生物类似药杂质定性与定量分析方法进展

生物类似药杂质定性与定量分析方法进展演讲人生物类似药杂质定性与定量分析方法进展壹引言贰生物类似药杂质的分类与特性叁杂质定性分析方法进展肆杂质定量分析方法进展伍技术挑战与未来展望陆目录结论柒01生物类似药杂质定性与定量分析方法进展02引言引言生物类似药作为原研生物药的“相似版本”，其研发与上市的核心在于实现与原研药在质量、安全性和有效性上的“高度相似”。然而，生物药分子量大、结构复杂（如单抗通常由两条重链和两条轻链通过二硫键连接，分子量约150kDa），且对生产工艺敏感，极易在表达、纯化、储存等环节产生多种杂质。这些杂质若未被有效控制，可能引发免疫原性反应、降低药效甚至导致严重不良反应。因此，杂质定性与定量分析是生物类似药质量控制的重中之重，也是贯穿研发始终的关键环节。在从事生物类似药质量研究的十余年中，我深刻体会到：杂质分析不仅是实验室中的技术操作，更是连接“工艺设计-质量表征-临床应用”的桥梁。随着分析技术的飞速发展和监管要求的日益严格，杂质分析已从传统的“指标检测”向“过程解析-风险控制-功能关联”的纵深方向演进。本文将结合行业实践，系统梳理生物类似药杂质分类与特性，重点阐述定性与定量分析方法的最新进展，并探讨技术挑战与未来方向，以期为同行提供参考。03生物类似药杂质的分类与特性生物类似药杂质的分类与特性杂质分析的前提是明确“杂质是什么”。根据来源、结构及性质，生物类似药杂质通常可分为三大类，每一类杂质的分析策略均存在显著差异。1产品相关杂质产品相关杂质是生物类似药中最复杂、最具挑战的一类杂质，其产生与药物分子自身的结构异质性和工艺过程直接相关。根据分子层面变化，可进一步细分为：1产品相关杂质1.1结构变体杂质结构变体是指药物分子一级结构、空间构象或翻译后修饰（PTM）发生改变而产生的异构体，是生物类似药“相似性”评价的核心指标之一。-电荷异构体：如天冬酰胺脱酰胺化（Asndeamidation）产生天冬氨酸或异天冬氨酸，导致分子负电荷增加；N端焦谷氨酸化（pyroglutamation）或C端赖氨酸切除（lysineclipping）则改变分子电荷分布。此类杂质通常通过离子交换色谱（IEX）或毛细管等电聚焦（cIEF）分离，其含量直接影响药物与靶点结合的亲和力。-大小变体：包括二聚体、多聚体（由分子间疏水作用或二硫键错配形成）以及片段（如酸/碱水解或蛋白酶切割产生的轻链/重链片段）。体积排阻色谱（SEC）是传统检测方法，但对于高聚体（>1%）的定量，需结合SEC-MALS（多角度激光散射）以准确测定分子量分布。1产品相关杂质1.1结构变体杂质-疏水性变体：如甲硫氨酸氧化（Metoxidation）导致疏水性降低，或色氨酸氧化（Trpoxidation）引入极性基团，此类杂质常用反相色谱（RPC）分离，其保留行为与氧化程度直接相关。1产品相关杂质1.2翻译后修饰（PTM）杂质PTM是生物药区别于化学药的重要特征，也是生物类似药与原研药“相似性”的关键体现。常见的PTM杂质包括：-糖基化修饰：如N-糖链的岩藻糖基化（afucosylation）、唾液酸化（sialylation）或甘露糖基化（mannosylation），影响药物抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）效应。此类杂质需通过肽图分析结合LC-MS/MS鉴定，或使用HILIC（亲水作用色谱）分离后联用质谱。-二硫键错配：如链间二硫键错接（形成重链-轻链错配物）或链内二硫键异构，可能导致分子构象改变。