流感病毒细胞分离培养

流感病毒细胞

分离培养PPT汇

报

人：XXXX2025年12月16日流感病毒生物学特性MDCK细胞分离标

准操作引言与技术背景细胞分离培养基础CONTENTS目

录02040103新型悬浮细胞分离技术质量控制与生物安全病毒鉴定与滴度测定应用前景与技术挑战CONTENTS目

录0507060801引言与技术背景流感的疾病负担与传播特点流感是至今尚无法完全控制的病毒性急性呼吸道传染病，具有高度传染性，传播速度快，抗原变

异性强，尤其甲型流感变异显著,可引发季节性

流行甚至全球大流行，对人群健康造成严重威胁。为疫苗研发与疫情防控提供支撑流感监测的主要目的是及时发现有意义的流感病

毒新变种，用于诊断试剂制备、疫苗生产及疫情预报。病毒分离培养技术为疫苗株的筛选和制备、

抗病毒药物研发以及病毒抗原检测等提供了重要

的实验材料和技术支持。病毒分离是病原检测的金标准病毒分离是诊断病毒性疾病最常用且高度敏感的方法之一，分离出的病毒可长期保存，用于抗原

性、基因特性或药物敏感性等分析，在流感诊断

中具有不可替代的地位，是及时发现新变种(尤

其大流行株)的关键。我国流感监测的国际关注度我国是流感的多发地，中国的流感动态受到世界

各国的关注。流感是国际上第一个实现全球监测

的传染病，我国实验室采用的流感病毒分离方法

(

如MDCK细胞分离和鸡胚分离)为全球流感防控

贡献数据与力量。流感病毒的公共卫生意义流感诊断的核心方法病毒分离是流感诊断最常用和最

可靠的方法之一，尤其在流感监测中，对于及时发现有意义的流

感病毒新变种(尤其是大流行株)

具有不可替代的作用，可用于诊

断试剂制备、疫苗生产及疫情预

报。其他方法无法完全替代在流感诊断中，任何方法都不能完全替代病毒分离这一方法。尽

管有其他检测技术的发展，但病

毒分离在病毒抗原性、基因特性

及药物敏感性等分析方面具有独

特优势，是流感病毒分离的金标准。高度敏感的病原检测手段分离病毒是诊断病毒性疾病高度

敏感的方法之一，能从临床标本

中获取活体病毒，为后续的免疫学、基因分析或电子显微镜鉴定确诊提供基础，且分离出的病毒

可长期保存用于深入研究。病毒分离培养的金标准地位01传统鸡胚培养技术的奠基早期流感病毒分离主要依赖鸡胚培养，利用9-11日龄鸡胚的羊膜腔和

尿囊腔进行病毒增殖，具有操作简单、病毒滴度高等优点，但存在传

代细胞含致癌因子、不适用于疫苗生产等局限，且对“0”相毒株敏感

性较低。02MDCK细胞培养技术的兴起随着技术发展，

MDCK

(狗肾细胞)成为分离流感病毒的常用细胞系，

其分离阳性率高、应急性强且经济方便。通过在维持液中添加TPCK处

理胰酶等关键试剂，可提高病毒复制能力，但该细胞属肿瘤细胞系，

分离的病毒不能用于疫苗生产。03悬浮细胞培养技术的突破为进一步提升分离效率，悬浮细胞法应运而生，如susMDCK细胞株。该

方法通过增加病毒与细胞接触面积，简化操作步骤(无需胰酶消化和

洗涤吸附),可提高H3N2等亚型流感病毒的分离率及血凝滴度，需专

用摇床等硬件支持。04多方法协同应用的现状目前实验室普遍采用鸡胚和MDCK细胞两种方法协同分离病毒，同时积

极探索悬浮细胞法等新技术。传统方法与现代技术结合，旨在平衡分

离效率、生物安全性及成本，以应对流感病毒变异及监测需求。细胞分离培养技术的发展历程02流感病毒生物学特性病毒结构与关键蛋白功能核心结构与基因组特点病毒核心包含单股负链RNA基因组，分为8个节

段，编码10种蛋白。基质蛋白(M1)

位于包膜

内侧，维持病毒结构稳定并参与病毒组装。包膜糖蛋白及其作用包膜上镶嵌血凝素(HA)

和神经氨酸酶(NA)

