的空白培养基进行多次重复半数换液操作以去除未结合游离探针的干扰。

6.7.3采集荧光图像

使用高内涵细胞定量成像分析系统或荧光显微镜的对应通道对人源肝脏类器官进行成像，其中

CalceinAM的激发波长/发射波长为495/515nm、EthD-1的激发波长/发射波长为495/635nm、Caspase-

3/7的激发波长/发射波长为502/530nm、NileRed的激发波长/发射波长为543/598nm，CMFDA的激

发波长/发射波长为492/517nm，Hoechst的激发波长/发射波长为346/460nm。

6.8数据分析

6.8.1细胞活力分析

a）计算CTG法细胞相对活力，见公式（1）：

RCV=(FI加药组-FI空白)/(FI对照组-FI空白]×100%………（1）

式中:

RCV：细胞相对活力；

FI加药组：具有细胞、CTG试剂和药物溶液的孔的发光值；

FI空白：具有培养基和CTG试剂而没有细胞的孔的发光值；

FI对照组：具有细胞、CTG试剂而没有药物溶液的孔的发光值；

b）使用Excel或GraphPadPrism绘制每种药物的样品剂量反应关系曲线。

6.8.2生化指标分析

6.8.2.1计算细胞上清ALT

1）根据6.6.1中所测标准曲线，按照试剂盒说明书提供的计算方法进行计算；

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2）使用Excel或GraphPadPrism绘制每种药物的样品剂量反应关系曲线。

