LC-MSMS测定普仑司特中有关基因毒性杂质

LC-MS/MS测定普仑司特中有关基因毒性杂质摘要：建立了一种新型液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量测定普仑司特药物中三种潜在的遗传毒性杂质（杂质2、杂质3和杂质4）。色谱条件：将普仑司特药物溶解在甲醇中，采用色谱柱AgilentPoroshell120EC-C18(4.6mm×100mm，2.7μm）对普仑司特进行LC-MS/MS分析，并将0.02mol/L乙酸铵水溶液用作缓冲液，使用缓冲液-乙腈（A：B=55：45）作为流动相进行等度洗脱，流速设为0.4mL/min，并在260nm处监测洗脱，色谱柱温度设定为25°C，进样量设定为10μL。质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，鞘气温度保持在250°C，喷嘴电压设定为500V，离子源雾化器压力设定为35pis，干燥气温度保持在300°C，离子对m/z168.99→127（杂质2），m/z213.99→172、m/z213.99→142（杂质3）由负离子多反应监测模式（MRM）进行监测，离子对m/z152.01→110.1、m/z152.01→43.1（杂质4）由正离子多反应监测模式（MRM）进行监测。关键词：LC-MS/MS；普仑司特；基因毒性杂质；5-氯-2-羟基苯乙酮；5-氯-2-羟基-3-硝基苯乙酮；2-羟基-3-氨基苯乙酮DeterminationofrelatedgenotoxicimpuritiesinpranlukastbyLC-MS/MSAbstract:AnewtypeofLC-MS/MSmethodwaspresentedforthequantitativedeterminationofthreepotentialgenotoxicimpurities(impurity2,impurity3andimpurity4)inpranlukast.Thechromatographicconditionswereasfollows:dissolvethepranlukastdruginmethanol,andusetheAgilentPoroshell120EC-C18(4.6mm×100mm,2.7μm)columntoperformLC-MS/MSanalysisofpranlukas,thenanaqueoussolutionof0.02mol/Lammoniumacetatewasusedasabuffer,andbuffer-acetonitrile(55:45)wasusedasthemobilephaseforisocraticelution,flowrateas0.4mL/min,andsetthedetectionwavelengthas260nm,columntemperatureas25°C,andtheinjectionvolumeas10μL.Massspectrometryconditions:usingelectrosprayionsource(ESI),thesheathgastemperatureismaintainedat250°C,thenozzlevoltageissetto500V,theionsourceatomizerpressureissetto35pis,thedryinggastemperatureiskeptat300°C,andinthenegativeionmultiplereactionmonitoringmode(MRM),monitortheionpairofm/z168.99→127forimpurity2,m/z213.99→172m/z213.99→142forimpurity3,andinthepositiveionmultiplereactionmonitoringmode(MRM),monitortheionpairofm/z152.01→110.1m/z152.01→43.1forimpurity4.Keywords:LC-MS/MS;pranlukast;genotoxicimpurity;5-chloro-2-hydroxyacetophenone;5-chloro-2-hydroxy-3-nitroacetophenone;2-hydroxy-3-aminoacetophenone1简介基因毒性杂质（genotoxicimpurity，GTI）在浓度很低的时候就可能对人体遗传物质造成损伤，可能存在隐藏的致癌性和诱变性[1]。潜在的遗传毒性杂质（Potentialgenotoxicimpurities，PGI）是指具有与遗传毒性杂质相关的结构警报的杂质。制药行业和监管机构都意识到了PGI在人体健康中的重要性，遗传毒性杂质的研究也成为了各个领域的难题与挑战，目前国内外已经发表了数篇关于利用LC-MS/MS联用仪检测分析药物中的PGIs的相关文献[2-7]。