两种糖蛋白刺突。HA可与宿主细胞表面唾液酸

受体结合，介导病毒吸附与入侵；NA能水解唾液酸，促进子代病毒释放。抗原性变异与病毒特性HA和NA的抗原性易发生变异，是病毒逃避宿主

免疫系统攻击的关键，也是流感疫苗需要定期更新的重要原因。病毒颗粒形态特征流感病毒颗粒呈球形或丝状，直径约80-120纳

米，由包膜、基质蛋白

(M1)

及核心(包含基

因组)组成。细胞病变特征

(CPE)

表现MDCK细胞感染流感病毒后，典型病变为细胞肿胀圆化、

间隙增大呈网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分

或全部脱落。每日需在显微镜下观察CPE,75%～100%细胞病变时即可收获病毒。细胞受体特异性与宿主范围病毒HA蛋白与宿主细胞表面特异性唾液酸受体结合，决定其宿主范围和组织嗜性。不同动物流感病毒间存在种

间屏障，如人流感病毒主要识别α-2,6-糖苷键受体，禽流感病毒则偏好α-2,3-糖苷键受体。流感病毒复制周期阶段流感病毒复制周期包括吸附与入侵、复制、组装、释放

四个阶段。病毒通过HA蛋白与宿主细胞表面唾液酸受体

结合，经内吞作用入侵；在宿主细胞内完成基因组复制

与病毒颗粒组装后，通过细胞裂解或胞吐作用释放子代

病

毒

。宿主细胞类型选择依据流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，实验室常用MDCK(犬肾细胞)、A549

(人肺癌细胞)和Vero

(非洲绿猴

肾细胞)等。

MDCK细胞因对流感病毒敏感性高，是分离

培养的首选细胞系。病毒复制周期与细胞嗜性02040301传统培养方法的敏感性差异传统MDCK细胞分离培养法对H3N2亚型流感病毒的分离率不及HIN1及Bv

、By亚型，毒株血凝滴度也相对

较低：鸡胚培养法对目前H3N2亚型流感病毒则不敏

感。抗原变异的核心特征流感病毒抗原性易发生变异，尤其是甲型流感病毒

的血凝素

(HA)

和神经氨酸酶

(NA),

其变异可导

致病毒逃避宿主免疫系统攻击，是流感流行和大流

行的重要原因。"0"相毒株培养的特殊难题"0"相毒株在鸡胚中生长特性较差，需要连续传代多

次才能适应鸡胚培养，盲传后HA滴度仍可能为阴性，

增加了分离培养的难度和周期。培养条件对变异株的影响细胞代数增加会导致MDCK细胞对病毒敏感性下降；

不同培养方法(如鸡胚与细胞培养)分离的病毒抗

原性状可能存在差异，影响后续研究和应用。抗原变异性与培养挑战03细胞分离培养基础细胞分离基本原理利用MDCK等易感细胞系的增殖特性，使流感病毒在细

胞内复制，通过观察细胞病变效应

(CPE)及后续鉴

定实现病毒分离。病毒表面血凝素

(HA)