6.8.2.2计算细胞上清AST

1）根据6.6.1所测标准曲线，按照试剂盒说明书提供的计算方法进行计算；

2）使用Excel或GraphPadPrism绘制每种药物的样品剂量反应关系曲线。

6.8.3多参数分析

6.8.3.1使用高内涵图像分析软件或者ImageJ软件定量每个视野下各通道（CalceinAM、EthD-1、

NileRed、Caspase-3/7、CMFDA和Hoechst）阳性（染色）细胞的数量和荧光强度，至少计数25个视

野。应计算以下内容：

1）计算活细胞数量与死细胞数量的百分比，见公式（2）：

X=NCalceinAM_PC/(NEthD-1_PC)×100%…………（2）

式中：

X：活细胞数量与死细胞数量的百分比；

NCalceinAM_PC：活细胞数量；

NEthD-1_PC：死细胞数量。

2）计算Caspase-3/7阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（3）：

FICaspase-3/7+=FICaspase-3/7总/S×100%…………（3）

式中：

FICaspase-3/7+：Caspase-3/7阳性（染色）细胞的平均荧光强度；

FICaspase-3/7总：Caspase-3/7阳性细胞的总荧光强度；

S：微组织的面积。

3）计算NileRed阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（4）：

FINileRed+=FINileRed总/S×100%……………（4）

式中：

FINileRed+：NileRed阳性（染色）细胞的平均荧光强度；

FINileRed总：NileRed阳性细胞的总荧光强度；

S：微组织的面积。

4)计算CMFDA阳性（染色）细胞的平均荧光强度，见公式（5）：

FICMFDA+=FICMFDA总/S×100%……………（5）

式中：

FICMFDA+：CMFDA阳性（染色）细胞的平均荧光强度；

FICMFDA总：CMFDA阳性细胞的总荧光强度；

S：微组织的面积。

6.8.3.2计算阳性细胞的百分比和阳性细胞的平均荧光强度（以为表示），并用Excel或

GraphPadPrism绘制待测药物的样品剂量反应关系曲线。

x±s

7评价报告及结果解释

7.1评价报告

应记录药物评价试验相关信息，撰写评价报告，评价报告内容和格式参见附录B，评价报告内容

包括但不限于：

a)试验概述，包括对肝脏毒性评价的基本目的和原则的阐述，以及细胞实验的相关信息。

b)药物信息，包括药物的名称、理化性状、配制方法和所用浓度等。

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T/CRHA052—2024

c)试验设计，详细描述人源肝脏类器官的制备过程，药物的种类、浓度以及试验的持续时间等信

息，以确保试验的科学性和可靠性。

d)试验方法，简述肝脏毒性评价的操作步骤和所用统计学方法，以及结果判定标准。

e)测定指标及设备，详细列出本试验中测定的各指标，包括细胞活力读数，生化指标，以及细胞

活率、细胞凋亡、脂肪变性和胆汁淤积这四种染色评价指标的测定方法及主要检测仪器的名称和

型号。

f)检测结果，用适当的统计表格列出各项指标的测定结果，包括细胞活力读数，生化指标，以及

细胞活率、细胞凋亡、脂肪变性和胆汁淤积四种染色评价指标的结果。

g)评价结果解读，对所使用的药物对人源肝脏类器官的毒性进行合理解释，包括对毒性机制进行

分析和讨论，并提出所得结论。

h）其它，包括贡献者、参考文献等内容。

7.2结果解释

应从试验结果给出药物对人源肝脏类器官毒性影响结论，解释肝脏损伤与剂量响应关系。给出毒

性具体表现及肝脏减毒反应，解释药物对肝脏表现出的剂量依赖关系的毒性作用。

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附录A

（资料性）

S药物的肝脏毒性评价实验方案

A.1实验概述

本实验以HepaRG细胞三维培养形成的人源肝脏类器官为例，针对药物S进行肝脏毒性评价的实

验需求，拟定如下具体操作方案。通过此评价，旨在充分了解S药物对人体肝脏的潜在毒性，并为相

关领域的研究提供实证支持。

A.2材料和方法

A.2.1概述

用此标准评估S药物对人源肝脏类器官的肝脏毒性作用。

A.2.2试剂

A.2.2.1细胞活力检测试剂

CellTiter-Glo®LuminescentCellViabilityAssay(CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒，简称

CTG)

A.2.2.2谷丙转氨酶(ALT/GPT)试剂盒和谷草转氨酶(AST/GOT)试剂盒

A.2.2.3用于细胞影像检测肝毒性筛选的检测试剂

激发波长发射波长

检测指标荧光探针/

Excitationwavelength/

DetectionindicatorFluorescentprobe

emissionwavelength

（）

细胞活率CalceinAM495/515nmgreen

EthD-1495/635nm（red）

细胞凋亡Caspase-3/7502/530nm(green)

脂滴面积与微组织面积的比值；

脂滴总荧光强度与微组织面积的比值NileRed543/598nm(red)

形成的微胆管面积与微组织面积的比值；

微胆管平均荧光强度CMFDA492/517nm(green)

A.2.3材料

a）构建人源肝脏类器官的细胞：HepaRG，无支原体污染

b）待测药物：S药物

c）Williams’EMedium培养基(不含谷氨酰胺)

d）FBS（胎牛血清）

e）青霉素

f）链霉素

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g）0.05%胰蛋白酶-EDTA

h）磷酸缓冲液（PBS）

i）蒸馏水或任何适合细胞培养的纯化水

j)谷氨酰胺

k)胰岛素

l)氢化可的松

A.2.4仪器

见第7章。

A.3准备工作

A.3.1概述

所有涉及的溶剂(培养基以外)、玻璃器皿及其他实验材料都应进行灭菌处理，以防止细菌和其他

微生物的污染。此外，所有操作都必须在无菌条件下，使用符合生物安全标准的无菌操作台进行，以

确保实验结果不受到外界干扰因素的影响。

A.3.2培养基

用于培养HepaRG细胞系和人源肝脏类器官的培养基：

——10%胎牛血清（FBS）;

——90%DMEM；

——100IU/mL青霉素；

——100µg/mL链霉素;

——2mM谷氨酰胺;

——5µg/mL胰岛素;

