JJF(吉) 118-2023 荧光定量PCR仪校准规范

JJF(吉)118—2023吉林省市场监督管理厅发布荧光定量PCR仪校准规范I （II） （1） （1） （1） （3） （4） （5） （5） （12） （12） （13） （16） （17） （20）和JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》共同构成支撑本校准规范制定工作的基础1173-2010《聚合酶链反应分析仪》、GB/T42753-1荧光定量PCR仪校准规范于聚合酶链式反应原理定量或定性分析靶核GB/T42753-2022实时荧光定量PCR仪性能评凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其3.1聚合酶链反应polymerasec基于聚合酶链式反应原理，通过温度变化循环程序进行靶核酸仪器孔位平均温度达到设定值(偏差±0.5℃以内）且保持该温度的一段时间。[GB/T3.5温度示值误差temperatureindic23.6温度均匀度temperatur仪器恒温阶段屮，各孔位之间的温度一致性。[GB/3.7温度波动度temperatu仪器恒温阶段屮，孔位的温度变化幅度。[GB/3.8温度最大过冲量temperaturemaxim均热块温度升高或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出（高于或低于）设定3.9平均升温速率mean3.10平均降温速率meanc3.12荧光强度精密度precisionoffluorescenceintensity对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度检测每个PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环次数。[GB/T42753-20均热块不同测量孔在同一荧光条件下，阈值3.15熔解温度melttemperatu3.19通道峰值强度一致性channelpeakheightconsistenc33.20线性灵敏系数linearsensitivityfactor,LSF3.21熔解温度比ratioofmelttemperature,RTm度不均匀直接相关；RTm>1.20：相同产品熔共同导致的；RTm<0.80：相同产品熔解温度不同，差异是与光学、光学检测系统及分析软件直接相关。3.22样本示值误差errorofsample’sindication测得的DNA标准物质浓度对数值与标称浓度的对数值的误差。针与模板基因混合后，完成高温变性、低温复性和适温延伸的热循环对的探针被切断，荧光染料游离于反应体系中，在特定光激发下荧光染环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检品载台、软件控制系统、温度控制模块、荧光检测模块、均热块检测孔组成，详细结构如图477F8432F个6293651一光源2——滤光片3—准直器4—光导束5—样品6—均热块检测孔7一温度传感器8—加热制冷供电9—光开关阵列10—光敏器11—电控装置12—通讯接口13—计算机5计量特性5.1实时荧光定量PCR仪计量性能指标如表1所示。序号备注1温度示值误差温度项目2温度均匀度3温度波动度4567阈值循环数示值误差物理项目8阈值循环数均匀度9阈值循环数精密度熔解温度飘移熔解温度比化学项目注：1、以上所有指标不适用于合格性判别，仅供参考。JJF1527-2015附录A、B中的要求。56.1.1温度15～30）℃;相对湿度：不大于80%；6.1.2其它：符合仪器额定供电电压和频率；电源电压波动不超出±22V，交流频率的变化温度与光学校准装置集成了温度传感器和发射光发生器两部分。其温度测量范围为（0~120）℃,最大允许误差为±0.1℃,采样时间间隔不超过0.5s；发射光发生器的波长范围为校准光学系统项目时，可根据客户要求与实际情况选择光学系统物理校准方法或光学系如图2所示，均热块孔数为其他数量时，可参照图2布点。实时荧等于或大于96孔时，测量点为15个，布点图如图3所示，均将仪器及光学标准器各部件连接完好，在光学标准器下部的温度传6导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。将光学标准器分布于均热块测量孔中。标准物质的准备与配置参照JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》附录A执行。