与细胞表面

受体结合，在适宜培养条件下完成吸附、侵入、复制

和释放过程。悬浮细胞分离原理采用susMDCK悬浮细胞株，通过无血清M-SUS培养液支

持细胞高密度扩增，病毒接种无需洗涤和吸附步骤，

直接加入待检标本与TPCK-胰酶，在摇床培养条件下

利用增加的病毒吸附表面积提高分离效率。细胞分离技术核心优势病毒分离阳性率高，尤其对“0”相毒株敏感性优于

鸡胚；应急性强，操作相对简便经济；可减少宿主蛋

白成分，分离的病毒抗原性状更接近自然流行株，为

疫苗研发和药物敏感性分析提供优质毒株。传统MDCK细胞分离原理选用75-90%成片生长的MDCK细胞，经Hank's

液清洗后

接种临床标本，35℃、5%CO₂培养箱吸附1-2小时，加

入含TPCK-胰酶的病毒生长液培养，通过观察细胞肿

胀圆化、间隙增大、脱落等CPE判断病毒增殖。细胞分离原理与技术优势Vero细胞系(非洲绿猴肾细胞)常用的哺乳动物细胞系，贴壁生长，对多种病毒敏感。在流感病毒研

究中也有应用，可用于病毒分离和培养，但其对流感病毒的敏感性可

能稍低于MDCK细胞。该细胞系来源稳定，常用于疫苗生产相关的研究，

但同样需注意其生物安全性。susMDCK细胞系(悬浮MDCK细胞)由传统贴壁MDCK细胞驯化而来的悬浮细胞系。与传统MDCK细胞相比，

悬浮生长使其与病毒接触面积增大，提高了病毒吸附和感染效率。培

养过程无需胰酶消化，标本接种步骤简化，可直接加入待检标本，便

于监测病毒滴度，理论上能提高流感病毒分离阳性率和血凝滴度。MDCK细胞系(犬肾细胞)最常用的流感病毒分离细胞系，属贴壁肿瘤细胞系。其表面存在流感

病毒特异性受体，对流感病毒敏感性高，能支持多种亚型流感病毒的

复制，可观察到典型的细胞病变效应(CPE),如细胞肿胀圆化、间隙

增大、固缩脱落。但因是传代肿瘤细胞系，分离的病毒不宜用于疫苗

生

产

。A549细胞系(人肺癌细胞)人源贴壁细胞系，可模拟人体呼吸道上皮细胞环境，用于研究流感病

毒与人类宿主细胞的相互作用。对流感病毒有一定的敏感性，能支持

病毒复制，但其分离效率可能不如MDCK细胞，更多应用于病毒感染机

制等基础研究。常用细胞系特性对比01020304核心设备与耗材要求MDCK细胞培养专用耗材需75-90%成片的MDCK细胞(如T-25培养瓶或细胞管)、

无菌移液管(1mL/10mL)

、15mL无菌离心管，以及细

胞冻存管(用于细胞株保存)。标本处理与接种工具临床标本需置于2mL

Wheaton小瓶，配备鸡蛋开孔器、

无菌注射器(用于鸡胚接种)、照卵灯(鸡胚定位)、

70-75%酒精(表面消毒)及无菌胶布/蜡(封孔用)。细胞培养核心设备包括35-37℃、5%CO₂培养箱(控制细胞生长环境)、

40倍光学倒置显微镜(观察细胞病变)、生物安全柜

(无菌操作平台)、1000-3000rpm离心机(标本及收

获液离心处理)。关键试剂与培养基基础试剂包括D-MEM培养基、1MHEPES缓冲液、TPCK

处理胰酶(终浓度2μg/mL)

、7.5%牛血清白蛋白组分

V

、10,000U/mL

青链霉素母液，均需在有效期内使用。04MDCK细胞分离标准操作病毒生长液配制在500mlD-MEM液中加入5ml

青链霉素母液(终浓度100U/mL青霉素、100μg/mL链

霉素)、12.5ml7.5%牛血清

白蛋白组分V

(终浓度0.25%)

、12.5ml1MHEPES缓冲

液(终浓度25mM),

再加入

7.5%NaHCO310-15mL调节pH

至7.4-7.6,最后每500mL加

入0.5mLTPCK-胰酶母液(2mg/mL)

使终浓度达

2μg/mL。主要试剂与耗材包括TPCK处理胰酶(如SigmaT-8642)