非还原型CE-SDS（毛细管电泳-十二烷基硫酸钠凝胶电泳）是常用检测方法，但对于复杂错配模式，需结合酶解肽图与质谱解析。1产品相关杂质1.2翻译后修饰（PTM）杂质-其他修饰：如糖基化（O-GlcNAc化）、磷酸化、羟基化等，通常含量较低（<0.1%），但对药物稳定性或活性可能产生显著影响，需高灵敏度方法（如PRM-parallelreactionmonitoring）进行精准分析。2工艺相关杂质工艺相关杂质来源于生产过程中的引入，主要包括：-宿主细胞蛋白（HCP）：来自宿主细胞（如CHO、NS0）的蛋白杂质，可能引发免疫原性。其检测依赖于ELISA试剂盒，但试剂盒的覆盖范围（通常针对CHO细胞HCP库约5000种蛋白）和交叉反应性是关键挑战，需结合2D电泳或LC-MS/MS进行补充鉴定。-宿主细胞DNA（HCD）：残留的宿主细胞基因组DNA，具有潜在致瘤性。传统方法为qPCR，但灵敏度受引物设计限制；新型数字PCR（dPCR）可实现绝对定量，且对DNA片段长度适应性更强。-工艺添加剂残留：如吐温80（Tween80，用于减少聚集）、蛋白A（用于亲和层析）、抗生素（如氨苄西林）等。吐温80需通过LC-ELSD（蒸发光散射检测）或LC-MS定量，蛋白A残留则采用ELISA或生物层干涉技术（BLI）检测。2工艺相关杂质-培养基组分相关杂质：如胎牛血清（FBS）中的动物源蛋白，或无血清培养基中的生长因子，需通过特异性抗体或质谱方法进行筛查。3降解产物杂质降解产物杂质是生物药在储存或运输过程中因环境因素（温度、光照、pH）或化学/酶促反应产生的杂质，主要包括：-化学降解：如氧化（Met、Trp、Tyr残基）、水解（肽键断裂、Asn/Gln脱酰胺）、外消旋化（Cys残基）等。此类杂质通常具有结构明确但含量低（ppm级）的特点，需高分辨率质谱（如Orbitrap）结合同位素标记技术进行鉴定。-物理聚集：如可溶性聚集体（直径50-1000nm）或亚可见颗粒（1-100μm），可能引发血管栓塞或免疫反应。除SEC外，微流控电阻脉冲传感（MFI）和流式成像（FlowImaging）技术可更全面表征颗粒分布。-微生物污染：如细菌内毒素（热原）、真菌或支原体，需采用鲎试剂法（LAL）或PCR方法检测，其限度控制直接关系到临床用药安全。04杂质定性分析方法进展杂质定性分析方法进展杂质定性分析的核心是“识别杂质结构”，为工艺优化和质量控制提供依据。随着质谱技术、色谱技术和生物信息学的融合，定性分析已从“已知杂质鉴定”向“未知杂质解析”和“痕量杂质表征”纵深发展。1色谱-质谱联用技术：结构解析的核心工具色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS、GC-MS）凭借高分离能力与高灵敏度的优势，已成为生物类似药杂质定性的“金标准”。1色谱-质谱联用技术：结构解析的核心工具1.1液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的应用LC-HRMS（如Q-TOF、Orbitrap）通过高分辨率（>60,000）和高质量精度（<5ppm），可实现杂质分子量的精准测定，并结合碎片离子解析一级结构。例如，在研究某款阿达木单抗类似药时，我们发现SEC色谱图中保留时间略主峰前的小峰（含量约0.05%），通过OrbitrapMS检测到分子量比主峰缺失115.06Da（对应C5H7NO2，即天冬氨酸残基），结合肽图分析（胰酶酶解后LC-MS/MS鉴定），最终确认该杂质为重链第49-50位天冬氨酸缺失变体。