这些潜在存在的遗传毒性杂质引起了监管机构的关注，在过去几年，欧洲药品管理局（EMEA）、美国医药研究与制造商协会(PhRMA)以及美国食品药品管理局（FDA）相继发布了一系列的相关指南，这些指南建议药物制剂的毒理学关注阈值(thresholdoftoxicologicalconcern，TTC)为1.5μg/d，其被认为与可接受的风险相关，以此来评价药物的安全性[8]，而PGI的允许极限是根据药物的最大每日剂量（MDD）设置的[9]。普仑司特(Pranlukast，1）结构式如图1，商品名为Onon，由日本小野公司开发。1995年，该药以胶囊剂在日本首次上市，1996年，相继在美国和欧洲完成了注册[10]。该物质是一种半胱氨酰白三烯（Cys-LT)受体拮抗剂，可以抑制支气管痉挛和微血管渗漏，临床上主要用于预防、治疗支气管哮喘以及过敏性疾病，具有优秀的药效特性和临床治疗表现，毒性低且副作用小，尤其适合无法使用激素治疗的患者[11]，是一种新型的支气管哮喘口服治疗药物。图11的结构图Fig.1Chemicalstructureof12-羟基-3-氨基苯乙酮（4）为1合成中的重要起始原料，因为4无法稳定存在，所以将其制成盐酸盐的形式保存（5），化合物5的合成路线如图2，在5的生产过程中会生成5-氯-2-羟基苯乙酮（2）和5-氯-2-羟基-3-硝基苯乙酮（3）[12]。化合物2中含有PGI警示结构卤代苯，化合物3中含有PGI警示结构硝基取代芳香化合物，化合物4中含有PGI警示结构一级芳胺[13]，这些警示结构都具有潜在的遗传毒性，需要严格控制其在药品的含量。以1的日服用量225mg计算，杂质2、杂质3以及杂质4的限度为6.666μg/g，采用普通的高效液相色谱法测定药物中的PGIs很难达到限度要求。1尚未被各国药典收录，关于1的研究文献主要涉及其合成工艺及优化[14-15]或药代动力学[16-17]的定性定量研究，未见到1中杂质2、杂质3以及杂质4的分析方法的相关报道。图22-羟基-3-氨基苯乙酮盐酸盐合成路线图Fig.2Graphicalsyntheticrouteof2-hydroxy-3-aminoacetophenone三重四级杆液质联用仪（Triplequadrupolemassspectrometry）在四级杆定量能力强的基础上联合了色谱庞大的分离性能与质谱优异的定性功能，化合物结构的相关信息可以通过多级碎裂获得，由于其同时具备高特异性和高灵敏度的特点，目前已经在药品、环境、食品等领域广泛应用[18-20]。本文基于高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术，研究建立检测化合物1中三种PGIs的分析方法。该方法简单、快捷并且灵敏度高，可有效测定化合物1中的杂质2、杂质3以及杂质4。2实验部分2.1化学品与试剂2.1.1试剂信息表1试剂信息Table1Reagentinformation试剂名称级别生产厂家甲醇HPLCMerck乙腈HPLCMerck水UP自制乙酸铵HPLCAladdin2.1.2对照品信息表2对照品信息Table2Referencematerialinformation对照品名称生产厂家批号含量5-氯-2-羟基苯乙酮AladdinH182106899.44%5-氯-2-羟基-3-硝基苯乙酮TGAZECKB98.7%2-羟基-3-氨基苯乙酮MacklinC1088420098.68%2.1.3样品信息表3样品信息Table3Sampleinformation样品名称批号生产厂家普仑司特H19J8Y28823源叶生物科技有限公司2.2溶液的制备一级质谱溶液配制：取化合物1，杂质2、杂质3和杂质4的标准品适量，用甲醇配制成浓度约为1mg/mL，超声。对照品溶液：取杂质2、杂质3和杂质4约20mg，精密称定至100mL容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解后，用甲醇定容至刻度线，混匀，配制成0.2mg/mL的标准储备液。移取5mL标准储备液至200mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度线，混匀，配制成5ng/mL的标准中间液，作为对照品溶液。供试品溶液：取化合物1约25mg，精密称定至50mL离心管中，加入25mL甲醇超声溶解，用0.45μm尼龙膜滤膜过滤作为供试品溶液。加标溶液：取化合物1约25mg，精密称定至50mL离心管中，分别加入0.625mL杂质2、杂质3以及杂质4的标准储备液，再加入23.125mL甲醇超声溶解，用0.45μm尼龙膜过滤。2.3仪器仪表LC-MS/MS系统包括一台Agilent1260系列二元泵，一台脱气剂和冷却器，CTCPAL自动进样器包括两个独立控制的阀门驱动器，一个6端口喷射阀和一个10端口切换阀，通过电喷雾离子源（ESI）与LC连接的1260-6470三重四级杆质谱仪（美国Agilent公司）用于定量检测杂质，数据采集和统计分析由MassHunterWorkstation分析软件执行；超声波清洗机（KQ-700E型）；精密分析天平（MettlerToledoXSE205）；力康超纯水仪（HealForceSmart）。