、1MHEPES缓冲液、

D-MEM培养基

(GIBCO11965-

092)、青链霉素母液(10,000U/ml青霉素G,10,000μg/ml

硫酸链霉素)、

7.5%牛血清白蛋白组分V溶液，以及1ml和10ml无菌滴管、2ml

Wheaton小瓶盛放的临床样品。试剂管理要点严格检查所有试剂有效期，确保在有效期内使用；配制好的病毒生长液需现用现配，或按规定条件保存，避免反

复冻融影响活性。细胞与培养容器选用75-90%成片的MDCK细胞，

根据样本量选择T-25

培养瓶或组织培养管，确保细胞处

于对数生长期。实验材料与试剂准备基础培养基选择与添加物选用D-MEM培养基(如GIBCOBRL

Cat.#11965-092)作为基础，每500ml中加入青、链霉素母液

5ml

(终浓度100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)、7.5%牛血清

白蛋白组分V

12.5mL(终浓度0.25%)及1MHEPES缓冲液12.5mL

(终浓度25mM),调节pH至7.4-7.6。试剂有效期与配制要求严格检查所有试剂有效期，HEPES缓冲液、胰酶等需按规定

条件储存；配制过程全程无菌操

作

，NaHCO3调节终浓度至2-3%以

维持培养体系pH稳定，配好的病

毒生长液应在2-8℃短期保存并

尽快使用。病毒生长液关键成分在上述细胞维持液基础上，每

500mL添加TPCK处理胰酶(如

Sigma

Cat.#T-8642或SIGMAT8802)0.5mL

(母液浓度2mg/mL),使终浓度达2μg/mL,

以促进流感病毒HAO裂解为HA1+HA2,

增强病毒复制能力。培养基与病毒生长液配置吸附后清洗与营养液添加吸附结束后，用6mL

Hank's

液清洗细胞，去除未吸附的

标本残留物，加入5mL含2μg/mLTPCK-胰酶的病毒生

长液。接种前细胞清洗操作轻轻倒出MDCK细胞生长液，

用10mL无菌移液管吸取6mL

pH7.4-7.6

的Hank's

液清洗

细胞3遍，以去除残留血清

及杂质。临床标本接种方法用无菌移液管吸取500

μL处

理后的临床样品，均匀铺于

细胞培养瓶底，温和摇动使

标本与细胞充分接触。病毒吸附条件控制将接种后的细胞培养瓶置于

35℃

、5%CO₂培养箱中吸附

1～2h,

确保病毒颗粒有效

结合宿主细胞受体。标本接种与吸附流程观察工具与操作规范使用40倍光学显微镜观察细胞生长状

态及病变情况，操作时需严格遵守生

物安全规定，在相应生物安全级别的

实验室中进行。病变程度判断标准当75%～100%细胞出现上述典型病

变特征时，即可判定为明显病变并进

行收获；即使无明显细胞病变，培养

至第7天也应进行收获并检测。细胞病变特征表现流感病毒感染MDCK细胞后，典型病变特征为细胞肿胀圆化，细胞间隙增大

呈网状，细胞核固缩或破裂，严重时

细胞部分或全部脱落。日常观察频率与时间将接种病毒后的细胞培养物放置于35℃5%CO₂培养箱培养，每日需在显

微镜下观察细胞病变情况，直至第7

天无论是否出现病变均进行收获。细胞病变观察与判断标准病毒收获与冻融处理05新型悬浮细胞分离技术病毒吸附能力提升悬浮状态增加了病毒与细胞的吸

附表面积，提高了病毒吸附能力，

理论上能提高流感病毒分离阳性

率，尤其对H3N2亚型等传统方法

敏感性较低的毒株效果显著。培养操作简化传代只需稀释无需胰酶消化，标

本接种无需繁琐的洗涤和吸附步

骤，可直接向细胞培养液中添加TPCK胰酶和标本进行病毒分离，

方便快捷。悬浮生长特性与贴壁MDCK细胞不同，susMDCK

细胞可在无血清的M-SUS培养液

中悬浮生长，摇床培养条件下细

胞计数可达(7~12)×10~6cell/mL。病毒滴度高效获取使用专用无血清M-SUS培养液支

持细胞高密度扩增，可获得高效

价病毒，且便于随时吸取上清进

行血凝试验监测滴度。susMDCK细胞特性与优势细胞来源与驯化背景susMIDCK细胞株是由传统贴壁MDCK细胞”驯化"而来的悬浮细胞

株，专为流感病毒分离培养优化。病毒接种与培养选择传代培养3~4天、计数达(7~12)

×10⁶cell/mL

的细胞，用新鲜M-SUS培养液稀释至(3.0~3.5)×10⁶cell/mL,加入适量TPCK胰酶和三抗后，直接加入待检标本，于37℃、

5%CO₂、摇床转速220rpm条件下培养。细胞复苏与初始培养自液氮罐取出susMDCK细胞株，迅速

37℃水浴解冻，1000rpm离心5min,沉淀用1mL新鲜M-SUS培养液重悬后转

移至含50mL新鲜M-SUS培养液的250mL

锥形瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱

摇床上，转速120～130rpm。细胞传代培养震荡培养3~4天，细胞计数达(7~12)

×10⁶cell/mL

时，用新鲜M-SUS培养液将细胞稀释至(0.81.2)×10⁶cell/mL,

相同培养条件下继续

培

养

。病毒收获与监测培养期间可随时吸取上清进行血凝试

验监测滴度，待病毒滴度达到要求或

培养至适宜天数后收获病毒液，用于

后续鉴定或相关实验。悬浮培养操作流程MDCK细胞培养法vs

鸡胚培养法：阳性率MDCK细胞培养法在流感病毒分离中通常表现出更高的阳性率，尤其对于某些

亚型或“0”相毒株，其敏感性优于鸡胚培养法。MDCK细胞培养法vs

鸡胚培养法：操作便捷性MDCK细胞培养法操作相对简便，无需繁琐的鸡胚准备和接种过程，且结果判断可通过观察细胞病变

(CPE