对于糖基化修饰，LC-HRMS可结合酶解（如PNGaseF去除N-糖链）实现糖基化位点和糖型分布的鉴定。例如，通过MALDI-TOFMS分析某曲妥珠单抗类似药的Fc段糖链，发现其岩藻糖基化比例比原研药低3%，这一发现直接推动了工艺中岩藻糖基转移酶（FUT8）敲除工艺的优化。1色谱-质谱联用技术：结构解析的核心工具1.2多维色谱-质谱联用技术对于复杂基质中的痕量杂质（如HCP或降解产物），传统一维色谱分离能力不足，需结合多维色谱技术。例如，SCX-RPC（阳离子交换-反相色谱）二维联用可分离复杂肽段混合物：第一维SCX按肽段电荷分离，第二维RPC按疏水性分离，最终通过LC-MS/MS鉴定肽段序列。我们在某依那西普类似药研究中，采用此方法鉴定出3种含量均低于0.01%的HCP，均来自宿主细胞的热休克蛋白（HSP70），为工艺除杂提供了明确方向。2毛细管电泳-质谱联用技术：电荷异构体的精准解析毛细管电泳（CE）凭借高分辨率（可分离电荷差异仅0.01的异构体）和样品消耗量少（nL级）的优势，在电荷异构体分析中具有独特价值。CE-MS联用可同时实现电荷异构体的分离与结构鉴定。例如，某贝伐珠单抗类似药在cIEF中发现主峰附近存在3个微小杂质峰（总含量<0.1%），通过CE-MS分析，确认分别为N端焦谷氨酸化（+0.02Da电荷偏移）、天冬酰胺脱酰胺化（-0.98Da电荷偏移）以及糖链唾液酸化缺失（-1.02Da电荷偏移），为工艺控制中的酶切（焦谷氨酸酶）和糖基化修饰优化提供了依据。3核磁共振技术：复杂结构的终极确证核磁共振（NMR）是唯一可无需破坏样品即可获取分子三维结构的技术，尤其适用于复杂降解产物或翻译后修饰的解析。例如，某利妥昔单抗类似药在长期稳定性研究中发现一种新的氧化降解产物（含量约0.2%），通过1H-15NHSQCNMR（异核单量子相干谱）定位氧化位点为重链Trp-52，进一步通过NOESY（核Overhauser效应谱）确认氧化产物为N-甲酰犬尿氨酸（N-formylkynurenine），这一结果为处方中抗氧化剂（如甲硫氨酸）的筛选提供了关键数据。尽管NMR灵敏度较低（需μg级样品），但其对复杂结构的解析能力仍是质谱等技术的有力补充。4肽图分析与数据库检索：高通量结构鉴定肽图分析是生物药结构表征的常规方法，通过蛋白酶（如胰酶、Lys-C）酶解药物分子为肽段，再通过LC-MS/MS鉴定肽段序列，从而确认一级结构和PTM位点。随着蛋白质组学数据库的发展（如UniProt、PeptideAtlas），肽图分析已实现高通量鉴定。例如，在某个生物类似药的研发中，我们建立了包含500+肽段的“杂质肽段数据库”，结合靶向MS/PRM（平行反应监测）技术，可在30min内完成对20种常见结构变体（如脱酰胺、氧化、二硫键错配）的筛查，效率较传统方法提升5倍以上。05杂质定量分析方法进展杂质定量分析方法进展杂质定量分析的核心是“准确测定杂质含量”，确保其符合监管要求（如ICHQ6B、FDA/EMA生物类似药指导原则）。随着技术进步，定量分析已从“单一指标检测”向“多组分同步定量”和“生物活性相关定量”发展。1色谱定量技术：常规与高灵敏度方法色谱技术是杂质定量的主力，根据杂质性质可选择不同色谱模式：1色谱定量技术：常规与高灵敏度方法1.1反相色谱（RPC）RPC适用于疏水性杂质（如氧化变体、片段）的定量，通过优化流动相（乙腈/水梯度、离子对试剂）和色谱柱（C4、C8、C18），可实现高分辨率分离。例如，某阿托伐他汀单抗类似药中Met氧化变体的定量，采用RPC-UV（214nm），方法学验证显示线性范围0.01%-0.5%，RSD<2%，准确度98%-102%，满足杂质定量的要求。