PCR反应体系的配置参照JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》附录B执行。图212个光学标准器位置分布示意图图315个光学标准器位置分布示意图7.2.2校准过程温度项目校准时，典型的校准设置程序如表2步骤4～11所示(其中平均升、降温速率的测量数据分别来源于步骤4～5和步骤5～6;温度示值误差的测量数据来源于步骤5～11;温度均匀度、温度波动度、温度最大过冲量的测量数据来源于步骤5～10)。光学系统采用物理校准方法时，典型的校准设置程序如表2步骤12～16所示(步骤12和步骤13之间设定程序循环32次)。光学系统采用生物化学校准方法时，典型的校准设置程序如表3所示。也可以根据被测实时荧光定量PCR仪说明书或客户要求，参照表2或表3进行设定，并说明具体参数校准时所选取的温度值。步骤设定温度点持续时间(s)备注1预热程序234准程序56789序：在85℃/60℃之间循环32次，扩增变性程序程7112134温度达到设定温度30s后开始记录测量值，记录5s，最少均匀记录5组数据。 n nT——温度示值误差，℃; T Tn——温度传感器数量。温度达到设定温度30s后开始记录测量值，记录5s，最少均匀记录5组数据。=Tmax−Tmin（2） 温度达到设定温度30s后开始记录各点量值，记录60s，最少均匀记录10组Tf=max[(Tjmax−Tjmin)/2]（3）8Tjmax——测量点j温度传感器在m次测量中的最高温度，℃;Tjmin——测量点j温度传感器在m次测量中的最低温度，℃。=TTTTnT−TTah/n（5）ai——50℃温度点第i个采样测量孔的测量值，℃;bi——90℃温度点第i个采样测量仪器从90℃降温至50℃时，平均降温速率的计算按照公式（6）计算：nTT/n（6）9Cti=Ctqi−CtsCtu=Ctqmax−Ctqminnm2m100%100%m−1当DNA循环扩增从最大荧光强度100%减弱到20%时度一致性（CPHC）和线性灵敏系数(LSF)，分别由公式（10）、公式（11）计算：iB−CiiB ALSFi——线性灵敏系数。c)熔解温度漂移和熔解温度比TmiminmaxminTmi——第i个采样测量孔熔解温度漂移，TTRTm——熔解温度比；TTTT cs（14）c——样本示值误差，copies/µL cc——仪器测量平均值，copies/µLs——标准物质标称值，copies/µLn nnCti——系列稀释标准物质的第i个扩增Ct值； lnc——系列稀释标准物质浓度对数a)标题：如“校准证书”；），设定温度点(℃)平均值(℃)实测最高温度(℃)实测最低温度(℃)温度示值误差(℃)不确定度(℃)温度均匀度(℃)Tmax-Tmin温度波动度(℃)三、温度最大过冲量、平均升温速率和平均设定温度点(℃)最低或最高测量值(℃)温度最大过冲量(℃)平均升温速率(℃/s）平均降温速率(℃/s）四、阈值循环数（Ct值）示值误差、均匀度、精密度（光学系统物理项目）TTmiAiiAi-Bii-CiCPHCLSFRTm光学标准器分布位置1U2设定温度点(℃)温度示值误差(℃)温度均匀度(℃)温度波动度(℃)温度最大过冲量(℃)平均升温速率(℃/s）平均降温速率(℃/s）熔解温度漂移(℃)与温度控制模块接触良好。按照仪器说明书或用户要求或推荐使用的温度TiTTa)测量重复性引入的标准不确定度分量u1；b)温度传感器分辨力引入的标准不确定度分量u1；c)温度传感器准确度引入的标准不确定度分量u2。C.4.1重复性测量引入的不确定度分量u1mn(ykj−yj)2spspm(n−1)ykj——第j个测量点第k次的测量值，℃; yj——第j个测量点测量值的平均值，℃;不同测量点温度传感器测量结果(℃)123456789sp=0.0313℃C.4.2温度传感器分辨力引入的不确定度u1'温度传感器的分辨力为0.01℃,分散区间半宽为0.005℃,按均匀分布计算，由于重复测量引入的标准不确定度分量u1大于分辨力引入的标准不确定度C.4.3温度传感器准确度引入的标准不确定度分量u2；温度传感器的最大允许误差±0.1℃,按均匀分布计算，则：C.5合成标准不确定度ucuc 模块中，并确保与温度控制模块接触良好。按照仪器说明书或用户要Cti=Ctqi−Ctsa)测量重复性引入的标准不确定度分量u1；b)光学标准器分辨力引入的标准不确定度分量u1'；c)光学标准器准确度引入的标准不确定度u2；D.4.1重复性测量引入的不确定度分量u1对同一台设备，在相同的测量条件下，使用光学标准器按照推荐123456789仪mn(ykj−yj)2pm(n−1)pm(n−1)ykj——第j个测