2.4色谱条件2.4.1液质色谱条件表4液质色谱条件Table4LiquidchromatographyconditionsLC参数流速0.2mL/min进样量2μL柱温室温流动相时间（min）02超纯水（A）3030乙腈（B）70702.4.2液相色谱条件表5液相色谱条件Table5LiquidchromatographyconditionsLC参数色谱柱AgilentPoroshell120EC-C18(4.6mm×100mm，2.7μm）紫外波长260nm流速0.4mL/min进样量10μL柱温25°C流动相时间（min）0400.02mol/L乙酸铵水溶液（A）5555乙腈（B）45452.5质谱条件2.5.1一级质谱条件离子源：电喷雾离子源(AJSESI)；扫描方式：正负离子扫描；检测方式：全扫描监测（MS2Scan）；扫描范围：50-1000；CAV电压：3V；Fragmentor电压：85V；电喷雾离子源参数设置如表3所示。表6一级质谱电喷雾离子源参数设置Table6Parametersettingsofelectrosprayionsource参数鞘气温度250°C鞘气流速11L/min喷嘴电压500V雾化器压力35pis干燥气温度300°C干燥气流速5L/min毛细管电压3500V2.5.2二级质谱条件离子源：电喷雾离子源(AJSESI)；扫描方式：正负离子扫描；检测方式：Optimizer软件优化；CAV电压：4V；电喷雾离子源参数设置如表6所示。3方法与结果3.1色谱条件的选择3.1.1色谱柱的选择在相近的色谱条件下，考察了AgilentZORBAXSB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)和AgilentPoroshell120EC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm）的分离情况。结果显示在第二种色谱柱上主峰和杂质峰能较好分离，并且三种杂质峰的峰形均较好。采用小粒径的色谱柱，具有更低的流速和更高的样品分析通量，在节约成本的同时，可以与质谱有更高的兼容性，所以本文选择采用AgilentPoroshell120EC-C18色谱柱检测1中的杂质残留。3.1.2流动相的选择0.02mol/L乙酸铵水溶液：乙腈：甲醇=5：5：1；A相为超纯水，B相为乙腈，比例为A：B=3：2；A相为0.02mol/L乙酸铵水溶液，B相为乙腈，比例分别为：A：B=60：40、A：B=50：50、A：B=40：60、A：B=对55：45。对这三种流动相考察了峰的分离情况、峰形、出峰时间、拖尾等，结果显示前两种流动相峰形较差且峰与峰之间的分离度达不到要求，而第三种流动相在改变比例后能使各杂质峰与主峰之间较好分离且峰形较好。故本文选择A相为0.02mol/L的乙酸铵水溶液，B相为乙腈（A：B=55：45）作为实验的流动相组成。3.2杂质出峰时间及位置的确定按照“2.4.2”的条件对制备的对照品溶液以及加标溶液进行检测分析，得到杂质2对照品溶液、杂质3对照品溶液以及杂质4对照品溶液的紫外色谱图和加标溶液的紫外色谱图（见图3）。由图可见，主峰前后有三个杂质峰较为明显（峰1、峰2和峰3），峰1的保留时间为Rt=4.385min，结合杂质3对照品溶液的紫外色谱图可知峰1为杂质3；峰2的保留时间为Rt=5.482min，结合杂质4对照品溶液的紫外色谱图可知峰2为杂质4；峰3的保留时间为Rt=14.517min，结合杂质2对照品溶液的紫外色谱图可知峰3为杂质2，由此确定各个杂质的出峰位置以及出峰时间。T/minT/minUVUVT/minT/minUVUVUVUVUVT/minPeak2Peak1Peak3MainpeakT/minUVT/minPeak2Peak1Peak3MainpeakT/min图3对照品溶液和加标溶液的紫外色谱图Fig.3Ultravioletchromatogramsofreferencesolutionandspikedsolution3.3质谱条件的选择3.3.1扫描方式的确定按照“2.4.1”和“2.5.1”的条件对制备的分析溶液进行检测分析，得到化合物1、杂质2、杂质3以及杂质4的一级谱图。1的分子量为481.5，由图可见正的响应较弱，负的响应明显，有m/z480.2（见图4）。杂质2的分子量为170.59，正的无响应，负的响应较弱，有m/z169.00（见图5）。杂质3的分子量为215.59，正的无响应，负的响应明显，有m/z214(见图6）。杂质4的分子量为151.16，正的响应明显，有m/z152，负的响应较弱（见图7）。一级质谱检测出了所有带电离子的质荷比（m/z）和强度，形成一级谱图，由此确定扫描方式。图4化合物1的全扫描质谱图Fig.4Scanmassspectraofcompound1图5杂质2的全扫描质谱图Fig.5ScanmassspectraofImpurity2图6杂质3的全扫描质谱图Fig.6ScanmassspectraofImpurity3图7杂质4的全扫描质谱图Fig.7ScanmassspectraofImpurity43.3.2优化质谱条件采用电喷雾离子源（AJSESI），在正负离子模式下按照“1.4.2”条件，采用Optimizer软件对杂质2、杂质3以及杂质4进行各离子的Fragmentor和Collisionenergy的优化，得到响应值较高的离子作为定性离子对。