对于痕量杂质（<0.01%），RPC-MS/MS（MRM模式）可显著提升灵敏度，检测限可达ppb级。1色谱定量技术：常规与高灵敏度方法1.2离子交换色谱（IEX）IEX是电荷异构体定量的首选方法，包括阳离子交换（CEX，分析酸性杂质）和阴离子交换（AEX，分析碱性杂质）。现代UHPLC-IEX（超高效液相色谱离子交换）技术通过小颗粒填料（1.7-2.5μm）和高压系统（>15,000psi），可将分析时间从传统的30-60min缩短至10-15min，且峰容量提升2倍以上。例如，某帕博利珠单抗类似药中酸性杂质（脱酰胺、糖基化缺失）的定量，采用CEX-UPLC，方法精密度（RSD）<1.5%，准确度>95%，且与cIEF结果具有良好的相关性（r>0.99）。1色谱定量技术：常规与高灵敏度方法1.3体积排阻色谱（SEC）SEC用于大小变体（聚集体、片段）的定量，传统SEC存在分析时间长（30-40min）、柱效低等问题，而新型SEC-UPLC通过亚2μm填料和优化流动相（如含150mMNa2SO4的磷酸盐缓冲液），可将分析时间缩短至10min内，且对聚集体和片段的分离度显著提升。对于亚可见颗粒（1-100μm），流式成像技术（如FlowCam）可同步颗粒数量、大小和形态，而微流控电阻脉冲传感（MFI）则可实现>0.5μm颗粒的计数与sizing，为注射剂安全性评价提供全面数据。2免疫学定量技术：高特异性方法免疫学方法基于抗原-抗体特异性结合，适用于HCP、蛋白A残留等杂质的定量，具有高灵敏度（可达pg/mL）和高特异性。2免疫学定量技术：高特异性方法2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是HCP残留检测的常规方法，通过包被抗-HCP抗体、加样、酶标二抗显色，实现定量。但其局限性在于：不同批次试剂盒的抗体亲和力差异可能导致结果波动；且对于CHO细胞HCP，约10%-20%的蛋白无法被抗体识别（“隐蔽HCP”）。为此，我们团队在研究中采用“多试剂盒交叉验证”策略，结合2D电泳-MS识别隐蔽HCP，建立更全面的HCP质量控制标准。2免疫学定量技术：高特异性方法2.2生物层干涉技术（BLI）BLI是一种label-free的实时检测技术，通过传感器表面的抗体捕获目标物，干涉光信号变化反映结合量，适用于蛋白A、宿主细胞蛋白等残留的快速定量。与传统ELISA相比，BLI无需酶标记，分析时间从4-6h缩短至30min以内，且样品消耗量减少90%（仅需10μL）。例如，在某西妥昔单抗类似药纯化工艺中，我们采用BLI实时监测蛋白A残留，当上样量从10mg/mL增至20mg/mL时，蛋白A残留从50ppm降至5ppm，为工艺放大提供了关键数据。3质谱定量技术：高灵敏度与多组分同步质谱定量技术（如LC-MS/MSMRM、PRM）凭借高灵敏度和特异性，已成为痕量杂质（如降解产物、翻译后修饰）定量的首选方法。3质谱定量技术：高灵敏度与多组分同步3.1多重反应监测（MRM）MRM通过选择母离子→子离子的特定转换，实现目标杂质的精准定量，适用于已知结构的杂质（如氧化、脱酰胺变体）。例如，某英夫利西单抗类似药中Trp氧化变体的定量，采用胰酶酶解后LC-MS/MSMRM，监测母离子m/z655.3（氧化肽段）→子离子m/z689.3（b7离子），检测限（LOD）达0.005%，定量限（LOQ）为0.01%，方法精密度（RSD）<5%，较传统UV灵敏度提升100倍以上。