——0.5mM氢化可的松。

A.3.3细胞培养

A.3.3.1细胞复苏和培养

a)从冷冻细胞库中取出需要恢复的细胞样本，并放置于低温水浴中快速融解；

b)将融解后的细胞转移到含有适当培养基的离心管中，并进行短暂离心使细胞沉淀在离心管底部，

去除上清液；

c)用5ml培养基(10%FBS)重悬细胞，并转移到10cm的培养皿中，放置在标准培养条件下的培养

箱中培养；

d)每两天用PBS洗三次细胞，并换液。

注：复苏后的第一代培养过程中，细胞可能生长缓慢。所以一旦复苏，在实验之前细胞要传代至

少两次。

A.3.3.2细胞传代

a)用PBS洗涤3次细胞以去除细胞外活性物质和培养基残留。

b)加入适量的胰酶，进行细胞消化。在消化过程中控制消化时间，待细胞在显微镜下呈现圆缩时

停止消化，并加入含FBS的培养基以终止消化。

c)用吸管轻轻吹打细胞，将细胞从培养皿中吹打下来，并将细胞和培养基等混合物转移至离心管

中。注意避免吸入过多液体，以免影响后续离心效果。

13

T/CRHA057—2024

d)进行轻柔的离心，一般建议采用400rcf离心2min的程序。过程中应尽量避免离心速度太高，

以减少对细胞的机械损伤。

e)弃去上清液，用新鲜的培养基重新悬浮细胞，使细胞能够恢复生长并继续进行传代培养。

f)选择1:4或1:5的比例来进行传代，以确保细胞在新的培养条件下能够获得更好的生长状态。

注：细胞传代培养通常应该控制传代次数，不应超过3个月，以避免细胞发生异常。

A.3.3.3确保细胞生长状态良好

a)取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

b)计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），

每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致；

c)每天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养7天。

d)以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即为该细

胞的生长曲线，并通过统计学方法对数据进行分析，得出细胞生长规律，生长曲线斜率即为细胞生长

速率。

生长曲线

4

3.5

3

5

0

1

*2.5

2

1.5

1

0.5

0

012345678

生长天数（d）

图A.1HepaRG细胞生长曲线

如图B.1图所示，HepaRG细胞在0-2天内生长缓慢，2-5天内生长迅速，5-7天内逐渐趋于平稳，

表现为指数型增长，细胞生长速率为0.5577。

A.3.4测试用试剂准备

按8.1章准备。

A.3.5测试用S药物准备

根据药物说明书用合适的溶剂充分溶解待测药物和无肝毒性药物阿司匹林(Aspirin,ASP)到储存浓

度。5个浓度梯度分别为：1.92µM,9.6µM,100µM,440µM,1500µM。

A.4人源肝脏类器官的制备

A.4.1制作超低吸附圆底96孔板

利用琼脂糖制作超低吸附96孔板。具体方法如下：将加热的0.8%琼脂糖胶以每孔50µL-100ul的

体积分配到96孔培养器皿的所有孔中，确保琼脂糖胶在分配时保持流动；将板置于37℃、5%CO2培

养箱中至少20min，使琼脂糖胶聚合，在所有孔的底部形成凹面的聚合层。

A.4.2接种细胞

将生长状态良好的HepaRG细胞，按每孔400个细胞的密度接种到已制备好的具有超低吸附圆底的

两个96孔板培养器皿中（细胞活力检测板和肝脏毒性检测板的布局见9.2.1章），补充200µl培养基，

培养在细胞培养箱中。每3天用100µl新鲜培养基替换100µl旧培养基，培养14天。细胞在3D培养

条件下自组装培养形成肝脏类器官。

A.5人源肝脏类器官在培养液中暴露于S药物溶液

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细

胞

数

量

（

）

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按照9.2章的步骤用不同浓度的待测S药物处理人源肝脏类器官24h。用显微镜或高内涵在明场下

检查人源肝脏类器官，记录下细胞的状态和形态。

A.6评价S药物对人源肝脏类器官的肝脏毒性作用

a）按照9.4章使用细胞活力试剂CTG处理人源肝脏类器官，检测人源肝脏类器官的活性。

b）按照9.5章使用ALT和AST试剂盒检测人源肝脏类器官的培养上清，检测人源肝脏类器官的受损程

度。

c）按照9.6章使用CalceinAM探针和EthD-1探针、Caspase-3/7探针和NileRed探针，以及CMFDA探

针处理人源肝脏类器官，利用高内涵成像系统或荧光显微镜的对应通道对人源肝脏类器官进行成像，

多参数评价药物S的肝脏毒性。

A.7数据采集及评价结果解读

见附录B。

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附录B

（资料性）

S药物的肝脏毒性评价报告

B.1试验概述

本研究的主要目的是评估S药物对人源肝脏类器官的肝脏毒性作用。以HepaRG培养出的人源肝脏

类器官为实验对象，使用不同浓度的S药物进行处理，通过细胞活性检测，以及细胞死亡、细胞凋亡、

脂肪变性以及胆汁淤积等多参数评价方法，进行全面的肝脏毒性评估。

B.2药物信息

根据药物说明书用培养基充分溶解S药物到储存浓度10mM。本试验中的使用浓度分别为：1.92

µM,9.6µM,100µM,440µM,1500µM。

B.3试验设计

见A.4章。

以下是用HepaRG培养的人源肝脏类器官的质控结果：

a.ALB阳性率：98%、HNF4A阳性率：95%；

b.白蛋白分泌：1000ng/（106细胞/24h）;

c.药物代谢酶功能，内在清除率：280µL/(106细胞/h)

B.4试验方法

见A.5-A.6章。

B.5测定指标及设备

测定指标见第10章。

本试验中检测用到的主要仪器是：高内涵图像采集分析工作站，T7820。使用OperattaHigh-

ContentImagingSystem获取细胞球图像，harmonysoftware分析数据。

B.6检测结果

B.6.1S药物对人源肝脏类器官活性的影响

通过用CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒检测不同浓度的S药物和ASP（阴性对照）对人

源肝脏类器官的影响，结果如图B.1所示，随着S药物浓度逐渐升高，细胞活力逐渐下降。S药物的IC50

值为2.615μM。

150S药物

)120

%

(

y

t

i

s90

n

e

t

n

i

A60

D

F

M

C30

0

101001000

SIR-00006061BConc.(µM)

图B.1利用CellTiter-Glo发光细胞活力分析方法，分析不同浓度S药物对人源肝脏类器官的的细胞活力。

B.6.2S药物对人源肝脏类器官生化指标的影响

通过用ALT和AST检测试剂盒检测不同浓度的S药物对人源肝脏类器官生化指标的影响，结果如图

B.2所示，随着S药物浓度逐渐升高，ALT和AST释放量显着增加。

16

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TransformofALTTransformofAST

400

150210500

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