得到最佳质谱条件如表7所示。表7杂质2、杂质3和杂质4的质谱条件CompoundQualificationionpairs(m/z)Collisionenergy（V）Fragmentor(V)Impurity2168.99/12716121Impurity3213.99/172,213.99/14216,2492Impurity4152.01/110.1,152.01/43.18,2063Table7Spectrometricparametersofimpurity2、impurity3andimpurity44讨论关于PGIs的分析，通常开发和验证单独的方法。常规技术，例如具有紫外或PDA检测器的高效液相色谱或者具有火焰离子化检测（FID）的GC或GCMS通常不足以在低浓度下对其进行准确测定。当基因毒性杂质的检测要求必须达到低ppm水平，LC-MS/MS由于其优越的灵敏度和特异性而在GTIs痕量分析领域变得非常流行。其具有离子碎片特征性强的特点，可以利用二级质谱(MS2)的特征离子峰，作为杂质准确定性的依据，采用MRM模式可以进行准确定量，并且很大程度上提高检测灵敏度，从定性和定量两个方面的要求来看其均为较理想且可行性较高的检测手段。参考文献谢含仪,林云良,张瑞凌,等.基因毒性杂质分析方法和前处理技术的研究进展[J].药物分析杂志,2018,38(10):1668-1676.李海霞,白培锋,刘娜,等.卡非佐米中基因毒性杂质和吗啉乙酸的LC-MS/MS法测定[J].中国医药工业杂志,2016,47(10):1308-1310.梁键谋,傅聪,陈悦.LC-MS/MS测定草酸右旋西酞普兰中对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质的含量[J].中国现代应用药学,2016,33(11):1436-1440.王珊珊,宁凡盛,王晓利,等.HPLC-MS/MS法分析吉非替尼中痕量基因毒性杂质[J].药物分析杂志,2017,37(07):1309-1313.张云峰,钱建钦,王建.HPLC-MS/MS法分析氟胞嘧啶中痕量基因毒性杂质N,N-二甲基苯胺[J].药物分析杂志,2017,37(02):265-271.liouK,MalenovićA,LoukasYL,etal.AnalysisofpotentialgenotoxicimpuritiesinrabeprazoleactivepharmaceuticalingredientviaLiquidChromatography-tandemMassSpectrometry,followingquality-by-designprinciplesformethoddevelopment[J].JournalofPharmaceutical&BiomedicalAnalysis,2018,149:410-418.VenugopalN,ReddyAVB,ReddyKG,etal.Methoddevelopmentandvalidationstudyforquantitativedeterminationof2-chloromethyl-3,4-dimethoxypyridinehydrochlorideagenotoxicimpurityinpantoprazoleactivepharmaceuticalingredient(API)byLC/MS/MS[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2012,70:592597.阮晓玲,郑项元,徐洁,等.药物中基因毒性杂质分析方法的研究进展[J].中国药科大学学报,2016,47(03):267-274.KroesR,RenwickAG,CheesemanM,etal.Structure-basedthresholdsoftoxicologicalconcern(TTC):Guidanceforapplicationtosubstancespresentatlowlevelsinthediet[J].Food&ChemicalToxicology,2004,42(01):65-83.徐海江,丁茂书,李委潞,等.普仑司特的合成研究[J].天津科技,2016,43(08):33-34.马薇,吕竹芬,陈燕忠.星点设计-效应面法优化普仑司特自微乳给药系统[J].中国新药杂志,201625(10):1153-1159.于欣红,肖繁花,程华艳,等.2-羟基-3-氨基苯乙酮盐酸盐的合成[J].化学世界,2011,52(10):620-622.马磊,马玉楠,陈震,等.遗传毒性杂质的警示结构[J].中国新药杂志,2014,23(18):2016-2111.叶德坤.普仑司特中间体的合成工艺改进[J].上海化工,2018,43(10):30-33.段丽君,杨健,徐坤.普仑司特中间体的合成工艺优化[J].高校化学工程学报,2013,27(05):861-864.MarcheseA,MchughC,KehlerJ,et