3质谱定量技术：高灵敏度与多组分同步3.2平行反应监测（PRM）PRM是高分辨质谱（如Orbitrap）的定量模式，可同时监测所有母离子的碎片离子，适用于未知杂质或复杂基质的定量。与MRM相比，PRM无需优化碰撞能量，且通过高分辨率（>70,000）消除基质干扰，定量准确性更高。例如，在某阿柏西普类似药长期稳定性研究中，我们采用PRM定量3种新型降解产物（均为未知结构），通过同位素稀释法校正回收率，最终确定其含量随时间的变化规律，为货架期预测提供了依据。4生物活性定量技术：功能相关的质量控制传统定量方法仅检测“含量”，但杂质可能通过改变药物分子构象影响生物活性（如ADCC、CDC效应）。因此，生物活性定量技术（如细胞法、表面等离子共振SPR）成为杂质分析的重要补充。4生物活性定量技术：功能相关的质量控制4.1细胞活性测定细胞法直接反映杂质对药效的影响，如ADCC活性测定（通过效应细胞NK细胞与靶细胞共培养，检测LDH释放）、FcγR结合实验（SPR或BLI测定抗体与FcγRIIIa的结合力）。例如，某奥法木单抗类似药中岩藻糖基化降低（5%vs原研药8%），通过ADCC细胞法检测，其活性比原研药高15%，与岩藻糖基化比例降低导致的ADCC增强效应一致，验证了工艺优化的有效性。4生物活性定量技术：功能相关的质量控制4.2表面等离子共振（SPR）SPR通过检测生物分子结合过程中的折射率变化，实现实时、无标记的亲和力测定，适用于杂质与靶点结合能力的评价。例如，某贝伐珠单抗类似药中一种酸性杂质（脱酰胺化，含量0.3%），通过SPR测定其与VEGF的结合力（KD=1.2nMvs主峰1.0nM），虽然结合力略有下降，但仍在可接受范围内，无需进一步工艺调整。06技术挑战与未来展望技术挑战与未来展望尽管生物类似药杂质分析技术已取得显著进展，但在实际应用中仍面临诸多挑战，同时新兴技术的涌现也为领域发展带来新的机遇。1现存技术挑战1.1复杂基质中痕量杂质检测的灵敏度与特异性生物类似药样品基质复杂（如含有大量蛋白、盐、辅料），痕量杂质（<0.01%）易被基质干扰，导致假阳性或定量不准确。例如，HCP检测中，低丰度HCP（<10ppm）可能因抗体亲和力不足而漏检；降解产物中，氧化变体可能与主峰共流出，影响定量结果。1现存技术挑战1.2新型杂质的快速识别与表征随着生产工艺的创新（如连续生产、无细胞表达系统），新型杂质（如mRNA疫苗中的uncappedRNA、细胞治疗产品中的外源病毒载体）不断出现，其结构未知且缺乏对照品，传统分析方法难以快速鉴定。1现存技术挑战1.3方法转移与标准化的难度不同实验室间的分析方法（如HPLC色谱条件、MS参数）存在差异，导致结果可比性差。例如，同一生物类似药在不同CRO公司的HCP检测结果可能偏差达20%，给全球多中心临床试验的质量控制带来挑战。1现存技术挑战1.4生物活性相关性的缺乏传统定量方法仅关注“含量”，但某些杂质含量虽低（如0.01%），若其免疫原性或活性影响显著，可能对患者安全构成风险。如何建立“含量-结构-活性-毒性”的相关性模型，是杂质分析亟待解决的问题。2未来发展方向2.1人工智能与大数据辅助方法开发人工智能（AI）可通过机器学习算法优化色谱条件（如流动相梯度、色谱柱选择），预测杂质保留行为，减少方法开发时间。例如，某公司开发的“AI-MS平台”通过分析10万+肽段的质谱数据，可在1h内完成肽图方法的优化，较传统方法（1-2周）效率提升100倍。此外，大数据技术可整合多批次数据，建立杂质产生与工艺参数的关联模型，实现“过程分析技术（PAT）”驱动的杂质控制。2未来发展方向2.2微流控与单细胞分析技术微流控芯片（如“芯片实验室”）可整合样品前处